羅軼瑋，符雪蓮，馬 鉆，王愷京，李芳漪，陸 英

(1.同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院全科教研室，上海 200120；2.同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，上海 200120)

大腸癌(colorectal cancer,CRC)是世界排名第4位致死性癌癥，近年來發(fā)病率和死亡率都在逐漸上升[1]。在我國(guó)，大腸癌患者的中位發(fā)病年齡比歐美發(fā)達(dá)國(guó)家提前約10年，且死亡率也高于世界平均水平。大腸癌的治療仍是以早期發(fā)現(xiàn)并手術(shù)切除為主，而大腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移后的治療手段仍有限，目前的靶向治療藥物僅對(duì)不到20%的轉(zhuǎn)移性大腸癌有作用[2-3]?？梢?，發(fā)現(xiàn)大腸癌靶向治療的新靶點(diǎn)將具有非常重要的意義?；蛐酒?、蛋白芯片和近年來對(duì)腫瘤代謝組學(xué)的研究均是找尋腫瘤標(biāo)志物和新的靶向治療的重要手段[4-5]。

腫瘤細(xì)胞的快速增殖需要大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其中氨基酸是蛋白質(zhì)和核酸合成的必需物質(zhì)。但是氨基酸不能直接穿過細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)，需要通過胞膜上特異的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白攝取后才能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)被生物利用，因此不同細(xì)胞根據(jù)對(duì)不同氨基酸的需求，細(xì)胞表面表達(dá)的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平也不同[6]。最近的研究已發(fā)現(xiàn)多個(gè)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在不同腫瘤細(xì)胞中表達(dá)異常。其中氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SLC6A14可以轉(zhuǎn)運(yùn)18種氨基酸，在健康成人組織中幾乎檢測(cè)不到，但在部分實(shí)體腫瘤中表達(dá)明顯增加，如胰腺癌、三陰性乳腺癌等[7-8]。雖然，Gupta等[9]的研究發(fā)現(xiàn)SLC6A14在大腸癌中表達(dá)升高，但是對(duì)于SLC6A14在大腸癌中的生物學(xué)功能及臨床意義未知。因此本研究中通過檢測(cè)SLC6A14在CRC組織樣本中的表達(dá)水平并分析其與臨床病理特征的關(guān)系，以及阻斷SLC6A14對(duì)CRC細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，旨在進(jìn)一步明確SLC6A14作為CRC治療靶點(diǎn)的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年11月—2019年5月于同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院行手術(shù)治療的大腸癌患者為研究對(duì)象納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理學(xué)診斷確診為大腸癌；術(shù)前未接受過任何放療、化療；臨床資料完整；按倫理要求患者簽署知情同意書。本項(xiàng)目經(jīng)同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(DF2016-003)。共收集108例大腸癌癌組織?；颊哔Y料為：男性60例，女性48例；年齡35～77歲，中位年齡為54歲；臨床分期Ⅰ期16例，Ⅱ期36例，Ⅲ期51例，Ⅳ期5例。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及主要試劑

人大腸癌細(xì)胞株HT-29和SW620購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)；胎牛血清(FBS)、L-15培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，McCOY’s 5A培養(yǎng)基、SLC6A14抑制劑α-甲基色氨酸(α-methyltryptophan,α-MT)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。HT-29大腸癌細(xì)胞接種于含10%FBS、青霉素100IU/mL、鏈霉素100μg/mL的McCOY’s 5A培養(yǎng)基中，SW620大腸癌細(xì)胞接種于含10%FBS、青霉素100IU/mL、鏈霉素100μg/mL的L-15培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每2～3d更換培養(yǎng)基。

1.3 總RNA提取和實(shí)時(shí)定量熒光PCR

手術(shù)切除的新鮮大腸癌組織及癌旁組織置于RNAlater?Solution(美國(guó)Ambion公司)溶液中保存。組織塊加入TRIzol(美國(guó)Invitrogen公司)裂解后提取總RNA。采用日本TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒，總RNA 0.5μg，總體積為10uL。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，37℃，15min。反轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng)，85℃，5s。將得到的RT反應(yīng)液加入到下一步的實(shí)時(shí)定量熒光PCR反應(yīng)體系中。采用TaKaRa Real Time PCR試劑盒，ABI 7500 Real Time PCR儀，根據(jù)說明書推薦的反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列如下。以GAPDH為內(nèi)參，正向引物為5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGTATTG-3′，反向引物為5′-CTCCTGGAAGATGGTGATGGGAT-3′。SL-C6A14正向引物：5′-TGGATTTATGGAGGG-AA-CAGATT-3′；反向引物：5′-ATCATACACCAGC-CTAAAGCAAC-3′。采用相對(duì)定量法(ΔΔCt法)分析mRNA在大腸癌癌組織和癌旁組織中的表達(dá)差異：ΔCt=Ct(SLC6A14)-Ct(GAPDH)，ΔΔCt=ΔCt癌組織-ΔCt癌旁組織組，以N=2-ΔΔCt表示癌組織中SLC6A14的mRNA表達(dá)水平相對(duì)于癌旁組織的改變倍數(shù)。大于1.5倍認(rèn)為表達(dá)增高，低于2/3倍認(rèn)為表達(dá)降低。

