唐秀英，龍起樟，王會(huì)民，朱雪晶，黃永蘭，蘆 明，萬建林

（江西省超級(jí)水稻研究發(fā)展中心，江西 南昌 330200）

【研究意義】稻米是我國60%以上人口的主食，隨著人們生活水平的不斷提高，具有香味的優(yōu)質(zhì)稻米日漸受到消費(fèi)者的歡迎。香稻是一種具有特殊香味的水稻，其在蒸煮、食用時(shí)清香飄逸，被譽(yù)為“糧中珍品”，如國際上的巴斯馬蒂香米和泰國茉莉香米至今仍享有盛譽(yù)。香味性狀是評價(jià)大米品質(zhì)的重要指標(biāo)，現(xiàn)已成為育種者選育優(yōu)質(zhì)稻米品種的目標(biāo)之一?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】水稻的香味性狀主要由第8染色體上的一對隱性基因控制，該基因含有15個(gè)外顯子和14個(gè)內(nèi)含子，編碼甜菜醛脫氫酶（BADH2）[1]。研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)香稻品種中，BADH2基因的第7外顯子上有8 bp缺失和3 bp差異，或者第2外顯子上有7 bp缺失，導(dǎo)致該基因翻譯提前終止，編碼的BADH2 結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，BADH2 的反應(yīng)底物2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）積累而產(chǎn)生香味[2]。稻米香味性狀除了受BADH2基因主導(dǎo)作用外，還易受到生長環(huán)境條件（產(chǎn)地氣候、種植土壤性質(zhì)、灌溉水種類等）和存儲(chǔ)加工方式的影響，通過傳統(tǒng)的咀嚼法或KOH 法等主要依賴人的感官進(jìn)行鑒定，容易受到育種家的主觀因素影響。因此，傳統(tǒng)的香味鑒定方法費(fèi)時(shí)費(fèi)工、鑒定結(jié)果準(zhǔn)確性差、效率低。分子標(biāo)記輔助選擇是一種有效的水稻育種手段。目前，眾多研究人員通過水稻傳統(tǒng)育種結(jié)合功能分子標(biāo)記輔助選擇成功選育出香稻[3-7]，育種效率較傳統(tǒng)選育高，然而大多數(shù)研究主要圍繞香味基因的第7 外顯子和第2 外顯子處的堿基變異設(shè)計(jì)分子標(biāo)記，多態(tài)性僅有8 bp 或7 bp 差異，須通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離鑒定，操作過程繁瑣不便于開展大量樣本的標(biāo)記檢測?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】近年來，CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)以其獨(dú)特的優(yōu)勢迅速發(fā)展起來，該技術(shù)操作簡單、成本低、效率高，已廣泛應(yīng)用于水稻基因編輯[8-12]。利用CRISPR/Cas9技術(shù)定向編輯水稻BADH2基因成功率高，大大縮短香稻的選育進(jìn)程。邵高能等[13]通過CRISPR/Cas9技術(shù)對水稻中花11的BADH2基因進(jìn)行定點(diǎn)編輯，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在T1代突變材料中，BADH2RNA 水平顯著下調(diào)，籽粒中2-AP 含量顯著增加；T2代香型植株與野生型相比除分蘗數(shù)和結(jié)實(shí)率外，其余各項(xiàng)指標(biāo)無顯著差異。祁永斌等[14]利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對浙江主要推廣的水稻品種嘉58和秀水134進(jìn)行香味基因編輯，利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測糙米米粉中2-AP含量，結(jié)果在T2代基因編輯株系的米粉中2-AP 含量較野生型呈極顯著增加?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)，以適應(yīng)江西種植的粳稻臺(tái)南11 為研究材料，對水稻中BADH2基因進(jìn)行定點(diǎn)敲除，快速培育具有香味的水稻材料，為進(jìn)一步選育適應(yīng)我省種植的優(yōu)質(zhì)香味水稻品種提供理論技術(shù)和材料支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為粳稻臺(tái)南11。所有轉(zhuǎn)基因材料種植于江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣福轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)基地（南昌），常規(guī)田間種植及水肥管理。

1.2 載體構(gòu)建

本試驗(yàn)采用的CRISPR/Cas9 載體為江西省超級(jí)水稻研究發(fā)展中心實(shí)驗(yàn)室自行構(gòu)建，該載體以pCU?bi1390 為基礎(chǔ)[15]，含有水稻密碼子優(yōu)化后的Cas9基因[16]、sgRNA 主體框架[17]、CmR-ccdB表達(dá)盒、潮霉素抗性標(biāo)記、水稻U6 啟動(dòng)子[18]等。利用CRISPR-P（http://cbi.hzau.edu.cn/crispr）[19-20]在線工具，設(shè)計(jì)用于敲除BADH2基因（RAP ID：Os08g0424500）的sgRNA 引導(dǎo)序列，靶點(diǎn)位于基因的第3 外顯子正義鏈上（基因組ORF 位置：1432-1441，mRNA CDS 位置：281-300）。根據(jù)sgRNA 引導(dǎo)序列及載體構(gòu)建要求，分別合成末端4 個(gè)堿基外，其余堿基反向互補(bǔ)的寡脫氧核糖核酸即sgU6-F（cttgACTAGAGACGCTTGATTGT）、sgU6-R（aaacACAATCAAGCGTCTCTAGT）。將2條寡脫氧核糖核酸鏈退火成雙鏈寡核酸，通過酶切、連接和轉(zhuǎn)化把所得的雙鏈寡核酸連接到CRISPR/Cas9載體即pCUbi1390Cas9-U6（圖1）。對單克隆進(jìn)行測序，檢測克隆的正確性及完整性。

