孫平勇 張武漢 舒服 何強 張莉 彭志榮 鄧華鳳，3

（1. 湖南雜交水稻研究中心雜交水稻國家重點實驗室，長沙 410125；2. 湖南省核農(nóng)學(xué)與航天育種研究所，長沙 410125；3. 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，長沙 410125）

水稻是重要的糧食作物之一，雜交水稻的發(fā)展為解決我國人民的溫飽問題作出了巨大貢獻(xiàn)。隨著國家經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力的不斷提升，我國居民實現(xiàn)了由過去吃不飽到現(xiàn)在吃得好的歷史性轉(zhuǎn)變。香稻不僅具有濃郁的香味，而且富含多種維生素和芳香氨基酸，有很高的營養(yǎng)價值［1］，深得國內(nèi)外消費者的喜愛。傳統(tǒng)的香稻品種產(chǎn)量低，導(dǎo)致香米的價格是普通大米的2-3倍［2-3］。因此，香味作為水稻的重要品質(zhì)性狀，越來越受到育種專家的重視。明確水稻香味遺傳的分子機(jī)理有助于培育香稻新品種。

近年來，測序技術(shù)、基因編輯和分子生物學(xué)的飛快發(fā)展，促進(jìn)了水稻香味基因的克隆及其分子機(jī)理的解析。水稻OsBADH2（LOC_Os08g32870）是一個重要的香味調(diào)控基因。早在1992年，康奈爾大學(xué)的Tanksley團(tuán)隊將香味隱性基因OsBADH2初步定位在水稻第8染色體上，與RFLP標(biāo)記RG28的遺傳距離為4.5 cM［4］，后來通過不同的遺傳群體將其定位在標(biāo)記RG28的附近［5-7］。直到2005年，澳大利亞Bradbury才將OsBADH2精細(xì)定位在SSR標(biāo)記RM515和SSRJ07之間386 kb的區(qū)間，并通過測序分析成功預(yù)測到候選基因［8］。OsBADH2的編碼蛋白為甜菜堿醛脫氫酶，香稻OsBADH2第7外顯子存在8 bp的缺失和3 bp的替換，導(dǎo)致其蛋白功能喪失，從而使籽粒積累香味物質(zhì)2-乙酰-1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline，2AP）［8］。功能互補和 RNAi等轉(zhuǎn)基因方法證實了OsBADH2的功能［9-10］。研究表明，OsBADH2第7外顯子的8 bp缺失是主要的變異類型［11］，之后在第 1、2、10、12、13和 14外顯子以及第4和第5外顯子之間、第1外顯子和第1內(nèi)含子的剪接位點、5′UTR區(qū)發(fā)現(xiàn)一系列新的等位突變類型［3，12-17］。這些等位基因的發(fā)現(xiàn)，為培育優(yōu)質(zhì)香稻品種提供了重要的基因資源。

目前，OsBADH2不同的等位變異相繼被報道，但通過質(zhì)譜儀定量比較它們之間香味表型差異的甚少。本研究通過對10份香稻OsBADH2編碼區(qū)進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)其中9份香稻第7外顯子缺失8 bp和替換3 bp、1份香稻第14外顯子插入1個堿基G。對香味物質(zhì)2AP含量進(jìn)行測定，表明OsBADH2不同變異類型的香味有強弱之分。根據(jù)第7外顯子的變異開發(fā)功能標(biāo)記E7，并對香稻資源和育種群體進(jìn)行鑒定，為利用OsBADH2培育優(yōu)質(zhì)香稻新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

香稻品種（品系）10份：巴斯馬蒂、香雜1號、玉油香占、象牙香占、花香B、農(nóng)香24、稻花香、香粳、明香10S和xiao7。非香稻品種（品系）2份：魔王谷和02428。香稻育種群體：泰豐B/明香10S//泰豐B和粳944/稻花香//粳944。

