黃韜睿，王小平，王鑫*

1. 四川旅游學(xué)院烹飪學(xué)院（成都 610100）；2. 四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院（成都 610097）

硒是人體必需的微量元素，具有抗氧化、抗腫瘤、提高機(jī)體免疫力等顯著生理功能，所以維持機(jī)體中適量的硒水平能預(yù)防多種疾病，如癌癥、克山病、大骨節(jié)病等[1]。然而，從世界衛(wèi)生組織公布的數(shù)據(jù)來(lái)看，全球普遍存在缺硒的問(wèn)題，40多個(gè)國(guó)家和地區(qū)處于低硒或缺硒的狀態(tài)[2]。通過(guò)食物補(bǔ)硒是最便捷的方法，也是最值得推崇的方法[3]。國(guó)際學(xué)術(shù)組織聯(lián)合會(huì)（FAO/WHO/IAEA）建議成年男女膳食硒適宜需要量分別為40和30 μg/d[4]。長(zhǎng)期食用含硒低于0.1 mg/kg的食物會(huì)導(dǎo)致人體硒缺乏反應(yīng)癥，長(zhǎng)期食用硒高于1 mg/kg的食物則會(huì)引起硒中毒[5]。硒元素在食品中的形態(tài)主要分為無(wú)機(jī)硒和有機(jī)硒，無(wú)機(jī)硒主要包括單質(zhì)硒、硒酸鹽、亞硒酸鹽，揮發(fā)態(tài)的甲基硒和硒化氫有較大毒性[6]。有機(jī)硒主要為大分子硒和以硒代氨基酸及其衍生物形式存在的小分子硒化物。有機(jī)硒毒性遠(yuǎn)低于無(wú)機(jī)硒，生物活性更高，富含營(yíng)養(yǎng)，更有利于人體吸收[7]。

目前絕大多數(shù)食品標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于食品中硒的營(yíng)養(yǎng)和毒性分析是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。建立快速、靈敏、準(zhǔn)確的方法檢測(cè)食品、藥品及保健品等產(chǎn)品中的硒含量以及對(duì)硒化學(xué)形態(tài)進(jìn)行分析對(duì)人類的健康和經(jīng)濟(jì)發(fā)展有著重要意義[8]。而要實(shí)現(xiàn)食品中不同硒元素形態(tài)的分析，首先必須建立食品中硒化物的提取、分離和檢測(cè)方法。目前，食品中硒化物的提取方法主要有水提取法[9]、酸提取法[10]、酶提取法[11]、固相萃取法[12]等，也有使用氫氧化鈉[13]、Tris-鹽酸緩沖液[14]等作為提取劑的。硒化物分離檢測(cè)的主流方法包括液相色譜與原子熒光聯(lián)用（HPLC-AFS）法[15]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS-MS/LC-TOF-MS）法[16]、液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-ICP-MS）法[17]、氣相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用（GC-ICP-MS）法[18]和電泳及其聯(lián)用技術(shù)[19]等。此次試驗(yàn)在運(yùn)用ICP-MS技術(shù)測(cè)定食品中總硒含量的基礎(chǔ)上再利用酶解技術(shù)提取富硒食品中的硒化物，并通過(guò)陰離子交換高效液相色譜-電感耦合等離子質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)富硒食品中硒酸根（SeO42-）、亞硒酸根（SeO32-）、硒代胱氨酸（SeCys2）、硒甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys）、硒代蛋氨酸（SeMet）5種主要形態(tài)的硒化物的分離和檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試劑與材料

硒元素標(biāo)準(zhǔn)品、硒酸根（SeO42-）溶液、亞硒酸根（SeO32-）溶液、硒代胱氨酸SeCys2（98%）、硒甲基硒代半胱氨酸MeSeCys（98%）、硒代蛋氨酸SeMet（98%），美國(guó)Sigma公司；胃蛋白酶，美國(guó)Sigma公司；檸檬酸（色譜純）、硝酸（色譜純）、氨（色譜純），美國(guó)Sigma公司；富硒食品樣品，市售。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Thermo Scientific Ultimate 3000高效液相色譜儀，美國(guó)賽默飛世爾；SNO2355R iCAP RQ ICP-MS電感耦合等離子質(zhì)譜，美國(guó)賽默飛世爾；Hamilton PRP X-100陰離子交換柱，美國(guó)安捷倫；7DFE8C7A恒溫振蕩器，上海智成分析儀器制造有限公司；3K30離心機(jī)，美國(guó)Sigma公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 食品中硒元素含量檢測(cè)方法的建立