1.4 免疫組織化學(xué)染色及H值計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)

手術(shù)切除的新鮮癌組織樣本置于10%的中性甲醛溶液中，4℃保存，制成蠟塊，切片后用于免疫組化染色。組織切片脫蠟后，在修復(fù)溶液(丹麥Dako公司)中95℃加熱20min完成抗原修復(fù)。經(jīng)3% H2O2封閉，加入SLC6A14抗體(1∶200，美國(guó)Abcam公司，兔抗人)4℃孵育過夜。PBS洗滌3次，每次15min，然后用辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)連接的鼠抗兔IgG二抗(美國(guó)Santa Cruz公司)室溫孵育30min。最后，使用二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)底物試劑盒進(jìn)行顯色。結(jié)果用Quant Center軟件在Pannoraminc查看器(3D HISTECH，Pannoramic MIDI)上掃描。組織化學(xué)評(píng)分(H評(píng)分)按下式計(jì)算[10]：H評(píng)分=(弱染色細(xì)胞百分比×1)+(中等強(qiáng)度染色細(xì)胞百分比×2)+(強(qiáng)染色強(qiáng)度細(xì)胞百分比×3)。

1.5 Western印跡法

HT-29、SW620和Huh7細(xì)胞裂解在RIPA緩沖液中，蛋白濃度通過BCA分析測(cè)定(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。取30μg總蛋白經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。室溫下經(jīng)5%牛奶(g/mL)封閉1h，加入抗SLC6A14抗體(1∶1000，英國(guó)Abcam公司，兔抗人)，4℃孵育過夜。β-actin(1∶1000，美國(guó)Santa-Cruz公司，鼠抗人)作為內(nèi)參。PBST緩沖液洗滌3次，每次15min。用HRP標(biāo)記二抗(1∶2000，美國(guó)Santa-Cruz公司，鼠抗兔IgG和山羊抗鼠IgG)室溫下孵育1h。使用Odyssey成像系統(tǒng)(美國(guó)LiCOR公司)檢測(cè)，ImageJ軟件分析蛋白灰度。

1.6 RNAi

使用RNA干擾技術(shù)下調(diào)HT-29和SW620細(xì)胞中SLC6A14的表達(dá)，將細(xì)胞接種于六孔板，每孔接種25×104個(gè)細(xì)胞。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱過夜；使用Lipofectamine-2000 (購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司)轉(zhuǎn)染試劑，按照說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前1h將培養(yǎng)基更換為Opti-MEM無(wú)血清培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)6h后，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h。

1.7 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

將siRNA轉(zhuǎn)染后的HT-29和SW620細(xì)胞，用0.25%胰酶消化，離心吹打成單細(xì)胞懸液，用紅細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，取平均值。在96孔板中接種細(xì)胞懸液(100μL/孔，約1000個(gè)細(xì)胞)。未轉(zhuǎn)染的對(duì)照組細(xì)胞分別加入不同濃度的SLC6A14抑制劑α-MT(分別為0.62、1.25、2.5mmol/L)。在加藥后0、24、48、72h，更換為無(wú)血清培養(yǎng)基200μL，向每孔加入10μL MTT試劑(美國(guó)Sigma公司)，將培養(yǎng)板放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2～4h，觀察顏色變化情況，使用酶標(biāo)儀測(cè)定570nm處的吸光度(A570)。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將HT-29和SW620細(xì)胞接種于六孔板，每孔接種25×104個(gè)細(xì)胞，體積為1.5mL，分別加入終濃度為0.62、1.25、2.5mmol/L的α-MT。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后收集細(xì)胞，使用Annexin-Ⅴ/PI凋亡試劑盒(美國(guó)BD公司)：每管加400μL Binding Buffer，5μL Annexin-Ⅴ-FITC和5μL PI。混勻，避光孵育15min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡情況。流式細(xì)胞儀激發(fā)光波長(zhǎng)用 488nm，用一波長(zhǎng)為515nm的通道檢測(cè)FITC熒光，另一波長(zhǎng)大于560nm的濾器檢測(cè)PI，數(shù)據(jù)分析使用Diva軟件。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 SLC6A14 mRNA在大腸癌組織中高表達(dá)