供試材料于2018年和2020年正季種植在湖南雜交水稻研究中心試驗田。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取、PCR擴(kuò)增和電泳檢測 采用CTAB法提取水稻葉片的基因組DNA。利用擎科生物公司的T3 Super Mix體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增：98℃ 2 min ；98℃ 10 s，55℃ 10 s，72℃ 20 s，35 個循環(huán) ；72℃ 2 min；4℃冷卻。反應(yīng)產(chǎn)物利用1.5%的瓊脂糖凝膠檢測；或者通過8%的聚丙烯酰胺電泳檢測，PCR產(chǎn)物送擎科生物公司測序。擴(kuò)增OsBADH2編碼區(qū)的9對引物序列參考Kovach等［11］。

1.2.2 OsBADH2編碼區(qū)的比對分析 以野生型非香稻日本晴OsBADH2編碼區(qū)的序列為參考，其全長下載自RGAP數(shù)據(jù)庫（http：//rice.plantbiology.msu.edu/）。通過Sequencher軟件對測序結(jié)果進(jìn)行比對分析，最終獲得供試香稻OsBADH2編碼區(qū)的變異類型。

1.2.3 香味物質(zhì)2AP含量的測定 委托武漢普奈斯生物科技有限公司測定香味物質(zhì)2AP的含量。取水稻成熟籽粒并用干冰保存，種子去殼后，于液氮中研磨粉碎，以1∶1的無水乙醇和氯仿萃取樣品中的2AP，通過Thermo TSQ 8000 EVO質(zhì)譜儀進(jìn)行測定。每個材料設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，通過t測驗計算P值分析品種間的顯著性差異。

1.2.4 OsBADH2功能標(biāo)記的設(shè)計與合成 根據(jù)香稻OsBADH2第7外顯子8 bp的缺失，通過Primer Premier5軟件設(shè)計1對能檢測水稻是否具有香味的功能標(biāo)記E7，其引物序列為E7F：5′-ACCCCATCAATGGAAATG-3′，E7R：5′-CAGGATAGAACTGGCTAC-3′。引物由擎科生物公司合成。

2 結(jié)果

2.1 香稻OsBADH2變異類型的分析

為了明確供試香稻的香味是否由OsBADH2的變異造成，對其編碼區(qū)進(jìn)行測序分析。利用9對覆蓋OsBADH2的引物對樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物通過瓊脂糖電泳檢測。以農(nóng)香24和稻花香的擴(kuò)增結(jié)果為例，除了第4對引物的擴(kuò)增產(chǎn)物有非特異性條帶，其他產(chǎn)物均為符合目標(biāo)大小的單一清晰條帶（圖1），因此適合測序。

圖1 OsBADH2 編碼區(qū)的擴(kuò)增Fig. 1 Amplification result from coding regions of OsBADH2

測序結(jié)果顯示，巴斯馬蒂、香雜1號、玉油香占、象牙香占、花香B、農(nóng)香24、稻花香、香粳和明香10S這9個香稻OsBADH2的第7外顯子均有8 bp的缺失和3 bp的替換。香稻xiao7的OsBADH2第7外顯子與非香稻日本晴的一致，而在第14外顯子有1個堿基（G）的插入突變（圖2）。

2.2 基于第7外顯子8 bp的缺失開發(fā)OsBADH2的功能標(biāo)記

為了通過分子標(biāo)記輔助選擇提高育種效率、培育香稻品種，根據(jù)OsBADH2第7外顯子的變異開發(fā)了功能標(biāo)記E7，E7的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物覆蓋了8 bp的缺失位點（圖3）。根據(jù)設(shè)計原理，利用E7對香稻（有8 bp的缺失）和非香稻的DNA進(jìn)行擴(kuò)增時，其產(chǎn)物大小分別為267和275 bp；如果是雜合型，擴(kuò)增產(chǎn)物則有267和275 bp條帶。因此，只需通過1次PCR擴(kuò)增和電泳檢測，即可快速鑒定出OsBADH2的3種基因型。

圖2 OsBADH2 的基因結(jié)構(gòu)和香稻的變異類型Fig. 2 Genetic structure of OsBADH2 and allelic variation types in fragrant rice

圖3 功能標(biāo)記E7 在OsBADH2 上的位置Fig.3 Location of functional marker E7 in the OsBADH2

