魏蘭芳，張榮琴，姚 博，張晉豪，熊新穎，代真林，艾 瑛，姬廣海*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)科基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 省部共建云南生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201；3.云南省玉溪市通?？h植保植檢站，云南 玉溪 652700）

【研究意義】蕓薹根腫菌(Plasmodiophora brassicae) 能夠引起十字花科作物根腫病，已成為全球十字花科作物中最嚴(yán)重的病害之一，根腫病菌能夠危害100 多種十字花科作物[1]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】該病于1737 年首次被發(fā)現(xiàn)，作為一種土傳病害，根腫病的病原菌在土壤中的存活時(shí)間能達(dá)到8 年之久[2]，休眠孢子在無感病寄主植物的土壤中甚至可以存活10 年以上[3]。蕓薹根腫菌生活史存在3 個(gè)階段，即休眠孢子時(shí)期、根毛侵染期和皮層侵染期[4-6]。由根腫病在世界范圍內(nèi)每年造成產(chǎn)量損失10%～15%[7]。在發(fā)病較重田塊實(shí)行與非十字花科作物輪作3 年以上，可有效降低病害的發(fā)病率[8]。在發(fā)病較輕的田塊合理安排茬口，避免與十字花科作物連作，以削減田間病原菌的積累，躲避易感作物，阻斷侵染路徑[9]。十字花科作物與小麥、玉米、大豆等非十字花科作物輪作，可避免病菌在田間持續(xù)滋生和積聚[10]。句夢娜等[11-12]研究表明西蘭花輪作及殘?bào)w還田對馬鈴薯和棉花黃萎病有很好的防治效果。張蕾等[13]用大豆作為前茬作物來控制油菜根腫病，結(jié)果表明前作大豆，后茬油菜對油菜根腫病的發(fā)病率和病情指數(shù)都會顯著降低?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】近年來，根腫病持續(xù)擴(kuò)散，在我國的華北、華南、東南、西南地區(qū)均有發(fā)生，常年發(fā)生面積約320 萬～400 萬hm2，占十字花科作物種植面積的1/3 以上，嚴(yán)重降低白菜產(chǎn)量和品質(zhì)，制約白菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[14]。由于根腫病危害嚴(yán)重且難以防治，根腫病的防治研究顯得尤為重要和迫切?；瘜W(xué)防治是目前最主要的防治手段，但過度使用化學(xué)藥劑又會產(chǎn)生3R (抗藥性、再猖獗和農(nóng)藥殘留)問題，能夠造成環(huán)境污染，引起人畜中毒等嚴(yán)重后果。根腫病在生產(chǎn)上會導(dǎo)致十字花科蔬菜的產(chǎn)量嚴(yán)重下降，甚至絕收，尤其連茬種植加重病情的惡化，也極大地制約了油料和蔬菜產(chǎn)業(yè)的農(nóng)業(yè)可持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展。因此亟需探索一條新的根腫病綠色防控思路，尋找安全且高效地防治十字花科蔬菜根腫病的新途徑。目前，為了能夠有效地減少化學(xué)農(nóng)藥大量施用，人們也在不斷探索新的農(nóng)作物多樣性栽培模式和措施，其中輪作模式控制土傳病害成為了近幾年關(guān)注的熱點(diǎn)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本試驗(yàn)對大豆輪作（白菜-大豆-白菜）及大豆秸稈還田控制白菜根腫病的效果進(jìn)行評價(jià)并分析防治機(jī)理，進(jìn)一步研究了大豆根瘤菌作為生防菌劑防治根腫病的潛能，探索能夠高效、穩(wěn)定防治十字花科蔬菜根腫病的生態(tài)種植技術(shù)和綜合防治措施，為云南省十字花科蔬菜綠色可持續(xù)發(fā)展提供安全有效的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 帶菌土壤和根腫病組織：采自云南省昆明市白菜根腫病重病田（發(fā)病率為100%，病情指數(shù)為77.43）；白菜根腫組織，存放于-20 ℃冰箱備用。供試植株：白菜品種：感病品種83-1（魯春白1號，青島國際種苗有限公司）。大豆品種：日本3號。白菜、大豆種植：育苗盆高25 cm，內(nèi)口徑29 cm；帶菌病土，草木灰，珍珠巖按4∶1∶1混合拌勻。育苗盆內(nèi)種植10株白菜或者5株大豆。