通過實(shí)時(shí)定量熒光PCR方法檢測(cè)35對(duì)大腸癌及配對(duì)癌旁組織中SLC6A14 mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示SLC6A14在癌組織中表達(dá)是癌旁組織的(3.98±1.1)倍,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；SLC6A14在68.57%(24/35)的大腸癌組織中mRNA表達(dá)水平高于癌旁組織1.5倍以上，見圖1。

圖1 SLC6A14 mRNA在大腸癌組織中的表達(dá)特征Fig.1 Expression of SLC6A14 mRNA in colorectal cancer*P<0.05

2.2 SLC6A14在大腸癌細(xì)胞株中蛋白表達(dá)增高

通過Western印跡法，檢測(cè)SLC6A14在大腸癌細(xì)胞株HT-29、SW620和肝癌細(xì)胞株Huh7中的蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示SLC6A14在HT-29和SW620中的表達(dá)明顯高于Huh7。通過灰度計(jì)算，SLC6A14在HT-29和SW620中的蛋白表達(dá)強(qiáng)度分別是Huh7的(4.31±1.46)倍和(3.14±0.93)倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 SLC6A14在大腸癌細(xì)胞株中的蛋白表達(dá)特征Fig.2 Expression ofSLC6A14 protein in colorectal cancer cell lines*P<0.05

2.3 SLC6A14蛋白表達(dá)強(qiáng)度與大腸癌臨床病理特征的關(guān)系

通過免疫組化染色，檢測(cè)SLC6A14在大腸癌組織中的表達(dá)強(qiáng)度，經(jīng)H值積分半定量分析，結(jié)果顯示SLC6A14表達(dá)強(qiáng)度與臨床分期密切相關(guān)，分期越往后，SLC6A14表達(dá)越強(qiáng)(P<0.05)，見表1和圖3。而SLC6A14表達(dá)強(qiáng)度與年齡、性別、腫瘤大小之間的關(guān)系差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 SLC6A14在大腸癌組織中的表達(dá)強(qiáng)度與患者臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 Relationship between clinicopathological characte-ristics and SLC6A14 expression in patients with CRC

圖3 SLC6A14在不同分期CRC患者癌組織中的表達(dá)Fig.3 The expression of SLC6A14 at the protein level in CRC cancer tissues with different clinical stages

2.4 SLC6A14對(duì)大腸癌細(xì)胞增殖能力的影響

為了研究SLC6A14對(duì)大腸癌細(xì)胞增殖能力的影響，本研究使用siRNA下調(diào)HT-29和SW620細(xì)胞中SLC6A14的表達(dá)，或使用特異性抑制劑α-MT(0.62、1.25和2.5mmol/L 3個(gè)濃度)抑制SLC6A14的功能，通過MTT法檢測(cè)下調(diào)或抑制SLC6A14的表達(dá)或功能對(duì)大腸癌細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示，下調(diào)或抑制SLC6A14能明顯抑制HT-29、SW620的增殖能力(P<0.05)，并且隨著α-MT濃度的增加，抑制效果也增加，見圖4。

圖4 下調(diào)SLC6A14的表達(dá)或抑制SLC6A14功能對(duì)大腸癌細(xì)胞增殖的影響Fig.4 The role of SLC6A14 in the proliferation of CRC cancer cell lines

2.5 SLC6A14對(duì)大腸癌細(xì)胞凋亡的影響

進(jìn)一步研究SLC6A14對(duì)大腸癌細(xì)胞凋亡的影響，通過使用不同濃度SLC6A14抑制劑α-MT(0.62、1.25、2.5mmol/L)給藥24h后，使用AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果顯示，抑制HT-29、SW620中SLC6A14后，細(xì)胞凋亡(Annexin-Ⅴ+/PI-)增加，存活細(xì)胞(Annexin-Ⅴ-/PI-)明顯減少，P<0.05，見圖5；并且隨著α-MT濃度的增加，凋亡細(xì)胞明顯增加(P<0.05)。

圖5 SLC6A14抑制劑對(duì)大腸癌細(xì)胞凋亡的影響Fig.5 The role of SLC6A14 in the apoptosis of CRC cancer cell lines*P<0.05