為了驗證功能標(biāo)記E7的準(zhǔn)確性，以測序的10份香稻和2份非香稻的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并通過8%的聚丙烯酰胺電泳檢測。結(jié)果顯示，在第7外顯子有8 bp缺失的香稻巴斯馬蒂、香雜1號、玉油香占、象牙香占、花香B、農(nóng)香24、稻花香、香粳和明香10S的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為267 bp；香稻xiao7在第7外顯子沒有8 bp的缺失，因此，它的擴(kuò)增大小為275 bp，與非香稻魔王谷和02428的一致（圖4）。PCR擴(kuò)增結(jié)果與預(yù)測的結(jié)果完全一致，說明開發(fā)的功能標(biāo)記E7能高效檢測OsBADH2第7外顯子是否有8 bp的缺失。

圖 4 功能標(biāo)記E7 對不同品種OsBADH2 基因型的鑒定Fig. 4 Molecular detection of OsBADH2 genotypes by functional marker E7 in different rice varieties

2.3 不同香稻香味物質(zhì)2AP含量的比較

為了明確不同等位基因型之間香味物質(zhì)的含量是否有差異，對OsBADH2第7外顯子變異（象牙香占）和第14外顯子變異（xiao7）的香稻以及非香稻（魔王谷）的香味物質(zhì)2AP進(jìn)行測定。結(jié)果表明，非香稻魔王谷的2AP含量最低，只有13.08 ng/g；香稻象牙香占的2AP含量適中，濃度為109.95 ng/g；香稻xiao7的2AP含量最高，達(dá)147.68 ng/g。香稻象牙香占和xiao7的2AP含量均顯著高于非香稻魔王谷2AP的含量，而xiao7的2AP含量顯著高于象牙香占的含量（圖5）。

2.4 功能標(biāo)記E7在培育香稻新品種中的應(yīng)用

圖5 不同品種香味物質(zhì)2AP含量比較Fig. 5 Content of 2AP in different rice varieties

為了利用功能標(biāo)記E7輔助選擇培育優(yōu)質(zhì)香稻新品種，以香稻稻花香和明香10S為香味基因的供體，分別與粳944和泰豐B雜交構(gòu)建了粳944/稻花香//粳944和泰豐B/明香10S//泰豐B群體。通過功能標(biāo)記E7對這兩份育種群體的OsBADH2基因型進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，稻花香和明香10S的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為267 bp，非香稻粳944和泰豐B的產(chǎn)物大小為275 bp，而雜合型擴(kuò)增產(chǎn)物包含267和275 bp條帶（圖6）。基因型統(tǒng)計結(jié)果表明，粳944/稻花香//粳944群體的74個單株里有38個雜合，其余為非香型純合，雜合數(shù)與純合數(shù)之比接近1∶1；泰豐B/明香10S//泰豐B群體的41個單株中間有21個雜合，雜合數(shù)與純合數(shù)之比也接近1∶1，與預(yù)期的分離比一致。因此，設(shè)計的功能標(biāo)記E7可以對OsBADH2非香型顯性純合、香型隱性純合和雜合3種基因型進(jìn)行快速準(zhǔn)確鑒定。

3 討論

香稻資源遍布全球，泰國的茉莉香105（KDML105）和印度的巴斯瑪?shù)伲˙asmati）都是國際上有名的香稻。我國香稻的種植歷史也很悠久，玉針香、螃蟹谷、香禾和靖西香糯分別是湖南、云南、貴州和廣西的代表性常規(guī)香稻品種。傳統(tǒng)的常規(guī)香稻因抗性差和植株偏高等原因?qū)е庐a(chǎn)量低，而雜交香稻具有抗逆性強和產(chǎn)量高的特點［18］。1995年周坤爐［19］利用香稻不育系和非香稻恢復(fù)系育成了我國首個雜交香稻組合香優(yōu)63。由于現(xiàn)有的香味基因?qū)儆陔[性遺傳，因此由香稻不育系和非香稻恢復(fù)系配組得到的雜交稻米粒只有1/4具有香味［20］。直到2013年，湯儉民等［21］利用均具香味的不育系和恢復(fù)系培育出一個全香型雜交稻紅香優(yōu)68。