1.1.2 主要培養(yǎng)基及試劑 NA 培養(yǎng)基（營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基）：蔗糖10 g，蛋白胨5 g，牛肉膏3 g，酵母浸膏1 g，瓊脂粉20 g，加水溶解后定容至1 000 mL，pH 7.0，121 ℃濕熱滅菌20 min 后制成培養(yǎng)平板。YEM 培養(yǎng)基：甘露醇10 g、酵母膏3 g、氯化鈉0.2 g，硫酸鎂0.2 g，磷酸氫二鉀0.5 g，瓊脂17～20 g，加水溶解后定容至1 000 mL，pH 7.2，121 ℃濕熱滅菌20 min后制成培養(yǎng)平板?；瘜W(xué)殺菌劑：氰霜唑（有效成分含量100 g/L，寧波石原金牛農(nóng)業(yè)科技有限公司）。

1.1.3 試驗(yàn)地點(diǎn) 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院溫室。

1.2 研究方法

1.2.1 輪作大豆及大豆秸稈還田試驗(yàn)設(shè)置 白菜根腫病病土種植大豆一季，大豆收獲后輪作種植白菜，白菜連作作為對照處理，同時(shí)設(shè)置一組大豆-白菜輪作+大豆秸稈還田處理（表1）。每個(gè)實(shí)驗(yàn)處理設(shè)置3 個(gè)生物重復(fù)。

表1 不同種植模式實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab.1 Different planting patterns experimental design

1.2.2 防效測定 白菜播種50 d后調(diào)查根腫病的發(fā)病率和病情指數(shù)，并計(jì)算出相對防效。

病情等級參照如表2。利用Excel 2007和DPS7.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

表2 白菜根腫病病情分級標(biāo)準(zhǔn)Tab.2 Chinese cabbage clubroot disease condition classification standard

1.2.3 土壤樣品根腫菌熒光定量PCR 檢測（1）根際土壤收集。白菜根際土壤采集參照Cui 等[15]的方法，每個(gè)處理的5 株白菜（“Z”字5 點(diǎn)采樣）根際土收集混合為1 個(gè)樣品，每個(gè)處理2 個(gè)重復(fù)。土壤樣品收集于50 mL 離心管并置于冰盒中，盡快帶回實(shí)驗(yàn)室后保存于-80 ℃冰箱。（2）土壤DNA 和根腫菌孢子DNA。提取根腫菌孢子DNA 提取參照吳發(fā)紅等[16]構(gòu)建的方法。采集試驗(yàn)前后根際土壤樣品進(jìn)行根腫菌熒光定量PCR 檢測，使用土壤DNA 提取試劑盒（Cas12888，QIAGEN，Germany），進(jìn)行土壤中根腫菌基因組DNA 的提取。Nano Drop2000 超微量分光光度計(jì)檢測DNA 濃度和純度，置于-20 ℃冰箱備用。（3）PCR 擴(kuò)增及其重組質(zhì)粒的制備。利用實(shí)驗(yàn)室前期依據(jù)根腫病菌核糖體RNA 18S-ITS 基因，篩選得到特異性較強(qiáng)的根腫菌特異性引物PB05F/R（PB05F：GAACGGGTTCACAGACTAGAT；PB05R：GCCCACTGTGTTAATGATCC）[17]，目的片段大小為158 bp，對提取的土壤中根腫病菌基因組DNA 進(jìn)行普通PCR 擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)總體系為25 μL，10×PCR Buffer（含Mg+）2.5 μL，dNTP 2 μL，rTaqDNA 聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，PCRPrimer（10 μmol/L）各1 μL，DNA 2 μL，ddH2O（滅菌）16 μL。PCR 擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，51 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，72 ℃補(bǔ)充延伸10 min，35 個(gè)循環(huán)。12 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR 產(chǎn)物用普通瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒（DP209，天根生化科技有限公司，北京）純化回收目的片段。目的片段純化后連接到克隆載體pMD19-T（6013，TAKARA，大連），轉(zhuǎn)化至E.coliJM109 感受態(tài)細(xì)胞，過夜培養(yǎng)進(jìn)行藍(lán)白班篩選，挑取陽性克隆，送昆明擎科生物技術(shù)有限公司測序驗(yàn)證。（4）重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備。測定重組質(zhì)粒標(biāo)樣品的吸光度，使用無菌水為參照，計(jì)算重組質(zhì)粒的濃度。將重組質(zhì)粒樣品按10 倍梯度稀釋，稀釋8 個(gè)梯度作為模板，利用SYBR Greenn（FP205，天根生化科技有限公司，北京）熒光染料法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，以重組質(zhì)粒DNA 濃度為x 軸，Ct值為y 軸，建立根腫病菌的qPCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)總體系為10 μL（表2-3），反應(yīng)程序在QuantStudio TM 7 Flex（Applied Biosystems，USA）熒光定量PCR 儀上進(jìn)行，擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性30 s，51 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，40 個(gè)循環(huán)。在每個(gè)循環(huán)的延伸階段（51 ℃）同步采集熒光。PCR 擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行溶解曲線分析，以驗(yàn)證擴(kuò)增的特異性。熒光定量PCR 反應(yīng)總體系為10 μL，SYBR Green Master Mix 5 μL，PCR引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA 1 μL，ddH2O（滅菌）2 μL。（5）土壤樣品中根腫病菌的qPCR 檢測。提取的土壤總DNA 為模板，通過qPCR 檢測根腫病菌（每個(gè)樣品取3 次重復(fù)，檢測結(jié)果取平均值），根據(jù)Ct 值計(jì)算出土壤中根腫菌孢子的含量。

