傅夏燕，陳其臻，尹 喆，王炎秋

(1.同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，上海 200065；2.同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200092)

人卵母細(xì)胞生長(zhǎng)在被基底膜包圍的卵泡液中，基底膜和卵泡液中缺乏血管系統(tǒng)[1]。卵泡發(fā)育過(guò)程中，卵泡發(fā)育前的竇狀卵泡期氧濃度處于正常水平。伴隨著卵泡由無(wú)腔卵泡發(fā)育為有腔卵泡，被卵泡液包裹的卵丘顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞周?chē)难芟到y(tǒng)分布迅速減少，導(dǎo)致卵母細(xì)胞供血迅速下降，形成低氧環(huán)境；排卵過(guò)程中脈管系統(tǒng)的脫落以及重塑均會(huì)降低局部氧濃度。因此卵泡的發(fā)育、成熟、排卵以及隨后的黃體早期均處于局部低氧或缺氧的環(huán)境中[2]，這一過(guò)程主要通過(guò)缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)實(shí)現(xiàn)對(duì)氧應(yīng)激的平衡。本文就HIF-1在卵泡發(fā)育、排卵過(guò)程中的表達(dá)、作用機(jī)制以及意義等方面進(jìn)行綜述。

1 HIF-1的結(jié)構(gòu)及活性調(diào)節(jié)

HIF-1是由α亞基和β亞基組成的異二聚體(圖1)，編碼HIF-1α和HIF-1β的基因分別位于人類(lèi)第14號(hào)染色體21～24區(qū)和第1號(hào)染色體的q2l區(qū)。其中HIF-1α(相對(duì)分子質(zhì)量120000)作為調(diào)節(jié)亞基，決定了HIF-1的功能，主要表達(dá)于細(xì)胞核中，含量受外界氧濃度的影響；HIF-1β(相對(duì)分子質(zhì)量91000～94000)則穩(wěn)定的表達(dá)于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，不受外界環(huán)境的影響，主要與穩(wěn)定HIF-1及其二聚化有關(guān)。HIF-1α和HIF-lβ均為基本螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)轉(zhuǎn)錄因子家族成員，并具有Per-ARNT-Sim(PAS)結(jié)構(gòu)域。而HIF-1α除了以上2個(gè)結(jié)構(gòu)域之外，還具有氧依賴(lài)降解結(jié)構(gòu)域(oxygen dependent degradation domain,ODDD)以及2個(gè)轉(zhuǎn)錄活化所需的反式激活結(jié)構(gòu)域(N-TAD,C-TAD)。

HIF-1的穩(wěn)定性受脯氨酰羥化酶結(jié)構(gòu)域(prolyl hydroylase domain,PHD)蛋白的調(diào)節(jié)[3]，見(jiàn)圖1。HIF-1表達(dá)與氧分壓密切相關(guān)。在正常氧濃度下，HIF-1α很不穩(wěn)定，通常其半衰期<5min，容易被降解，因此，常氧條件下，HIF-1通常不起轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。在這個(gè)過(guò)程中，PHD對(duì)HIF-1α中的脯氨酸殘基402和564進(jìn)行氧依賴(lài)的羥基化，致使其與腫瘤抑制蛋白VHL結(jié)合，進(jìn)而通過(guò)氧依賴(lài)降解結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的泛素蛋白酶體被降解，ARD1乙酰基轉(zhuǎn)移酶對(duì)賴(lài)氨酸殘基532的乙?；部纱龠M(jìn)HIF-1α與VHL的結(jié)合。

圖1 HIF-1結(jié)構(gòu)及調(diào)節(jié)過(guò)程[4]Fig.1 HIF-1 structure and regulation process[4]