按照GB 5009.93—2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中硒的測(cè)定》中規(guī)定的食品中硒元素含量檢測(cè)方法，利用微波消解對(duì)樣品進(jìn)行前處理并使用ICP-MS技術(shù)檢測(cè)食品中硒元素含量，選用多種標(biāo)注硒元素含量富硒食品對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行驗(yàn)證。ICP-MS方法測(cè)定硒元素存在一些難點(diǎn)，主要在基體效應(yīng)和干擾方面。Se元素屬于難電離元素，電離能力受到基質(zhì)中有機(jī)物和酸量的影響，有機(jī)物對(duì)硒元素有增敏作用，而酸則有抑制效應(yīng)，因此要盡量保證標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品中有機(jī)物含量及酸度一致，可以在內(nèi)標(biāo)溶液中加入適量異丙醇匹配有機(jī)物。Se元素測(cè)試容易受到ArAr多原子離子干擾，采用iCAP RQ ICPMS時(shí)推薦選用78Se在KED模式下進(jìn)行測(cè)試，KED模式可有效去除多原子離子干擾，降低背景提高檢出水平。

1.2.2 實(shí)際樣品硒含量的檢測(cè)

將市售富硒食品（標(biāo)注含量）作為檢測(cè)樣品進(jìn)行硒含量檢測(cè)，驗(yàn)證方法準(zhǔn)確度。

1.2.3 硒化合物的提取

此次試驗(yàn)?zāi)M胃液消化過(guò)程對(duì)富硒產(chǎn)品中硒化物進(jìn)行提取。分別稱取0.1 g研磨成細(xì)粉狀樣品于離心管中，加入10 mL 0.1%鹽酸，超聲振蕩30 min，加入30 mg胃蛋白酶在37 ℃條件下恒溫振蕩24 h，然后經(jīng)離心、過(guò)濾、稀釋5倍后進(jìn)行形態(tài)分離檢測(cè)。

1.2.4 5種硒化物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

將5種不同形態(tài)硒化物的標(biāo)準(zhǔn)溶液用去離子水配制成質(zhì)量濃度為空白，1，5，10，50和100 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 色譜條件及儀器參數(shù)

具體色譜條件及儀器參數(shù)見(jiàn)表1和表2。

表1 5種硒化物分離色譜條件

表2 檢測(cè)儀器參數(shù)

1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

將1.2.4制備的5種硒化物同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液分別混合，按照1.2.5色譜條件及儀器參數(shù)進(jìn)行分離檢測(cè)，記錄5種硒化物不同濃度下的峰面積積分并分別制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.7 實(shí)際樣品硒元素含量的檢測(cè)和5種不同硒化物形態(tài)的分離檢測(cè)

選取市售富硒苦瓜雪蓮精華片、富硒青錢柳蛹蟲(chóng)草片和硒黃酮三種樣品進(jìn)行硒元素含量檢測(cè)和5種不同硒化物形態(tài)的分離檢測(cè)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.8 方法檢出限測(cè)定

以5種硒化物質(zhì)量濃度均為0.5 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，測(cè)得5種硒化物響應(yīng)強(qiáng)度與基線噪音強(qiáng)度，推算方法檢出限。

1.2.9 方法回收率測(cè)定

為了考察方法準(zhǔn)確度，向富硒青錢柳蛹蟲(chóng)草片提取液中加入5種硒形態(tài)質(zhì)量濃度同為38 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行3次水平試驗(yàn)，分別計(jì)算5種硒化物的平均回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 硒元素標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

按照GB 5009.93—2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中硒的測(cè)定》中規(guī)定的食品中硒元素含量檢測(cè)方法，將硒元素標(biāo)準(zhǔn)品配制成質(zhì)量濃度分別為1，5，10，50和100 μg/L的溶液，按照1.2.1方法進(jìn)行檢測(cè)，記錄峰面積制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=2 626.595x+126.650，R2=1.000，硒元素在0～100 μg/L濃度范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)均為1.000，線性關(guān)系良好。

2.2 實(shí)際樣品硒含量的檢測(cè)

將市售富硒食品（標(biāo)注含量）作為檢測(cè)樣品進(jìn)行硒含量檢測(cè)，驗(yàn)證方法準(zhǔn)確度，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，該方法檢測(cè)富硒食品中硒元素含量的回收率均在90%以上，方法準(zhǔn)確度高。

表3 實(shí)際樣品硒元素含量檢測(cè)結(jié)果

2.3 5種硒形態(tài)各濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖的制備

將5種不同硒形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)液混合物按照1.2.5色譜條件及儀器參數(shù)進(jìn)行分離檢測(cè)，得到各濃度的色譜圖并將5種不同濃度標(biāo)準(zhǔn)混合液所得色譜圖進(jìn)行疊加，結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2。所建立的HPLC-ICP-MS方法，采用Hamilton PRP X-100陰離子交換柱，以5 mmol/L檸檬酸、氨水調(diào)節(jié)pH 4.7為流動(dòng)相，等度洗脫，對(duì)于5種硒元素形態(tài)分離效果較好，在900 s內(nèi)可完成5種硒形態(tài)的快速分離。

