王慶亮,趙艷峰,蔣 燕,宋 曉,楊富鈞,姜格寧
(同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院胸外科,上海 200433)
目前肺癌是我國發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤,其中肺腺癌是最常見的一種病理類型[1]。隨著人們對生物信息學(xué)、腫瘤基因組學(xué)的研究日益深入,基因靶向治療用于治療肺癌已成世界研究熱點(diǎn),尋找腫瘤細(xì)胞相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)控基因已經(jīng)成為攻克癌癥的重要方向,具有重要的臨床潛在利用價值[2]。
TPX2是由Wittmann等[3]于1998年首次在非洲爪蟾蜍卵發(fā)現(xiàn)的一種新型微管相關(guān)蛋白,被命名為XKlP2靶蛋白(targeting protein for xenopus kinesin-like protein 2,TPX2)。該基因參與有絲分裂過程中中心體的成熟和紡錘體的形成[4]。研究發(fā)現(xiàn),TPX2在許多癌癥的組織中高表達(dá)[5-7]。但是TPX2在肺腺癌的研究中相關(guān)研究報道較少。本研究利用Oncomine、cBioportal、UALCAN、GEPIA(Gene Expression Profiling Interactive Analysis)、Kaplan-Meier Plotter以及OncoLnc數(shù)據(jù)庫分析TPX2在肺腺癌中的表達(dá)和預(yù)后關(guān)系,以期為肺腺癌基因靶向治療提供理論支持。
Oncomine數(shù)據(jù)庫[8](https:∥www.oncomine.org/)是在線腫瘤微陣列數(shù)據(jù)庫,用于確定肺腺癌中TPX2的轉(zhuǎn)錄水平。評估TPX2基因在肺腺癌中的共表達(dá)譜并顯示為熱圖。提前使用郵箱注冊O(shè)ncomine數(shù)據(jù)庫賬號,獲取使用權(quán)限,隨后根據(jù)研究需要,設(shè)定具體篩選的條件。本研究具體篩選條件如下。(1) gene條目:輸入TPX2;(2) cancer type條目:選擇CancervsNormal Analysis;(3) Cancer Type條目:選擇Lung Cancer;(4) Analysis Type條目,P-VALUE設(shè)定0.0001,F(xiàn)OLD CHANGE=2,GENE RANK=10%;然后對數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索分析。
人類蛋白質(zhì)圖譜(Human Protein Atlas),簡稱HPA數(shù)據(jù)庫[9](https:∥www.proteinatlas.org/),是一個綜合性人類蛋白質(zhì)組學(xué)門戶網(wǎng)站。使用26000多種高度特異性的抗體,采用免疫檢測技術(shù)(免疫印跡、免疫熒光和免疫組化),詳細(xì)地檢測了每種蛋白在76種細(xì)胞系、44種人類正常組織和17種腫瘤組織中的表達(dá)情況,該數(shù)據(jù)庫提供了17000多種人類蛋白質(zhì)在組織和細(xì)胞及血液中的分布信息。
UALCAN網(wǎng)站[10](http:∥UALCAN.path.uab.edu/index.html)是一種交互式門戶網(wǎng)站,網(wǎng)站數(shù)據(jù)主要來源是癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫??梢允褂迷摂?shù)據(jù)庫分析基因在腫瘤和正常樣本中的差異性表達(dá),同時可以比較不同腫瘤亞組臨床病例特征,如腫瘤分期、病理亞型、腫瘤分子亞型、患者年齡、體重、吸煙史和種族等與基因表達(dá)的相關(guān)性,在本研究中使用該數(shù)據(jù)庫分析TPX2 mRNA和肺腺癌患者臨床病理特征的相關(guān)性。
cBio Cancer Genomics Portal數(shù)據(jù)庫[11]提供了研究分析癌癥相關(guān)基因數(shù)據(jù)的可視化工具,cBioPortal包含了多個數(shù)據(jù)庫,比如TCGA數(shù)據(jù)庫和國際癌癥基因組聯(lián)盟(International Cancer Genome Consortium,ICGC)等共283項(xiàng)大型腫瘤相關(guān)基因表達(dá)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。cBioPortal可以通過可視化的形式展示癌癥研究樣本的基因組數(shù)據(jù)。登陸cBioPortal官網(wǎng)(http:∥www.cbioportal.org/),在數(shù)據(jù)庫檢索界面輸入具體篩選條件如下。