而在相對(duì)缺氧條件下，PHD活化受抑制，組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶p300與CREB結(jié)合蛋白(CREB binding protein,CBP)與未經(jīng)羥基化的HIF-1α結(jié)合，致HIF-1α不能被降解，從而在細(xì)胞核內(nèi)大量積聚，與HIF-lβ結(jié)合形成HIF-l，與低氧反應(yīng)元件(hypoxic response element,HRE)結(jié)合后啟動(dòng)相關(guān)低氧基因的表達(dá)。HIF-1的常見(jiàn)靶基因有血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin,EPO)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和糖酵解酶等[5]。在HeLa細(xì)胞中，缺氧4h后，HIF-1α的表達(dá)在氧濃度為0.5%時(shí)達(dá)到最大，在1.5%～2%時(shí)達(dá)到最大值的一半[6]。HIF-1的DNA結(jié)合活性隨氧濃度的降低而呈指數(shù)增加，決定了HIF-1的DNA結(jié)合活性水平[7]。

2 HIF-1與卵泡結(jié)構(gòu)的關(guān)系

2.1 HIF-1與各級(jí)卵泡發(fā)育

卵泡的發(fā)育始于胎兒(人類(lèi))或新生兒(嚙齒類(lèi)動(dòng)物)，此時(shí)原始卵泡形成[8]。一旦卵泡啟動(dòng)生長(zhǎng)，激活的原始卵泡，包括卵母細(xì)胞及其周?chē)囊粚颖馄降念w粒細(xì)胞，發(fā)育成初級(jí)、次級(jí)并最終發(fā)育成有腔卵泡。卵泡發(fā)育和排卵與卵泡分泌功能、完善的血管網(wǎng)絡(luò)發(fā)育密切相關(guān)。在這個(gè)過(guò)程中，腔前卵泡的發(fā)育依賴(lài)于細(xì)胞因子及顆粒細(xì)胞。當(dāng)發(fā)育為有腔卵泡時(shí)，顆粒細(xì)胞及血管系統(tǒng)進(jìn)一步發(fā)育，卵泡腔形成并擴(kuò)大。

Boonyaprakob等[9]發(fā)現(xiàn)，HIF-1在優(yōu)勢(shì)卵泡中的表達(dá)水平高于閉鎖前卵泡，且在閉鎖卵泡中幾乎沒(méi)有HIF-1 mRNA的表達(dá)，提示HIF在卵泡發(fā)育中可能起著重要作用。杜學(xué)海等[10]發(fā)現(xiàn)，HIF-1α在初級(jí)卵泡和次級(jí)卵泡內(nèi)表達(dá)不顯著，只有當(dāng)卵泡發(fā)育至有腔卵泡時(shí)，HIF-1α才開(kāi)始呈顯著表達(dá)，且隨著卵泡腔增大，其表達(dá)量呈增加趨勢(shì)，推測(cè)為卵泡腔增大后卵母細(xì)胞血供減少，缺氧的環(huán)境誘導(dǎo)HIF-1表達(dá)的增加。Kim等[11]發(fā)現(xiàn)，對(duì)超促排卵小鼠使用HIF抑制劑棘霉素，在注射HCG 10h后HIF-1α表達(dá)明顯降低，11h 后即卵泡即將破裂時(shí)幾乎檢測(cè)不到，注射HCG 20h后仍有大量成熟卵泡未破裂。以上研究均提示，HIF-1α為調(diào)節(jié)排卵的關(guān)鍵因子。

2.2 HIF-1與顆粒細(xì)胞分化及卵丘發(fā)育

人卵泡液的氧濃度為1.3%～5.5%[12]。顆粒細(xì)胞是卵泡內(nèi)的主要細(xì)胞類(lèi)型，具有改變其形態(tài)和功能以適應(yīng)和支持發(fā)育中的卵母細(xì)胞的作用。在卵泡發(fā)育過(guò)程中，顆粒細(xì)胞逐漸分化為圍繞卵泡壁的壁顆粒細(xì)胞以及圍繞卵母細(xì)胞的卵丘細(xì)胞。由于卵母細(xì)胞表面缺乏促性腺激素受體，因此卵母細(xì)胞生發(fā)泡的破裂依賴(lài)于FSH與卵丘顆粒細(xì)胞的結(jié)合。氧氣是卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體環(huán)境中的重要組成部分，當(dāng)卵丘細(xì)胞的發(fā)育環(huán)境受到干擾時(shí)，卵丘細(xì)胞的功能和基因表達(dá)均會(huì)發(fā)生改變。