圖1 0.1 μ g/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖2 5種硒形態(tài)各濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜疊加圖

2.4 5種硒形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照1.2.6制定5種不同硒化物的標(biāo)準(zhǔn)曲線，5種硒化物在0～100 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)均為1.000，線性關(guān)系良好（表4）。

表4 5種硒形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

按照1.2.7方法，分別對(duì)市售富硒苦瓜雪蓮精華片、富硒青錢柳蛹蟲(chóng)草片和硒黃酮3種樣品進(jìn)行編號(hào)（1，2和3號(hào)樣品），并對(duì)其進(jìn)行硒元素含量檢測(cè)和5種不同硒化物形態(tài)的分離檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖3～圖5和表5。結(jié)果表明，該檢測(cè)方法和條件能有效分離檢測(cè)實(shí)際富硒食品中5種不同形態(tài)硒元素。從結(jié)果中也可以看到3種富硒樣本中硒種類與含量各不相同，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和利用度值得深入探究。但從回收率結(jié)果來(lái)看，此次試驗(yàn)采用單一胃蛋白酶在0.1%鹽酸體系下酶解提取樣品中硒元素，提取效率不高，考慮到實(shí)際樣品的復(fù)雜性，需進(jìn)一步優(yōu)化前處理步驟，可對(duì)樣品中基質(zhì)進(jìn)行預(yù)分離或利用復(fù)合酶解等方式提高提取效率。

圖3 1號(hào)樣品色譜圖

圖4 2號(hào)樣品色譜圖

圖5 3號(hào)樣品色譜圖

表5 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

2.6 5種硒化物方法檢出限測(cè)定結(jié)果

按照1.2.8方法測(cè)得各形態(tài)峰高均大于等于基線噪音的3倍的檢出限。SeO42-，SeO32-，SeCys2，MeSeCys和SeMet檢出限可分別達(dá)到0.25，0.20，0.25，0.50和0.30 μg/L。由1.2.3可知，樣品取樣量和定容體積分別為0.1 g和50 mL，計(jì)算可得SeO42-，SeO32-，SeCys2，MeSeCys和SeMet方法檢出限分別為0.125，0.1，0.125，0.25和0.15 mg/kg。

2.7 方法回收率測(cè)定結(jié)果

為了考察方法準(zhǔn)確度，向富硒青錢柳蛹蟲(chóng)草片提取液中加入5種硒形態(tài)質(zhì)量濃度同為38 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，分別計(jì)算5種硒化物的回收率，結(jié)果見(jiàn)表6。該方法分離檢測(cè)食品中5種不同形態(tài)硒的加樣回收率均在90%以上，結(jié)果表明，利用陰離子交換高效液相色譜-電感耦合等離子質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)能有效分離檢測(cè)富硒食品中5種不同硒元素形態(tài)并實(shí)現(xiàn)5種形態(tài)硒元素的定量檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確率高。

表6 加樣回收率測(cè)定結(jié)果 單位：%

3 結(jié)論

此次試驗(yàn)建立了利用陰離子交換高效液相色譜-電感耦合等離子色譜聯(lián)用分離檢測(cè)富硒食品中硒酸根（SeO42-）、亞硒酸根（SeO32-）、硒代胱氨酸（SeCys2）、硒甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys）、硒代蛋氨酸（SeMet）5種不同硒元素形態(tài)的方法，其中采用胃蛋白酶在0.1%鹽酸體系下酶解提取食品中的硒化合物。結(jié)果表明：所建立的HPLC-ICP-MS方法，采用Hamilton PRP X-100陰離子交換柱，以5 mmol/L檸檬酸，氨水調(diào)節(jié)pH 4.7為流動(dòng)相，等度洗脫，對(duì)于5種硒元素形態(tài)分離效果較好，在900 s內(nèi)可完成5種硒形態(tài)的快速準(zhǔn)確分析，是一種有效可行的對(duì)富硒產(chǎn)品中硒形態(tài)的分析方法。從結(jié)果中也可以看到3種富硒食品樣本中硒種類與含量各不相同，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和利用度值得深入探究。另外，此次試驗(yàn)采用單一胃蛋白酶在0.1%鹽酸體系下酶解提取樣品中硒元素，提取效率不高，考慮到實(shí)際樣品的復(fù)雜性，需進(jìn)一步優(yōu)化前處理步驟，可對(duì)樣品中基質(zhì)進(jìn)行預(yù)分離或利用復(fù)合酶解等方式提高提取效率。