(1) Select Studies條目:選擇Lung Cancer;(2) Lung Adenocarcinoma:選擇Broad數(shù)據(jù)庫(Cell 2012,183例樣本)、MSKCC數(shù)據(jù)庫(Science 2015,35例樣本)、TCGA(PanCancer Atlas,566例樣本)、TSP(Nature,163例樣本)、MSKCC數(shù)據(jù)庫(Cancer Discov 2017,915例樣本),共5個數(shù)據(jù)集被納入;(3) Select Molecular Profiles條目:勾選Mutation和Copy Number Alterations選項(xiàng);(4) Enter Gene:輸入TPX2,提交檢索。
Kaplan-Meier Plotter在線生存分析數(shù)據(jù)庫[12](網(wǎng)址http:∥kmplot.com)是根據(jù)已發(fā)布的微陣列的腫瘤相關(guān)數(shù)據(jù)庫使用20多類癌癥相關(guān)樣本評估54000 多個基因?qū)ι娴挠绊懙臄?shù)據(jù)集,其中最大的數(shù)據(jù)集包括乳腺癌(6234例),卵巢癌(2190例),肺癌(3452 例)和胃癌(1440例)樣本。該數(shù)據(jù)庫的基因芯片和RNA序列數(shù)據(jù)來源包括GEO、EGA和TCGA數(shù)據(jù)庫。本研究使用該數(shù)據(jù)庫分析了TPX2 mRNA表達(dá)和肺腺癌患者預(yù)后之間的關(guān)系。
OncoLnc網(wǎng)站[13](http:∥www.oncolnc.org/)是一種基于TCGA腫瘤數(shù)據(jù)庫交互式分析基因(mRNA,miRNA或lncRNA)表達(dá)和總共21種常見癌癥的生存相關(guān)性的在線工具,使用該網(wǎng)站再次驗(yàn)證TPX2基因mRNA表達(dá)與患者預(yù)后的相關(guān)性。
肺癌細(xì)胞系由本實(shí)驗(yàn)室提供。20例肺腺癌組織級配對癌旁組織樣本取自本院胸外科,患者的病理信息包含年齡、性別、病理類型、TNM分期、生存狀態(tài)及總生存時間(overall survival time,OS)。腫瘤組織經(jīng)過了兩名以上的病理學(xué)專家進(jìn)行重新閱片確定。本項(xiàng)目涉及的患者簽署了知情同意書,且項(xiàng)目已通過倫理委員會批準(zhǔn)。
胎牛血清、DMEM購自美國Thermo Fisher Scientific公司;β-actin抗體購自美國Sigma公司;TPX2抗體購自英國Abcam公司,SDS-PAGE凝膠試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司。
用PBS洗滌培養(yǎng)的肺癌細(xì)胞3次,加入RIPA細(xì)胞裂解液,置于冰上30min,然后轉(zhuǎn)移至新的EP試管中,離心(離心半徑20cm,1000r/min,10min)。取上清液并使用BCA蛋白檢測試劑盒中檢測總蛋白質(zhì)。加入50μL按比例配制好的巰基乙醇同上樣緩沖液的混合液,并100℃水浴鍋中加熱10min。取10μg蛋白用于SDS-PAGE電泳,然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。使用5%脫脂奶粉在室溫下密封1h,加入一抗(1∶1500),在4℃的振蕩器中孵育晚上,TBST洗膜3次后,加二抗(1∶5000),室溫封閉1h,繼續(xù)用TBST清洗膜3次,并使用化學(xué)發(fā)光成像分析儀分析條帶。
本研究檢索Oncomine數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)集TPX2在肺腺癌組織及正常組織中的mRNA水平表達(dá)進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示,共有8項(xiàng)數(shù)據(jù)集,每項(xiàng)研究的差異比較見圖1。
圖1 TPX2 mRNA在Oncomine數(shù)據(jù)庫不同數(shù)據(jù)集中肺腺癌和正常組織中表達(dá)對比Fig.1 Comparison of TPX2 mRNA expression in lung adenocarcinoma and normal tissues in different data sets of Oncomine database
同時對8項(xiàng)數(shù)據(jù)集檢索分析發(fā)現(xiàn),在每一項(xiàng)研究中,肺腺癌組織中的TPX2的mRNA表達(dá)水平均要顯著高于癌旁組織,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),見圖2。