HIF-1表達(dá)于不同發(fā)育及分化階段的顆粒細(xì)胞及卵泡中，通過(guò)與顆粒細(xì)胞表面FSH受體調(diào)控顆粒細(xì)胞分泌E2等復(fù)雜相互調(diào)節(jié)作用，而促進(jìn)不同階段卵泡的發(fā)育。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，伴隨卵泡發(fā)育，顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞相輔相成，呈共生關(guān)系[10]。在顆粒細(xì)胞的分化過(guò)程中，HIF-1表達(dá)逐漸增強(qiáng)，與卵母細(xì)胞中HIF-1表達(dá)一致，具有時(shí)間限制性。Kind等[13]的Western印跡法結(jié)果表明，HIF-1α蛋白在低氧暴露的卵丘細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。Tsafriri等[14]將未成熟卵母細(xì)胞與卵丘-顆粒細(xì)胞分別培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)二者均未生長(zhǎng)，而將二者混合培養(yǎng)時(shí)，則會(huì)與卵泡中的空間結(jié)構(gòu)相似，主動(dòng)形成縫隙連接，這顯著提高了卵母細(xì)胞的成熟率。Shiratsuki等[15]在對(duì)牛的顆粒細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)時(shí)，分別將其分為低氧組(5%)和高氧組(21%)，在培養(yǎng)24h后，低氧組顆粒細(xì)胞HIF-1基因和蛋白表達(dá)均高于高氧組。此外，Shiratsuki等[15]還檢測(cè)了HIF-1α相關(guān)基因的表達(dá)。在低氧條件下培養(yǎng)的GCs中，140個(gè)HIF-1調(diào)控基因中有39.23%的表達(dá)顯著增加，而7.25%的基因表達(dá)降低。Zhang等[16]的免疫組織化學(xué)和Western印跡法分析結(jié)果顯示，HIF-1α在顆粒細(xì)胞中有特異性表達(dá)，其可能是通過(guò)調(diào)節(jié)增殖細(xì)胞核抗原的表達(dá)來(lái)促進(jìn)卵泡發(fā)育。以上研究結(jié)果均表明，HIF-1α可能通過(guò)調(diào)節(jié)卵巢顆粒細(xì)胞增殖與分化來(lái)參與卵泡發(fā)育。

3 HIF-1誘導(dǎo)卵泡發(fā)育的作用機(jī)制

3.1 PI3K/AKT-mTOR通路

在細(xì)胞增殖過(guò)程中，蛋白激酶B(protein kinase,AKT)和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶點(diǎn)(manmanlian target of rapamycin,mTOR)信號(hào)級(jí)聯(lián)是有力的調(diào)節(jié)因子[17]。AKT通過(guò)結(jié)節(jié)性硬化癥復(fù)合物2(turberous sclerosis complex,TSC2)的磷酸化上調(diào)mTOR復(fù)合物1(mTORC1)的活性[18]。mTORC1激酶活性通過(guò)磷酸化靶蛋白如p70S6激酶(P70S6K)和真核細(xì)胞翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1(4E-BP1)來(lái)刺激蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞生長(zhǎng)。AKT還強(qiáng)烈誘導(dǎo)細(xì)胞中的糖酵解酶活性[19]，提示AKT-mTOR和糖酵解活性增高可能有助于GCs在低氧條件下的細(xì)胞增殖。Zhang等[20]的研究表明，PI3K/mTOR通路的激活增加了牛黃體細(xì)胞中HIF-1α的穩(wěn)定性和VEGF的表達(dá)。Shiratsuki等[15]認(rèn)為缺氧誘導(dǎo)的HIF-1激活通過(guò)VEGF增強(qiáng)AKT-mTOR信號(hào)，從而激活顆粒細(xì)胞增殖。也有研究報(bào)道，缺氧通過(guò)PI3K激活A(yù)KT來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，而PI3K是通過(guò)胰島素樣生長(zhǎng)因子和促性腺激素刺激牛顆粒細(xì)胞激活的[21]，具體機(jī)制見(jiàn)圖2。