圖1 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化雙元載體pCUbi1390Cas9-U6 T-DNA結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of the T-DNA of the binary vectors pCUbi1390Cas9-U6

1.3 水稻遺傳轉(zhuǎn)化

利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織，方法參考Toki等[21]，利用潮霉素快速檢測法對T0代再生苗進(jìn)行T-DNA 插入陽性檢測[22]，采用CTAB 法[23]提取T0代轉(zhuǎn)基因陽性植株苗期葉片DNA，用U6-F（CACCTTTTCCCTTTTTCTTCAGATA）和U6-R（TGGATAACTGGCCACATACCAT）組成的引物對對轉(zhuǎn)化子中的BADH2基因的靶位點(diǎn)進(jìn)行檢測。

1.4 香味物質(zhì)2-AP測定

利用GC/MSD 氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測香味物質(zhì)[24]。采用固相微萃?。⊿PME）技術(shù)收集揮發(fā)物[25]。稱取2 g糙米粉裝入4 mL樣品瓶中，置于SPME專用采樣臺(tái)上90 ℃預(yù)熱30 min，然后用含有65μm PDMS/DVB萃取頭（SPME；Supelco）的SPME 針頭刺穿瓶墊，暴露出SPME 纖維頭吸附頂部空間的揮發(fā)物，90 ℃持續(xù)收集30 min。收回纖維頭后收回針頭，立即在色譜進(jìn)樣口250 ℃、5 min 解吸附，不分流模式進(jìn)樣，進(jìn)樣口內(nèi)置內(nèi)徑0.75 mm 玻璃襯管（SGE Ltd.）。色譜柱為HP-5MS 毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 mm 厚涂層，Agilent），載氣為99.999%氮?dú)?，流?.2 mL/min。色譜升溫程序?yàn)椋?0 ℃保留3 min，以20 ℃/min升溫至230 ℃，230 ℃保留2 min。質(zhì)譜條件為：連接線溫度230 ℃，離子源溫度230 ℃，能量70 eV，檢測器150 ℃。

質(zhì)譜定性分析采用全掃描模式（fullscan）收集信號(hào)，利用NIST 譜庫查詢及其與標(biāo)樣比較的方法確認(rèn)HPL 揮發(fā)產(chǎn)物成分。定量分析采用選擇離子檢測（SIM）模式。選用質(zhì)荷比（m/z）為69，83 和111 的離子碎片對2-乙酰-1-吡咯啉進(jìn)行定量。

1.5 轉(zhuǎn)化子農(nóng)藝性狀分析

對野生型和突變型T3代（去除轉(zhuǎn)基因成分的純合突變株）的株高、有效分蘗數(shù)、每穗總粒數(shù)、結(jié)實(shí)率和千粒質(zhì)量等產(chǎn)量性狀以及蛋白質(zhì)含量、直鏈淀粉含量、整精米率、長寬比和堊白度等品質(zhì)方面進(jìn)行考察分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 BADH2基因突變分析

本研究共獲得33 個(gè)獨(dú)立的T0代轉(zhuǎn)基因植株，對每個(gè)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有16 個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)基因植株發(fā)生了突變，基因突變率為48%。對這16個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)基因植株的PAM 附近處的堿基變異情況進(jìn)行分析，共檢測到4 種突變類型（圖2），其中插入突變1 種，缺失突變3 種。對T0代衍生的T1代進(jìn)行葉片潮霉素抗性篩選，獲得去除轉(zhuǎn)基因成分的T1代植株，對植株中BADH2靶位點(diǎn)進(jìn)行測序，選取純合突變植株，利用T3代進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。目前，4種突變類型均獲得了純合后代。

圖2 BADH2基因突變類型Fig.2 Mutation types of BADH2

2.2 BADH2基因敲除對2-AP含量的影響

利用GC/MSD 氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀對糙米中的2-AP 進(jìn)行檢測。將色譜峰質(zhì)譜圖逐一與NIST 譜庫進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)保留時(shí)間5.5 min 的組分為2-AP。分別對野生型及4 種純合突變后代植株籽粒中的香味物質(zhì)2-AP 進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，4 種突變材料中的2-AP 含量均顯著提高（圖3）。因此，BADH2基因的敲除會(huì)引起水稻籽粒中2-AP 的積累而產(chǎn)生香味。