圖6 功能標(biāo)記E7 對2 份育種群體OsBADH2 基因型的鑒定Fig. 6 Molecular detection of OsBADH2 genotypes by functional marker E7 in two breeding populations

快速準(zhǔn)確地對香味性狀進(jìn)行鑒定是開展香稻育種的前提。傳統(tǒng)育種一般通過咀嚼法和KOH浸泡法來鑒定香味［22］，由于香稻的香味受環(huán)境條件的影響很大，加之人為因素，增加了其鑒定的難度［23］。此外，由于雜合體不具有香味，以往許多含有香味基因的優(yōu)良雜合體被淘汰，不利于培育優(yōu)質(zhì)香稻新品種。因此急需一種簡便、高效和準(zhǔn)確鑒定香味基因型的方法。近年來，隨著功能基因組學(xué)和測序技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記輔助選擇已廣泛應(yīng)用于香稻的遺傳育種，大大提高了選擇效率、加快了育種進(jìn)程，許多香稻品種已得到大面積推廣［24］。研究人員根據(jù)OsBADH2第12外顯子3 bp的插入突變，設(shè)計了功能標(biāo)記FME12-3，并利用2 個F2群體證明了FME12-3可以準(zhǔn)確快速地鑒定OsBADH2的不同基因型［15］。沈雨民等［25］通過分子標(biāo)記輔助選擇培育出米質(zhì)優(yōu)、抗稻瘟病、異交率高和配合力好的不育系贛蓮A，具有很好的應(yīng)用前景。

利用分子標(biāo)記輔助選育香稻新品種，首先要明確供體香味基因的突變類型，然后根據(jù)突變位點開發(fā)相應(yīng)的功能標(biāo)記。本研究對10份香稻OsBADH2編碼區(qū)進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)其中9個香稻OsBADH2的第7外顯子均為8 bp的缺失和3 bp的替換，只有1份香稻在第14外顯子有1個堿基（G）的插入突變，這兩種變異均為以前報道的類型［8，15］。研究表明第7外顯子的缺失為主要突變類型，Kovach等［11］在鑒定的117個香稻資源中，有93份在OsBADH2第7外顯子缺失8 bp。楊國峰等［26］對12個香稻進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)其中10個材料在第7外顯子具有同樣的突變類型。張江麗等［27］鑒定出86份具有香味的水稻資源，其中80份在第7外顯子存在缺失。為了明確第7外顯子的變異與其他類型的變異是否會導(dǎo)致香味表型的強弱差別，對第7外顯子變異（象牙香占）和第14外顯子變異（xiao7）的香稻以及非香稻（魔王谷）的香味物質(zhì)2AP進(jìn)行測定。結(jié)果表明，香稻象牙香占和xiao7的2AP含量均顯著高于非香稻魔王谷2AP的含量，而xiao7的2AP含量顯著高于象牙香占的含量。這一結(jié)果說明不同變異類型香稻的香味表型有強弱之分，同時可以推測第7外顯子的突變作為應(yīng)用最廣泛的等位基因型，不是由于該等位基因型的效應(yīng)最大（即香味物質(zhì)的積累最多），而是因為這些香味品種具有相同的OsBADH2來源，在育種的過程中被大量選擇保留。為了通過分子標(biāo)記輔助選擇提高育種效率、培育香稻品種，本研究根據(jù)OsBADH2第7外顯子8 bp的缺失開發(fā)了功能標(biāo)記E7，通過對香稻資源和育種群體進(jìn)行鑒定，證明E7可以對OsBADH2非香型顯性純合、香型隱性純合和雜合3種基因型進(jìn)行快速準(zhǔn)確鑒定，為利用OsBADH2進(jìn)行分子育種、培育優(yōu)質(zhì)香稻新品種奠定了重要基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

象牙香占、花香B、農(nóng)香24等9份香稻均在第7外顯子發(fā)生8 bp的缺失和3 bp的替換，只有香稻xiao7在第14外顯子有1個堿基（G）的插入突變。根據(jù)香稻OsBADH2第7外顯子8 bp的缺失設(shè)計的功能標(biāo)記E7，能快速準(zhǔn)確鑒定OsBADH2的純合顯性、純合隱性和雜合3種基因型。