圖2 TPX2 mRNA在Oncomine數(shù)據(jù)庫中表達(dá)水平分析Fig.2 TPX2 mRNA expression level analysis in Oncomine database1~8分別代表8項(xiàng)不同肺腺癌的研究數(shù)據(jù)集,紅色代表過表達(dá),藍(lán)色代表低表達(dá)
使用HPA數(shù)據(jù)庫的組織圖譜分析TPX2蛋白質(zhì)在肺腺癌組織中的表達(dá)情況。通過基因芯片分析,結(jié)果顯示TPX2在肺腺癌細(xì)胞的細(xì)胞核中表達(dá)。通過芯片結(jié)果分析TPX2在肺腺癌組織中表達(dá)情況,見圖3。
圖3 TPX2蛋白在正常肺組織及肺腺癌組織表達(dá)的免疫組織化學(xué)圖像Fig.3 Immunohistochemical image of TPX2 protein expression in normal lung tissue and lung adenocarcinoma tissue
運(yùn)用UALCAN數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證TPX2 mRNA在TCGA數(shù)據(jù)的肺腺癌組織(n=515)及正常肺組織(n=59)中的表達(dá)情況。分析顯示:相較于正常肺組織,TPX2在肺腺癌組織中的表達(dá)顯著升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001),見圖4A;同時TPX2 mRNA在女性中表達(dá)高于男性,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖4B;但TPX2的表達(dá)水平與腫瘤分期、年齡無顯著相關(guān)性,見圖4C、D。
圖4 TPX2 mRNA表達(dá)與肺腺癌患者臨床特征關(guān)系Fig.4 Relationship between TPX2 mRNA expression and clinical features of patients with lung adenocarcinoma
為了分析TPX2與肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系,利用OncoLnc數(shù)據(jù)庫對TPX2對肺腺癌患者預(yù)后的影響進(jìn)行探索,發(fā)現(xiàn)TPX2高表達(dá)不利于肺腺癌患者預(yù)后(圖5A)并利用Kaplan-Meier Plotter在線生存分析進(jìn)行了驗(yàn)證。通過Kaplan-Meier Plotter分析發(fā)現(xiàn)TPX2與肺腺癌OS(HR=1.8),F(xiàn)PS(HR=2.82),PPS(HR=1.63)均具有相關(guān)性,且差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05),見圖5B~D。
圖5 TPX2 mRNA表達(dá)與肺腺癌預(yù)后關(guān)系Fig.5 Relationship between the expression of TPX2 mRNA and the prognosis of Lung adenocarcinomaA:OncoLnc數(shù)據(jù)庫;B~D:Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫;OS:總生存時間;PPS:進(jìn)展后生存期;FPS:無進(jìn)展生存期
通過檢索cBioPortal腫瘤數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站對5個數(shù)據(jù)集中的1807個樣本進(jìn)行分析后,發(fā)現(xiàn)共有30個樣本中發(fā)生改變,總體變異率為4%,其中有16個非同義突變,TPX2拷貝數(shù)擴(kuò)增有13個樣本,1例為混合變異(圖6A)。說明TPX2基因在肺腺癌中突變頻率很低。除了突變頻率較低外,在肺腺癌中突變的另一個特征是突變位點(diǎn)分布較廣泛,突變位點(diǎn)圖如圖6B所示。隨后分析了TPX2基因突變和肺腺癌患者預(yù)后關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)TPX2基因突變對肺腺癌OS無顯著影響(P>0.05),見圖6C,但存在TPX2突變的肺腺癌患者比無TPX2突變患者的DFS更差,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖6D。
圖6 TPX2基因突變頻率及和肺腺癌預(yù)后關(guān)系Fig.6 Relationship between the gene mutation frequency of TPX2 and the prognosis of Lung adenocarcinoma