圖3 野生型及不同突變體中2-AP相對含量Fig.3 Relative content of 2-AP in wile type and mutants

2.3 BADH2基因敲除對水稻農(nóng)藝性狀的影響

為了檢測BADH2基因敲除對水稻產(chǎn)量和品質(zhì)的影響，分別對野生型和4 個(gè)BADH2基因突變體材料（T3代）的產(chǎn)量性狀（表1）及大米品質(zhì)（表2）進(jìn)行了測定。在產(chǎn)量性狀方面，與野生型相比，4 個(gè)突變體材料發(fā)生了如下變化：株高略微下降，其中，TA4 突變體材料的株高下降呈顯著性差異（降幅達(dá)3.4%）；有效分蘗數(shù)均下降，降幅4.6%～11.7%（均值8.0%），4 個(gè)突變體材料與野生型相比均呈顯著性差異；每穗總粒數(shù)和結(jié)實(shí)率在4 個(gè)突變體材料之間表現(xiàn)不一致，除TA2 外，其他突變體材料表現(xiàn)下降。千粒質(zhì)量在野生型和突變體材料間無明顯差異。通過計(jì)算，4 個(gè)突變體材料的理論產(chǎn)量較野生型減產(chǎn)1.9%～17.0%（均值8.7%）。綜上，BADH2基因的敲除引起有效分蘗數(shù)的明顯下降，也會(huì)引起每穗總粒數(shù)和結(jié)實(shí)率的輕度下降（除個(gè)別突變類型外），從而導(dǎo)致產(chǎn)量的下降。在大米品質(zhì)方面，與野生型相比，4 個(gè)突變體材料發(fā)生了如下變化：蛋白質(zhì)含量明顯增加（增幅9.8%～16.4%，均值12.7%）；直鏈淀粉含量輕微下降（降幅2.3%～6.8%，均值4.8%）；整精米率和長寬比均顯著增加，增幅分別為2.7%～8.0%（均值6.2%）和0.7%～3.1%（均值1.8%）；堊白度顯著增加（增幅8.0%～16.5%，均值13.2%）。因此，BADH2基因的敲除可能有利于提高米質(zhì)。

表1 BADH2基因敲除對株高及產(chǎn)量性狀的影響Tab.1 Effects of BADH2 disruption on plant height and yield traits

表2 BADH2基因敲除對大米品質(zhì)的影響Tab.2 Effects of BADH2 disruption on quality

3 結(jié)論與討論

利用CRISPR/Cas9 技術(shù)成功對臺(tái)南11 第8 染色體上的BADH2基因進(jìn)行了定點(diǎn)突變，突變體材料中香味物質(zhì)2-乙酰-1-吡咯啉含量顯著增加，其理論產(chǎn)量較野生型減少，但品質(zhì)有所提高。這些突變體材料的獲得，為進(jìn)一步選育香稻品種提供理論技術(shù)和材料支撐，加快了培育香稻品種的進(jìn)程。

近年來，隨著人們生活水平的提高，我國水稻育種已由產(chǎn)量導(dǎo)向轉(zhuǎn)入品質(zhì)產(chǎn)量并重階段，市場上的高檔優(yōu)質(zhì)米價(jià)格高且供不應(yīng)求，香味作為優(yōu)質(zhì)稻的性狀之一，為育種者的選育目標(biāo)，已受到普通百姓的熱追，如美香占2號(hào)、象牙香占、稻花香等常規(guī)稻以及野香優(yōu)系列雜交稻在米質(zhì)品嘗試驗(yàn)中成為佼佼者，并多次列為對照品種或組合。傳統(tǒng)的香稻育種主要通過品種間雜交及對后代的篩選鑒定，所需時(shí)間長。目前，CRISPR/Cas9 技術(shù)已成功應(yīng)用于包括水稻在內(nèi)的多種作物，該技術(shù)操作簡單、快速，對水稻的某些基因尤其是香味基因突變率高，且容易篩選出不含轉(zhuǎn)基因成分的突變體材料，因此，用CRISPR/Cas9 技術(shù)創(chuàng)制含有香味的水稻材料，將大大縮短選育香稻品種的時(shí)間。

為了驗(yàn)證香味基因與產(chǎn)量和品質(zhì)的關(guān)系，筆者對臺(tái)南11 野生型及4 個(gè)穩(wěn)定的不同突變類型材料的產(chǎn)量和品質(zhì)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，水稻香味基因的功能缺失均會(huì)導(dǎo)致突變體材料中產(chǎn)量（有效分蘗數(shù)、每穗總粒數(shù)、結(jié)實(shí)率）和品質(zhì)（蛋白質(zhì)含量、整精米率、堊白度、長寬比）較野生型出現(xiàn)顯著性差異，這一結(jié)果與邵高能等[13]和孫慧宇等[26]的結(jié)果有差異。此外，在4個(gè)突變體材料之間產(chǎn)量和品質(zhì)也表現(xiàn)出一定的差異，這可能與轉(zhuǎn)基因技術(shù)過程中的組織培養(yǎng)有關(guān)。