3 討 論

由于快速增殖的癌細(xì)胞需要吸收大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來支持其明顯增加的生物合成需求，從而在其細(xì)胞表面表達(dá)大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，因此代謝重編程現(xiàn)在被認(rèn)為是癌細(xì)胞的一個(gè)重要標(biāo)志[11-13]。選擇在惡性腫瘤中高表達(dá)而在正常組織中低表達(dá)甚至不表達(dá)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是抗癌治療的理想靶點(diǎn)[14]。氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SLC6A14，又名ATB0,+，具有最廣泛的轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的能力：轉(zhuǎn)運(yùn)20種基本氨基酸中的18種，包括所有中性氨基酸和兩種陽(yáng)離子氨基酸，覆蓋所有必需氨基酸。SLC6A14是Na+/Cl-偶聯(lián)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，有3種不同的驅(qū)動(dòng)力參與該轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)過程：Na+梯度、Cl-梯度和膜電位。由于其轉(zhuǎn)運(yùn)功能與Na+和Cl-緊密偶合，Na+∶Cl-∶氨基酸的化學(xué)轉(zhuǎn)運(yùn)比為2∶1∶1，因此SLC6A14介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)幾乎是單向的。從理論上講，3種不同的驅(qū)動(dòng)力參與SLC6A14的轉(zhuǎn)運(yùn)功能，能使其將細(xì)胞內(nèi)的氨基酸濃縮到約1/1000。已有研究證實(shí)在胰腺癌、大腸癌和雌激素受體陽(yáng)性(ER+)乳腺癌中表達(dá)明顯增加，但在健康成人組織中表達(dá)很低甚至檢測(cè)不到，因此SLC6A14有可能是一種癌癥特異性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[8,15]。α-MT是一種靶向SLC6A14的競(jìng)爭(zhēng)性小分子阻斷劑，研究表明α-MT是SLC6A14的轉(zhuǎn)運(yùn)底物，轉(zhuǎn)運(yùn)過程也依賴于Na+/Cl-，Na+/Cl-/α-MT化學(xué)轉(zhuǎn)運(yùn)比亦為2∶1∶1。在乳腺癌異種動(dòng)物移植模型中，已證實(shí)能明顯抑制SLC6A14的轉(zhuǎn)運(yùn)功能，并且經(jīng)α-MT處理后能明顯抑制SLC6A14陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞株的體外和小鼠體內(nèi)異種移植瘤的增殖，但是對(duì)SLC6A14陰性乳腺癌細(xì)胞株的增殖沒有影響[16]。因此這些結(jié)果都提示SLC6A14能否成為潛在的腫瘤靶點(diǎn)取決于其在腫瘤中的表達(dá)情況。

本研究表明，在大腸癌組織中，SLC6A14的mRNA和蛋白水平明顯升高，SLC6A14的表達(dá)水平與大腸癌的臨床分期密切相關(guān)，腫瘤患者分期越往后，SLC6A14的表達(dá)水平越高。在人大腸癌細(xì)胞株中亦證實(shí)SLC6A14在大腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)明顯高于肝癌細(xì)胞株，但是SLC6A14在兩種大腸癌細(xì)胞株HT29和SW620中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨后，通過siRNA和α-MT下調(diào)及抑制SLC6A14后，發(fā)現(xiàn)大腸癌細(xì)胞的增殖能力明顯受到抑制，凋亡細(xì)胞明顯增多，并且這種變化與α-MT呈濃度依賴性，但α-MT的抑制能力與SLC6A14的表達(dá)程度之間未顯示有明顯相關(guān)性。綜合上述結(jié)果，本研究認(rèn)為SLC6A14可能是治療大腸癌的有效分子靶點(diǎn)。

阻斷營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是治療癌癥的一種新的方法——“餓死腫瘤細(xì)胞”[17]，因此引領(lǐng)人們?nèi)ふ野邢騍LC6A14，但是毒性要較小的小分子抑制劑。α-MT已成功應(yīng)用于SLC6A14陽(yáng)性乳腺癌異種移植動(dòng)物模型，并能明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)。本結(jié)果顯示α-MT抑制了大腸癌細(xì)胞系(HT-29 和SW620)的增殖，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡，并且這種抑制增殖的能力與α-MT的濃度成正相關(guān)。然而，α-MT是否可以作為大腸癌治療的新方法，還需要進(jìn)一步研究SLC6A14在多種癌癥中的作用。另外，雖然單一使用α-MT取得了良好的效果，但聯(lián)合用藥是否會(huì)獲得更大的抑制效果以及如何防止抑制劑耐藥性的產(chǎn)生還需要更多的實(shí)驗(yàn)研究和臨床試驗(yàn)加以論證。

綜上所述，本研究表明，SLC6A14在大腸癌組織及細(xì)胞株中表達(dá)增加，通過siRNA或抑制劑α-MT 阻斷SLC6A14可降低大腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)能力。因此，SLC6A14可能成為大腸癌的新治療靶點(diǎn)，同時(shí)為大腸癌的防治提供新的思路。