使用Western印跡法法檢測了TPX2蛋白在A549、H1650、H1299、Y82、L78、H460肺癌細(xì)胞系中檢測表達(dá)水平,結(jié)果見圖7。
圖7 Western印跡法實(shí)驗(yàn)檢測TPX2在肺癌不同細(xì)胞系中的表達(dá)水平Fig.7 Western blotting experiment to detect the expression level of TPX2 in different lung cancer cell lines
通過Image J軟件對Western印跡法圖像進(jìn)行分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在腺癌A549、H1650、H1299細(xì)胞系,鱗癌Y82、L78細(xì)胞系,大細(xì)胞癌H460細(xì)胞系中,TPX2的表達(dá)水平較高,在腺癌H1975細(xì)胞系和鱗癌H1703細(xì)胞系中TPX2的表達(dá)水平較低。相對表達(dá)量對比分析見圖8。
圖8 TPX2蛋白在肺癌不同細(xì)胞系中的相對表達(dá)量Fig.8 The relative expression of TPX2 protein in different lung cancer cell lines
在配對肺腺癌組織和癌旁組織中利用Western印跡法檢測TPX2的蛋白表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)在20例樣本檢測中,其中有15例樣本中,TPX2在肺腺癌中的表達(dá)量顯著高于癌旁組織,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖9。
圖9 TPX2蛋白在肺腺癌組織的表達(dá)情況Fig.9 Expression of TPX2 protein in lung adenocarcinomaA:Western印跡法檢測TPX2在肺腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平;B:TPX2蛋白表達(dá)情況;肺癌組和正常肺組比較,*P<0.05;N:癌旁組織;T:癌組織
肺癌是目前全世界發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一[14]。在我國,肺癌亦是如此,最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示我國2015年新發(fā)肺癌78.7萬人,約占全部癌癥新發(fā)人數(shù)的24.7%;新增肺癌死亡63.1萬,約占全部癌癥死亡人數(shù)的29.3%,其中男性多于女性[5]。吸煙、二手煙暴露和空氣污染是已確定的肺癌危險因素[15]。目前肺癌的治療仍然以手術(shù)治療為主,其次為化療、放射治療、免疫治療和中醫(yī)中藥治療及聯(lián)合治療。手術(shù)治療適用于中早期的腫瘤患者,對晚期患者手術(shù)治療效果有限,甚至?xí)?dǎo)致病情惡化。由于肺癌早起癥狀并不明顯,很多患者因此錯過最佳診斷和手術(shù)治療時機(jī)[16]。近年來,肺癌靶向基因治療和以PD-1或PD-L1抑制劑為主要代表的免疫治療,在晚期肺癌治療中,起到了重要作用,但由于有效人群較少,腫瘤容易產(chǎn)生耐藥性,且費(fèi)用高昂,治療較難普及[17-18]。
TPX2是XKLP靶蛋白,位于細(xì)胞核內(nèi),定位于人類染色體20q11.2,受細(xì)胞周期嚴(yán)格調(diào)控。TPX2是最早發(fā)現(xiàn)于爪蟾的微管相關(guān)蛋白,與人類功能蛋白具有高度同源性,相對分子質(zhì)量為100000,是XKLP2 COOH末端區(qū)域結(jié)合在微管上的媒介,參與細(xì)胞有絲分裂過程中微管形成及紡錘體功能[4]。研究發(fā)現(xiàn),TPX2在許多癌癥的組織及血清中高表達(dá),如乳腺癌、皮膚鱗狀細(xì)胞癌、前列腺癌、黑色素瘤等[19-22]。Zou等[23]研究發(fā)現(xiàn),TPX2水平與膽管癌細(xì)胞增殖、凋亡和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)。Chen等[24]的研究發(fā)現(xiàn),microRNA-1294通過直接靶向TPX2抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤增殖并增強(qiáng)其對替莫唑胺的化學(xué)敏感性。Ma等[25]研究發(fā)現(xiàn),卵巢癌2種細(xì)胞株中TPX2與PLK1存在共表達(dá)情況,敲低TPX2可抑制PLK1表達(dá),并導(dǎo)致細(xì)胞增殖及遷移能力減弱。