盛雨夢， 許 靜， 劉鷖雯， 何怡青， 劉 華， 黃 宜， 胡嘉捷， 崔 練， 高 鋒， 楊翠霞

（1.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院中心實驗室，上海 200233；2.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院檢驗科，上海 200233）

原發(fā)性骨腫瘤發(fā)生于骨骼或周圍血管、神經(jīng)、骨髓等附屬組織，是發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一。初發(fā)骨腫瘤患者主要通過手術(shù)治療，但術(shù)后常會遺留微小病灶，導(dǎo)致腫瘤易復(fù)發(fā)。目前，臨床上主要通過影像學(xué)方法診斷骨腫瘤，尚缺乏特異性的血清學(xué)診斷指標(biāo)，影響了骨腫瘤的早期診斷和預(yù)后評估[1]。透明質(zhì)酸（hyaluronan，HA）是腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分。有研究結(jié)果顯示，HA在多種腫瘤組織中明顯升高，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[2]，但關(guān)于血清HA水平與骨腫瘤疾病進(jìn)展關(guān)系的研究較少。透明質(zhì)酸合成酶（hyaluronan synthetase，HAS）2是合成HA最主要的酶。有研究結(jié)果顯示，HAS2參與了調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），可促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[3]。HA與HAS2無論在功能上還是在促進(jìn)腫瘤發(fā)展方面均有類似的作用，骨腫瘤細(xì)胞中HA和HAS2水平均升高[4]。本研究旨在探討骨腫瘤患者手術(shù)前后血清HA、HAS2水平與骨腫瘤的關(guān)系，為骨腫瘤的臨床診斷及治療監(jiān)測提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2020年7—9月上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院確診的骨腫瘤患者35例（骨腫瘤組），其中男2 0例、女1 5例，年齡（40.21±21.35）歲。35例骨腫瘤患者中，骨肉瘤14例、軟骨肉瘤14例、骨纖維肉瘤4例、骨巨細(xì)胞瘤2例、尤文肉瘤1例；有19例腫瘤＜5 cm，有16例腫瘤＞5 cm；有20例存在骨質(zhì)破壞，有15例無骨質(zhì)破壞。所有患者均經(jīng)病理檢查確診，術(shù)前均未進(jìn)行過放療或化療。選取同期上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院骨感染性炎癥患者40例（骨感染性炎癥組），其中男23例、女17例，年齡（49.15±14.91）歲。40例骨感染性炎癥患者中，骨髓炎17例、創(chuàng)傷后感染12例、植入物感染11例。另選取同期上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院體檢健康者60名作為正常對照組，其中男32名、女28名，年齡（39.17±10.37）歲，血壓、血脂、血糖、肝功能、腎功能等均正常。本研究經(jīng)上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有對象均自愿參加并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 樣本收集 采用分離膠促凝管采集骨感染性炎癥患者、正常對照者和骨腫瘤患者術(shù)前及術(shù)后24 h的靜脈血2 mL，離心分離血清，置于無菌Eppendorf管，保存于-80 ℃冰箱，統(tǒng)一檢測。

1.2.2 血清HA、HAS2水平檢測 采用MAGLUMI X8全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（深圳新產(chǎn)業(yè)公司）及配套試劑檢測HA。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測HAS2，試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，檢測儀器為Epoch酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）。嚴(yán)格按儀器和試劑盒說明書操作。

1.2.3 血清HAS2 mRNA相對表達(dá)量檢測 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測血清HAS2 mRNA的相對表達(dá)量，檢測儀器為QuantStudio 7 Flex實時熒光定量PCR儀（美國ThermoFisher Scientific公司）。采用血液RNA提取試劑盒（日本Takara公司）提取血清總RNA，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara公司）說明書將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA），采用實時熒光定量PCR試劑盒（日本Takara公司）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 5 s，65 ℃34 s，40個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃15 s。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt計算HAS2 mRNA的相對表達(dá)量?；蛐蛄幸姳?。

表1 HAS2與β-actin基因序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以±s表示，治療前、后的比較采用配對t檢驗，不同組之間比較采用兩獨立樣本t檢驗。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析各項指標(biāo)的診斷效能。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨腫瘤組、骨感染性炎癥組及正常對照組血清HA、HAS2水平及HAS2 mRNA相對表達(dá)量的比較

骨腫瘤組術(shù)前、術(shù)后血清HA、HAS2水平明顯高于正常對照組（P＜0.05），骨腫瘤組術(shù)前、術(shù)后血清HAS2水平均明顯高于骨感染性炎癥組（P＜0.05），而血清HA水平與骨感染性炎癥組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。骨腫瘤組術(shù)后血清HA、HAS2水平均低于術(shù)前（P＜0.05）。見表2。

表2 骨腫瘤組、骨感染性炎癥組及正常對照組血清HA和HAS2水平的比較

采用實時熒光定量PCR檢測了22例骨腫瘤患者、22例骨感染性炎癥患者和24名正常對照者血清HAS2 mRNA的相對表達(dá)量，結(jié)果顯示骨腫瘤患者HAS2 mRNA的相對表達(dá)量顯著高于正常對照者和骨感染性炎癥患者，腫瘤病灶切除術(shù)后HAS2 mRNA的相對表達(dá)量顯著降低。見圖1。