1.2.4 土壤根際微生物群落多樣性分析 白菜根際土壤樣品送至北京百邁客生物科技有限公司，采用Illumina MiSeq 測序技術(shù)迚行高通量測序。測序初始數(shù)據(jù)（raw data）為FASTQ 格式，選Trimmomatic 軟件對原始的雙端序列進(jìn)行去雜處理后利用FLAS 軟件進(jìn)行序列拼接，同時(shí)利用usearch 檢測并去除序列中的嵌合體序列獲得優(yōu)質(zhì)序列。采用Vsearch 軟件，根據(jù)序列的相似性，將序列歸為多個(gè)OTU（operational taxonomic units）。參數(shù)為序列相似度大于或等于97%被歸為一個(gè)OTU 單元。使用QIIME 軟件包的挑選出各個(gè)OTU的代表序列，并將所有代表序列與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對注釋。16S利用Greengenes或者Silva（ver?sion123）數(shù)據(jù)庫比對。物種比對注釋使用RDP classifier 軟件，保留置信區(qū)間大于0.7 的注釋結(jié)果?；贠TU的分析，明確樣品之間的細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)、物種組成差異。

1.2.5 根瘤菌對白菜根腫病的影響（1）根瘤菌的分離、培養(yǎng)及其分子生物學(xué)鑒定。參照高亞梅等[18-19]大豆根瘤菌的分離方法，選根部飽滿幼嫩根瘤，清洗干凈后用體積分?jǐn)?shù)75%的酒精表面消毒5 min，再用滅菌蒸餾水清洗3 次后用滅菌吸水紙吸干水分，研碎后放于裝有45 mL 無菌水的三角瓶（容量100 mL）中，160 r/min 26 ℃振蕩15 min 后取出靜置5 min，取上清液梯度稀釋成10 倍梯度稀釋，將10-4、10-5、10-6稀釋液各取100 μL 在YEM、NA 培養(yǎng)基上依次按低濃度至高濃度進(jìn)行涂布分離。將平板倒置在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，后挑取具根瘤菌特征的菌落純化培養(yǎng)兩代后保存?zhèn)溆?。提取根瘤菌菌株基因組DNA。釆用細(xì)菌通用引物27F 和1492R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，基因組DNA 為擴(kuò)增模板，引物序列為：27F（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)/1492R（GGTTACCTTGTTACGACTT)。PCR 反應(yīng)體系為：EasyTaqPCR SuperMix 12 μL，27F/1492R 引物（10 μmol/L)各1 μL，DNA 模板（約50 ng/μg)1 μL，滅菌ddH2O 10 μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃5 min；94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃1 min，72 ℃10 min，35 個(gè)循環(huán)；擴(kuò)增產(chǎn)物1.2%的瓊脂糖凝膠電泳，送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。將得到的16S rDNA序列在GenBank 數(shù)據(jù)庫BLAST 中比對分析。（2）根瘤菌菌株的發(fā)酵培養(yǎng)。取保存于-20 ℃冰箱中的根瘤菌菌株懸浮液100 μL，接種到Y(jié)EM 培養(yǎng)基上，（28±1）℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d，通過平板劃線將其接種于YEM 平板上，置于生化培養(yǎng)箱中28 ℃下培養(yǎng)至長出單菌落。將培養(yǎng)好的單菌落接到500 mL YEB 液體培養(yǎng)基的三角瓶中制成菌懸液，在（28±1）℃，160 r/min 條件下?lián)u48 h 左右，測OD600值為0.5以上，得到的懸濁液即為發(fā)酵液。（3）根腫菌接種體的制備。取新鮮根腫組織洗凈、體積分?jǐn)?shù)75%酒精消毒后用破壁機(jī)攪碎，8 層紗布過濾，棄去殘?jiān)?，將濾液裝入50 mL 的滅菌離心管內(nèi)，先2 000 r/min離心5 min，棄去上清液，沉淀用蒸餾水懸浮后再4 000 r/min 離心10 min，2 次重復(fù)。棄去上清液，用蒸餾水懸浮沉淀物，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法將懸浮液的孢子濃度調(diào)至1×107/mL-1，4 ℃保存?zhèn)溆?。?）溫室測定根瘤菌對白菜根腫病的生防效果。