3.2 FSH/VEGF對(duì)HIF-1的調(diào)節(jié)

FSH通過(guò)G蛋白偶聯(lián)的FSH受體發(fā)揮作用，為卵泡成熟提供主要刺激，使卵泡從腔前狀態(tài)成熟到排卵前狀態(tài)[22-24]。FSH與其受體結(jié)合導(dǎo)致cAMP水平升高。當(dāng)cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白p300被募集到其C末端時(shí)，誘導(dǎo)HIF-1表達(dá)。此過(guò)程不僅需要PI3K/AKT介導(dǎo)的哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶標(biāo)的激活[25]，同時(shí)需要Forkhead轉(zhuǎn)錄因子[26]和MDM2的磷酸化。HIF-1與靶基因(如促紅細(xì)胞生成素、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、各種糖酵解酶、VEGF受體flt-1和VEGF)在低氧濃度下與共同的缺氧反應(yīng)元件(core-ACGTG-)結(jié)合，從而激活其活性,而這一過(guò)程也可通過(guò)激活PD98059敏感的蛋白(激酶)活性直接實(shí)現(xiàn)[27]，具體機(jī)制見(jiàn)圖2。

圖2 HIF-1參與卵泡發(fā)育機(jī)制圖Fig.2 The mechanism of HIF-1 involvement in follicular development

Zhou等[28]的研究表明，體內(nèi)、外注射卵泡刺激素均可明顯增加HIF-1α的表達(dá)。原始卵泡及早期腔前卵泡均無(wú)獨(dú)立的血管系統(tǒng)，而是依賴(lài)周?chē)|(zhì)中的血管。伴隨著卵泡的發(fā)育，竇狀卵泡逐漸形成個(gè)性化的血管供應(yīng)，而這一過(guò)程主要受VEGF調(diào)節(jié)。Fisher等[29]的研究表明，生長(zhǎng)中的卵泡(慢生長(zhǎng)組和快生長(zhǎng)組)產(chǎn)生大量的VEGF，特別是在卵泡腔形成后，而無(wú)生長(zhǎng)卵泡則未檢測(cè)到VEGF。

3.3 其它激素對(duì)HIF-1的調(diào)節(jié)

HIF-1的表達(dá)同時(shí)受到其他激素的調(diào)節(jié)[30]。研究表明，hCG為卵巢HIF-1蛋白豐度的重要調(diào)節(jié)因子[1]。在低氧狀態(tài)下，用hCG刺激卵泡，結(jié)果表明，HIF-1蛋白水平明顯增加。當(dāng)Hep3B細(xì)胞在低氧條件下培養(yǎng)時(shí)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-1也能刺激HIF-1水平升高，誘導(dǎo)VEGF mRNA豐度增加[31]。雖然缺氧被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)HIF-1反應(yīng)的主要誘因，但其他刺激，如炎癥細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子同樣可能誘導(dǎo)常氧細(xì)胞中HIF-1及其靶基因的表達(dá)[32-35]。

4 HIF-1在臨床診斷和治療中的應(yīng)用

目前對(duì)HIF-1的研究集中在基礎(chǔ)研究方面，在臨床應(yīng)用方面，研究主要涉及腫瘤診治中的應(yīng)用[36]，與卵泡發(fā)育障礙的相關(guān)性報(bào)道較少。

4.1 HIF-1表達(dá)與卵巢儲(chǔ)備功能

劉春喜等[37]的研究發(fā)現(xiàn)，多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)患者血清中HIF-1α表達(dá)上調(diào)，卵巢儲(chǔ)備功能下降者則呈低表達(dá)，故認(rèn)為，HIF-1α的表達(dá)水平可以用于卵巢儲(chǔ)備功能的預(yù)測(cè)，其作用機(jī)制尚不清楚，推測(cè)其與促性腺激素、雌激素、低氧環(huán)境之間的復(fù)雜相互調(diào)節(jié)機(jī)制相關(guān)[2]。