Yao等[22]通過RT-qPCR和Western印跡法檢測TPX2基因在黑素瘤細(xì)胞系中的表達(dá),結(jié)果顯示其顯著增高。TPX2可以促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的增殖,并在裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)中得到了證實(shí)。Tomii等[5]對胃癌患者使用免疫組織化學(xué)染色和熒光實(shí)時定量反轉(zhuǎn)錄PCR分析了胃癌腫瘤和鄰近的正常組織中的RNA(mRNA)和蛋白表達(dá)情況。結(jié)果胃癌組織中TPX2的mRNA水平顯著高于匹配的鄰近正常組織,且TPX2過表達(dá)與年齡、組織學(xué)類型、腫瘤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分期和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)呈正相關(guān)。Glaser等[26]發(fā)現(xiàn),TPX2在子宮內(nèi)膜癌中高表達(dá),與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,預(yù)后和復(fù)發(fā)密切相關(guān)。Ma等[24]研究發(fā)現(xiàn),卵巢癌2種細(xì)胞株中TPX2與PLK1存在共表達(dá)情況,敲低TPX2可抑制PLK1表達(dá),并導(dǎo)致細(xì)胞增殖及遷移能力減弱,TPX2可通過調(diào)節(jié)OC細(xì)胞中的PLK1/Cdc2/CyclinB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)細(xì)胞增殖,還可以通過調(diào)節(jié)OC細(xì)胞中的PLK1/β-catenin/MMPs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來促進(jìn)細(xì)胞遷移。Feng等[20]證明在過表達(dá)miR-216b可以通過激活p53信號通路并降低TPX2基因表達(dá),能夠抑制cSCC細(xì)胞的增殖、入侵和遷移,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
研究表明,多基因的異常表達(dá)在肺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用,如p53基因,PTEN基因,Rb基因和myc基因家族[27-30]。因此,找到合適的靶目標(biāo)來控制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移對于肺癌的預(yù)防和治療極為重要。本課題組通過對多種腫瘤相關(guān)數(shù)據(jù)庫分析,本研究基于生物學(xué)方法檢索了Oncomine、HPA、cBioportal以及TCGA等數(shù)據(jù)庫,綜合分析了TPX2基因和肺腺癌的關(guān)系。本研究首先檢索Oncomine數(shù)據(jù)庫分析肺腺癌中TPX2與肺腺癌的關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)TPX2在人肺腺癌不同數(shù)據(jù)集中的表達(dá)均顯著高于正常肺組織,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。采用Kaplan-Meier Plotter分析TCGA數(shù)據(jù)庫中TPX2表達(dá)與患者生存期的關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn),高表達(dá)TPX2肺腺癌患者的生存期顯著低于TPX2低表達(dá)肺腺癌患者,高表達(dá)患者預(yù)后更差;差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。隨后通過檢索c Bioportal生物信息基因數(shù)據(jù)庫,分析TPX2的突變頻率、突變位點(diǎn),發(fā)現(xiàn)TPX2在2項(xiàng)數(shù)據(jù)集存在突變,突變頻率分別為4.06%(TCGA PanCan)和3.83%(Broad),同時研究顯示TPX2共有17個位點(diǎn)發(fā)生突變,提示TPX2與肺腺癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。TPX2蛋白在肺腺癌患者臨床組織里高表達(dá),并且TPX2蛋白的表達(dá)量可用來監(jiān)測肺腺癌復(fù)發(fā)和預(yù)后的標(biāo)志,TPX2基因可能作為未來肺腺癌患者基因治療的潛在靶點(diǎn)。