播種后10 d將制備好的根腫病休眠孢子懸浮液（濃度為1×107/mL-1）灌根接種到種好的白菜上，每株苗接根腫病菌液為10 mL，24 h后接種根瘤菌菌懸液（濃度為3×108CFU/mL），每株苗根瘤菌用量為10 mL，于7 d和14 d后灌2次根瘤菌菌懸液。播種后50 d左右進(jìn)行調(diào)查，記錄根腫病的發(fā)病等級及植株的生理指標(biāo)，利用Excel 2007和DPS 7.5數(shù)據(jù)處理軟件整理數(shù)據(jù)并分析結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 輪作大豆對白菜根腫病的控制效果

白菜播種后50 d 進(jìn)行病害調(diào)查，每個(gè)重復(fù)采集10 株白菜，每個(gè)處理調(diào)查30 株，調(diào)查結(jié)果見表3。結(jié)果表明：在空白對照（BCBT）發(fā)病率達(dá)93.34%的情況下，大豆輪作后（RBSHL 和RBSHJ）均能降低白菜根腫病的發(fā)病率和病情指數(shù)；大豆輪作（RBSHL）后白菜根腫病發(fā)病率70.00%，病情指數(shù)40.00，防治效果為43.67%；大豆輪作后大豆秸稈還田（RBSHJ）處理對根腫病的發(fā)病率66.66%，病情指數(shù)33.33，防治效果為52.59%，比單一大豆輪作高出8.92%。由此說明輪作大豆對減輕白菜根腫病的發(fā)病率發(fā)揮著作用。

表3 輪作大豆對白菜根腫病的控制效果Tab.3 Control effect of soybean-cabbage rotation on clubroot disease

2.2 土壤樣品中根腫菌熒光定量PCR檢測

2.2.1 土壤中根腫菌標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 利用根腫菌特異性引物對PB05F/PB05R，以人工配制的病土獲得的根腫病菌孢子DNA 為模板，擴(kuò)增18S-ITS 基因，并通過連接轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5ɑ 后提取質(zhì)粒制備重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒進(jìn)行10 倍梯度稀釋，以通過SYBR GreenⅠ熒光染料法進(jìn)行熒光定量PCR，建立土壤根腫病孢子和Ct值之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線。土壤根腫病孢子（x）與對應(yīng)的Ct值（y）之間有良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=-3.245x+41.579，相關(guān)系數(shù)R2為0.981 6（圖1）。

圖1 熒光定量PCR土壤根腫菌標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of fluorescence quantitative PCR for soil rhizobia

2.2.2 輪作大豆土壤樣品根腫菌熒光定量PCR 檢測 利用熒光定量PCR 對不同處理后土壤樣品中的根腫菌進(jìn)行熒光定量檢測結(jié)果表明，輪作大豆和輪作大豆完秸稈返田處理后，每克土壤所含根腫病孢子數(shù)量由＞1×105.24個(gè)減少到1×104.45個(gè)和1×104.60個(gè)，約減少了77%（表4）。結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)室的評估，土壤中孢子數(shù)含量＞1×105為病害發(fā)生高風(fēng)險(xiǎn)等級按照發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)等級，處理后下降為中度風(fēng)驗(yàn)等級，病害風(fēng)險(xiǎn)顯著下降。