4.2 HIF-1與卵巢早衰

在小鼠生理性卵巢早衰模型中，隨著超促排卵及臭氧吸入，卵巢儲(chǔ)備功能下降，竇狀卵泡缺氧程度加重，而引起氧化應(yīng)激及HIF-1α增高。故推測(cè)，HIF-1α的表達(dá)量可作為預(yù)測(cè)卵巢早衰的指標(biāo)之一[38]，HIF-1α可能通過(guò)調(diào)節(jié)卵泡中血管發(fā)育而參與卵泡發(fā)育過(guò)程。

4.3 HIF-1與超促排卵

近年來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)表明，缺氧與超促排卵所獲卵子的質(zhì)量關(guān)系密切。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，HIF-1α表達(dá)量與卵子質(zhì)量呈反比[38]。應(yīng)用FSH對(duì)小鼠進(jìn)行超促排卵時(shí)，由于多個(gè)卵泡發(fā)育致單個(gè)卵泡周?chē)髁繙p少，局部氧濃度降低，使HIF-1α大量積聚，影響卵子的減數(shù)分裂，從而導(dǎo)致卵母細(xì)胞非整倍體發(fā)生率升高，降低了卵子質(zhì)量[39-40]。London等[41]用克羅米芬對(duì)小鼠進(jìn)行促排卵時(shí)，也發(fā)現(xiàn)了卵母細(xì)胞非整倍體概率升高。Gao等[42]對(duì)67名IVF助孕患者的研究結(jié)果顯示，血清及卵泡液中的VEGF水平與卵母細(xì)胞質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)，其原因可能是促排卵過(guò)程中卵泡供氧不足，導(dǎo)致HIF-1表達(dá)增加，VEGF代償性升高，使缺氧卵泡對(duì)促性腺激素反應(yīng)性減弱，造成卵母細(xì)胞成熟受阻[43]。據(jù)上，HIF-1α表達(dá)量可作為促排治療中，卵母細(xì)胞質(zhì)量的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。

4.4 HIF-1在卵泡發(fā)育障礙治療中的應(yīng)用

張鴻升等[44]對(duì)脊髓損傷大鼠進(jìn)行電針干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，HIF-1α及VEGF表達(dá)均上調(diào)，表明其在神經(jīng)損傷再生修復(fù)中可能起著重要作用。雷公藤多苷致卵泡發(fā)育障礙大鼠模型中，促凋亡因子FOXO3a表達(dá)升高，而HIF-α、IGF-1R表達(dá)則下降，補(bǔ)腎活血中藥復(fù)方新加歸腎丸可能通過(guò)上調(diào)HIF-1α的表達(dá)，下調(diào)FOXO3a的表達(dá)，從而抑制卵泡過(guò)度閉鎖，促進(jìn)卵泡正常生長(zhǎng)發(fā)育[45]。有望通過(guò)檢測(cè)卵泡發(fā)育過(guò)程中HIF-1的變化，預(yù)測(cè)卵巢功能障礙性疾病，從而施行中西藥結(jié)合的干預(yù)治療。

5 展 望

HIF-1參與各級(jí)卵泡的發(fā)育及排卵過(guò)程，然而卵泡發(fā)育的過(guò)程為多因素參與的復(fù)雜生理過(guò)程，卵巢內(nèi)的激素變化如何調(diào)節(jié)低氧分子機(jī)制以及二者如何發(fā)揮相互作用，尤其是臨床應(yīng)用方面仍待進(jìn)一步研究。解決以上問(wèn)題，有助于全面理解卵泡發(fā)育、排卵過(guò)程及相關(guān)的病理生理過(guò)程，從而為HIF-1的臨床應(yīng)用提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。