圖1 各組血清HAS2 mRNA表達(dá)量比較

2.2 血清HA、HAS2水平及HAS2 mRNA相對表達(dá)量診斷骨腫瘤的效能

建立HA、HAS2及HAS2 mRNA聯(lián)合檢測的Logistic回歸模型。ROC曲線分析結(jié)果顯示，以正常對照組為對照，Logistic回歸方程為Logit（P）=-13.618+0.204×HA+0.033×HAS2+1.014×HAS2 mRNA。HA、HAS2及HAS2 mRNA單項檢測及聯(lián)合檢測模型診斷骨腫瘤的曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.888、0.651、0.747、0.956，敏感性分別為85.7%、40.0%、48.6%、85.7%，特異性分別為80.0%、91.4%、94.2%、91.4%。以骨感染性炎癥組為對照，Logistic回歸方程為Logit（P）=-3.566+0.016×HA+0.026×HAS2+0.282×HAS2 mRNA。HA、HAS2及HAS2 mRNA單項檢測及聯(lián)合檢測模型診斷骨腫瘤的AUC分別為0.485、0.782、0.630、0.789，敏感性分別為25.7%、43.4%、40.0%、80.0%，特異性分別為85.7%、96.7%、82.8%、68.5%。見表3、表4、圖2。

圖2 血清HA、HAS2水平及HAS2 mRNA相對表達(dá)量單項及聯(lián)合檢測診斷骨腫瘤的ROC曲線

表3 以正常對照組為對照時各項指標(biāo)單項檢測及聯(lián)合檢測模型診斷骨腫瘤的效能

表4 以骨感染性炎癥組為對照時各項指標(biāo)單項檢測及聯(lián)合檢測模型診斷骨腫瘤的效能

3 討論

原發(fā)性骨腫瘤約占惡性腫瘤總數(shù)的1%，該病雖然所占比例小，但是治療難度大，預(yù)后極差，易復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移[5]。血清生物標(biāo)志物作為監(jiān)測腫瘤進(jìn)展的敏感方法，在多種腫瘤早期診斷和進(jìn)展監(jiān)測中發(fā)揮著重要作用[6]。既往關(guān)于骨腫瘤進(jìn)展的研究多集中于細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原等標(biāo)志物，缺乏對其他標(biāo)志物的挖掘。為了進(jìn)一步探尋骨腫瘤特有的血清學(xué)標(biāo)志物，本研究同時分析了骨腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)中另一種成分——HA以及HA的合成酶HAS2，以尋找更有效的血清學(xué)標(biāo)志物。

HA與多種腫瘤的進(jìn)展關(guān)系密切[7-8]，是腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，在腫瘤間質(zhì)中呈高表達(dá)[9]。本研究結(jié)果顯示，骨腫瘤組和骨感染性炎癥組血清HA水平明顯高于正常對照組（P＜0.05），而骨腫瘤組與骨感染性炎癥組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），這可能與炎癥患者體內(nèi)的炎性因子誘導(dǎo)HA合成增加有關(guān)[10]。本研究結(jié)果還顯示，骨腫瘤組術(shù)后血清HA水平明顯低于術(shù)前（P＜0.05）。這提示血清HA水平具有監(jiān)測骨腫瘤疾病進(jìn)展的潛在價值。HA主要由HAS合成，HAS有3個異構(gòu)體（HAS1、HAS2、HAS3），其中HAS2是最主要的異構(gòu)體。在軟骨細(xì)胞和骨肉瘤細(xì)胞中，HAS2的表達(dá)量顯著高于HAS1和HAS3[11]。有研究結(jié)果顯示，通過抑制骨腫瘤細(xì)胞中HAS2基因的表達(dá)，可以明顯減少HA的合成[12]。本研究結(jié)果顯示，骨腫瘤組血清HAS2水平明顯高于正常對照組和骨感染性炎癥組（P＜0.05），骨腫瘤組術(shù)后血清HAS2水平低于術(shù)前（P＜0.05），與血清HA水平的變化一致。因此，HA與HAS2聯(lián)合檢測對于骨腫瘤的輔助診斷和療效監(jiān)測具有更大的價值。

近年來，腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體逐漸成為研究熱點之一。通過對外泌體中特異的mRNA進(jìn)行分析，有望找到診斷腫瘤的新型分子標(biāo)志物[13]。本研究對部分骨腫瘤患者血清HAS2 mRNA的表達(dá)量進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示骨腫瘤組血清HAS2 mRNA相對表達(dá)量明顯高于正常對照組和骨感染性炎癥組（P＜0.05），骨腫瘤組術(shù)后HAS2 mRNA相對表達(dá)量低于術(shù)前，提示血清中游離的HAS2 mRNA可能與骨腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，這也為下一步從分子水平上尋找骨腫瘤的特異性標(biāo)志物提供了理論基礎(chǔ)。

本研究還對血清HA、HAS2水平及HAS2 mRNA相對表達(dá)量診斷骨腫瘤的價值進(jìn)行了分析。ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清HA、HAS2水平及HAS2 mRNA相對表達(dá)量在骨腫瘤的診斷中均有一定的價值，3項指標(biāo)聯(lián)合檢測診斷骨腫瘤的效能顯著優(yōu)于單項檢測。

綜上所述，HA、HAS2及HAS2 mRNA在骨腫瘤的診斷和術(shù)后監(jiān)測中均有一定的價值，但本研究的樣本量較小，后續(xù)將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，以驗證本研究得出的結(jié)論。