表4 白菜-大豆輪作根腫菌檢測結(jié)果Tab.4 Results of detection of resting spores of P.brassicae in soybean and cabbage rotation

2.3 大豆與白菜輪作后白菜根際土壤微生物群落

2.3.1 白菜根際土壤微生物的多樣性分析 物種多樣性（diversity）指標(biāo)：Chao1、Ace、Shannon、Simpson。Chao1和Ace指數(shù)衡量物種豐度即物種數(shù)量的多少，Shannon指數(shù)衡量物種多樣性，Shannon指數(shù)值越大，多樣性越高[20]。與連作模式相比，大豆輪作后根際土壤中細(xì)菌的OTU 數(shù)，Ace，Chao1 和Shannon 指數(shù)均顯著增加，分別增加6.85 倍，4.15 倍，5.45 倍和2.43 倍，可以看出大豆白菜的輪作模式增加了根際土壤細(xì)菌的多樣性。但從真菌的多樣性分析，與白菜連作模式相比，大豆/白菜輪作后的白菜根際土壤真菌的多樣性指數(shù)無顯著差異（表5）。

表5 不同栽培模式下白菜根際土壤微生物多樣性指數(shù)Tab.5 Chinese cabbage under different cultivation mode rhizosphere soil microbial diversity index

2.3.2 白菜根際土壤微生物目水平群落結(jié)構(gòu)分析 對細(xì)菌、真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，以物種分布柱狀圖展示（圖2），一種顏色代表一個(gè)物種，色塊長度表示物種所占相對豐度比例，并將其他物種合并為Others，Unclassified代表未得到分類學(xué)注釋的物種。

從圖2 中可以看出白菜根際土壤細(xì)菌群落在目分類水平上包含假單胞菌目（Pseudomonadales）、根瘤菌目（Rhizobiales）、SBR1031、芽孢桿菌目（Bacillales）、鞘脂單胞菌目（Sphingomonadales）、β-變形菌目（Betaproteobacteriales）、Uncultured_bacterium_c_Subgroup_6、芽單胞菌目（Gemmatimonadales）、梭菌目（Clostridiales）（圖2a）。其中白菜連作（即未輪作大豆）模式下土壤根際微生物的優(yōu)勢菌主要為假單胞菌（Pseudomonadales），疣微菌目（Verrucomicrobiales）和芽孢桿菌目（Bacillales），豐度最高的假單胞菌目Pseudomonadales 在細(xì)菌群落中所占比例大于30%；輪作大豆后，根際微生物中的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了轉(zhuǎn)換，假單胞菌目（Pseudomonadales）、芽孢桿菌目（Bacillales）和梭菌目（Clostridiales）的相對豐度顯著下降，尤其是假單胞菌目（Pseudomonadales）的在細(xì)菌群落中相對豐度小于1%（圖2）；大豆輪作后白菜根際土壤菌群中根瘤菌目（Rhizobiales）、SBR1031、鞘脂單胞菌目（Sphingomonadales）、β-變形菌目（Beta?proteobacteriales）、芽單胞菌目（Gemmatimonadales）的相對豐度顯著增加。大豆輪作并大豆秸稈還田白菜根際土壤RBSHJ 中的根瘤菌目（Rhizobiales）在細(xì)菌群落中的相對豐度較大豆白菜輪作根際土壤RB?SHL 中提高6%，這暗示大豆秸稈還田后增加了根瘤菌目的相對豐度。值得注意的是，大豆輪作后，其他菌群門（Others）在細(xì)菌群落中的比例顯著提高，可以推測大豆輪作后根際微生物的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性更加高。

根際土壤真菌群落在門分類水平上的優(yōu)勢菌群包括糞殼菌目（Sordariales）、肉座菌目（Hypocreales）、被孢霉目（Mortierellales）、散囊菌目（Eurotiales）、傘菌目（Agaricales）、格孢腔菌目（Pleosporales）、銀耳目（Tremellales）、小叢殼目（Glomerellales）、酵母菌目（Saccharomycetales）和間座殼菌目（Coniochaetales）白菜連作和大豆白菜間作（包括秸稈還田）模式下，白菜根際土壤真菌的群落結(jié)構(gòu)變化不大，大豆白菜輪作后肉座菌目（Hypocreales）的相對豐度顯著下降，間座殼菌目（Coniochaetales）和被孢霉目（Mortierellales）的相對豐度顯著增加，被孢霉目的豐度隨著大豆輪作和輪作加秸稈還田的模式逐漸升高。

圖2 不同栽培模式下土壤樣品細(xì)菌和真菌在目水平的相對豐度Fig.2 Relative abundances of the dominate bacterial and fungi at Order levels under different cultivation patterns

2.3.3 白菜根際土壤微生物屬水平群落結(jié)構(gòu)分析 白菜連作（BCBT），大豆白菜輪作（RBSHL）和大豆/白菜輪作后大豆秸稈還田（RBSHJ）的屬水平相對豐度較高細(xì)菌分別為14個(gè)屬，22個(gè)屬和26個(gè)屬。不同栽培模式下種水平細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)（圖3a），通過分析連作模式下白菜根際土壤微生物的主要優(yōu)勢菌屬為：假單胞菌屬（Pseudomonas）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）和阿克曼菌屬（Akkermansia）。而大豆白菜輪作栽培模式下，白菜根際土壤微生物的優(yōu)勢物種為：鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、本土原生A4b 菌屬、阿克曼菌屬（Akkermansia）、Saccharimonas、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）。

白菜連作（BCBT），大豆白菜輪作（RBSHL）和大豆白菜輪作后大豆秸稈還田（RBSHJ）的真菌群落中優(yōu)勢菌屬的數(shù)量增多，白菜連作根際土壤真菌的優(yōu)勢菌屬（相對豐度＞1%）14個(gè)，大豆輪作和大豆輪作并秸稈還田后根際土壤的真菌優(yōu)勢菌屬分別變?yōu)榱?2 個(gè)和26 個(gè)，大豆輪作后優(yōu)勢真菌菌屬的數(shù)量增多。不同栽培模式下屬水平真菌的群落結(jié)構(gòu)（圖3b），白菜連作栽培和大豆輪作栽培后的優(yōu)勢菌群基本相似，主要為：小被孢霉屬（Mortierella）、大孢圓孢霉屬（Staphylotrichum）、青霉菌屬（Penicillium）、錐蓋傘屬（Conocybe）、鐮刀菌屬（Fusarium）、曲霉菌屬（Aspergillus）、Saitozyma和裂殼屬（Schizothecium），其中大豆白菜輪作后小被孢霉屬的豐度顯著增加。值得注意的是毛葡孢屬（Botryotrichu）和尾孢菌屬（Cercophora）在大豆輪作并秸稈還田后白菜根際土壤中的豐度顯著增加。

圖3 不同栽培模式下土壤樣品細(xì)菌和真菌在屬水平的相對豐度Fig.3 Relative abundances of the dominate bacterial and fungi at Genus levels under different cultivation patterns.

2.4 根瘤菌在大豆/白菜輪作中起重要作用

高通量測序結(jié)果分析可知，大豆白菜輪作后，根瘤菌的豐度增加。通過溫室盆栽實(shí)驗(yàn)，外源添加從大豆根瘤中分離獲得8 株根瘤菌菌懸液（表6），對其防治白菜根腫病的效果進(jìn)行評估。8 株根瘤菌對白菜根腫病都有較好的防治效果，防治效果都在45%以上，其中防治效果最好的是RG-4菌株，相對防效為66.39%，防效與化學(xué)殺菌劑-氰霜唑（科佳）相比僅相差5.88%。結(jié)果表明根瘤菌在大豆白菜輪作模式中可能起到重要作用。

表6 根瘤菌對白菜根腫病的溫室防效測定Tab.6 Determination of Rhizobium for bio-control Effect on Chinese cabbage disease

3 討論

3.1 大豆白菜輪作模式減輕白菜根腫病的發(fā)生

十字花科作物根腫病在我國發(fā)生面積廣，危害作物種類多。由于該病原菌不能離體培養(yǎng)，侵染機(jī)理不十分清楚，發(fā)生規(guī)律和影響因素極其復(fù)雜，侵染后難以徹底根除等特點(diǎn)。近年來國內(nèi)外有學(xué)者研究證實(shí)，水旱間隔年限輪作對十字花科根腫病的控制具有良好效果[21]，十字花科作物與大蒜、黑麥草、紅三葉草等非十字花科植物輪作能有效減少根腫菌在土壤中的數(shù)量[22-23]。

3.2 大豆白菜輪作模式對根際微生物的影響

作物根際土壤微生物作為指示根際土壤健康的重要指標(biāo)，土壤微生物群落多樣性對于作物健康至關(guān)重要，尤其是根際土壤細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的多樣性結(jié)構(gòu)組成和多樣性程度與作物抗病能力呈正相關(guān)[24]。趙柏霞[25]等利用16S rDNA 基因文庫分析相結(jié)合方法對蔬菜枯萎病的健康植株和患病植株比較分析，健康植株的優(yōu)勢菌群為變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門以及放線菌門，厚壁菌門。大豆和油菜根際土壤共有的優(yōu)勢菌群為變形菌門、擬桿菌門、酸桿菌門、放線菌門、子囊菌門、接合菌門、擔(dān)子菌門和壺菌門，大豆根際土壤存在很多具有生防或促生作用的微生物細(xì)菌如鞘氨醇單胞菌，芽孢桿菌和根瘤菌等有益微生物[26]。本研究通過對白菜連作，大豆白菜輪作和大豆白菜輪作后秸稈還田的后茬白菜根際土壤微生物的微生物多樣性進(jìn)行分析，分析結(jié)果表明大豆白菜輪作模式的根際土壤細(xì)菌和真菌相對白菜連作模式下優(yōu)勢菌群發(fā)生了轉(zhuǎn)變。白菜連作模式下目水平優(yōu)勢細(xì)菌菌群和真菌菌群為假單胞菌目（Pseudomonnadales）和肉座菌目（Ascomycota），大豆白菜輪作后優(yōu)勢細(xì)菌菌群轉(zhuǎn)變?yōu)榱薘hizobi?ales、鞘脂單胞菌目（Sphingomonadales）、β-變形菌目（Betaproteobacteriales）、芽單胞菌目（Gemmatimonad?ales），真菌菌群子囊菌門豐度顯著下降，莫氏菌門豐度顯著上升。這意味著大豆白菜輪作的模式增加了有益微生物的豐度，趨向于健康植株的根際微生物群落結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步筆者比較不同栽培模式下白菜根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)在屬水平的差異，大豆白菜輪作相比白菜連作，真菌屬的群落結(jié)構(gòu)中小被孢霉屬的相對豐度顯著增加，細(xì)菌菌屬鞘氨醇單胞菌屬、土原生A4B 菌屬、阿克曼菌屬和芽單胞菌屬的相對豐度顯著增加，與前人的報(bào)道一致，植株越健康根際土壤中存在越多對可以用來防治植物病害或具有促生作用的微生物[27-28]，如具有生物防治潛能的鞘氨醇單胞菌屬和芽單胞菌屬[29]。本研究僅從不同栽培模式對土壤根際微生物的群落結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行了研究，而植物內(nèi)生菌的組成及變化情況有待于進(jìn)一步探究。

3.3 根瘤菌在大豆白菜輪作模式控制根腫病起重要作用

根瘤菌與豆科植物在共生狀態(tài)下具有生物固氮作用，也有研究發(fā)現(xiàn)根瘤菌作為生防菌對白菜根腫病具有防治作用。一些種類的根瘤菌對豌豆等豆類作物的根腐病等植物病害具有生物防治作用[30]。趙宇樞等[31-32]研究發(fā)現(xiàn)根瘤菌對胞囊線蟲和抗胞囊線蟲機(jī)理進(jìn)行了研究。郝天雪[33]研究還表明根瘤菌是通過形成侵入線，侵染宿主細(xì)胞，然后形成外部為皮層和內(nèi)部為中心組織的根瘤。

4 結(jié)論

本研究通過在白菜病土中輪作一季大豆和輪作大豆后秸稈還田可以減輕白菜根腫病害，防效達(dá)43.67%以上；并對大豆輪作及其秸稈還田后土壤中的根腫菌休眠孢子進(jìn)行熒光定量檢測，大豆輪作后土壤休眠孢子含量相對連作白菜土壤減少了約77%。大豆/白菜輪作模式控制白菜根腫病具有良好的效果，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有較好的推廣前景。本試驗(yàn)通過溫室盆栽證明根瘤菌對根腫病具有良好的防治效果，為進(jìn)一步研究根瘤菌的田間防病效果及其生防機(jī)制提供了重要的生防細(xì)菌資源。