張 伍 劉修恒 王 磊

腎缺血再灌注損傷(Renal Ischemia-reperfusion Injury)是指腎臟缺血恢復(fù)血流灌注后，腎功能無(wú)法恢復(fù)、甚至損傷進(jìn)一步加重的現(xiàn)象[1]。腎臟缺血再灌注損傷通常繼發(fā)于各種類型的出血性休克，此外，急性腎動(dòng)脈阻塞、腎臟移植術(shù)、腎部分切術(shù)或某些全身性疾病手術(shù)，也會(huì)引起腎臟缺血再灌注損傷發(fā)生[2]。WDR5基因?yàn)榫幋aWD-重復(fù)蛋白家族的成員，由40個(gè)左右的氨基酸殘基組成,具有保守的GH(甘氨酸和組氨酸)和WD(色氨酸和天冬氨酸)序列。該家族成員參與各種細(xì)胞過(guò)程，包括細(xì)胞周期進(jìn)程，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞凋亡和基因調(diào)控。關(guān)于WDR5在腎臟缺血再灌注損傷中的相關(guān)作用，目前尚缺乏相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)選用的WDR5-0103抑制WDR5蛋白在細(xì)胞內(nèi)功能的表達(dá)，通過(guò)大鼠腎臟缺血再灌注損傷模型，探討WDR5在大鼠腎臟缺血再灌注損傷中對(duì)細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)中的影響，以期為臨床上腎臟缺血再灌注損傷提供新的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動(dòng)物：48只成年雄性SD大鼠(200-220g)由武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。 維持室溫25℃，相對(duì)濕度65%-70%，日光黑夜周期各12h(光照時(shí)間為8∶00-20∶00)，分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食進(jìn)水，飼養(yǎng)2周后開(kāi)始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本項(xiàng)目得到武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有程序均符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的護(hù)理和使用指南》。

1.1.2藥物、試劑和儀器：WDR5抑制劑(WD-Repeat Protein 5-0103，批號(hào)S218401)購(gòu)自美國(guó)Selleck公司，Toll樣受體4 (TLR4)抗體(批號(hào)ab22048)、核因子κB(NF-κB)抗體(批號(hào)ab16502)、WDR5抗體(批號(hào)ab22512)購(gòu)自于美國(guó)ABCAM公司，DMSO(二甲基亞砜,批號(hào)RNBF2134)購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司，實(shí)驗(yàn)時(shí)采用雙蒸水配置為2%濃度溶液備用；β-actin及二抗購(gòu)由中國(guó)博斯特生物技術(shù)公司設(shè)計(jì)并合成，血尿素氮(BUN)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)C013-2-1)和血清肌酐(Cr)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)C011-2-1)購(gòu)自中國(guó)南京建成生物公司。熒光顯微鏡(Leica DMi8)購(gòu)自德國(guó)徠卡，ABI PRISM 7500型熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)BIO-Rad公司，研磨儀購(gòu)自美國(guó)MP Bio公司；Thermo FC酶標(biāo)儀、分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；冷凍離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司。

1.2 動(dòng)物分組和處理

按照隨機(jī)數(shù)字列表法將大鼠分成6組(每組8只)，對(duì)照組：用戊巴比妥(50mg/kg，i.p.)完全麻醉后放在恒溫臺(tái)上，維持體溫為37℃，經(jīng)腹部正中切口進(jìn)入腹腔切除右腎，后縫合腹壁；腎缺血再灌注損傷組(IR組)：手術(shù)過(guò)程同對(duì)照組，切除右腎后，用血管夾夾閉左腎血管阻斷血流，觀察到腎臟變?yōu)榘导t色證明阻斷成功，成功阻斷45min后松開(kāi)血管夾，觀察到腎臟變?yōu)轷r紅色則證明再灌注成功； DMSO組：手術(shù)同IR組，在閉合左腎血管45min，松開(kāi)血管夾后腹腔注射4%DMSO(1ml/kg)； WDR5-0103低、中、高劑量組：在缺血45min處理后，腹腔注射不同劑量的WDR5-0103(劑量分別為1mg/kg、5mg/kg、25mg/kg)，余同IR組。

1.3 Western Blot檢測(cè)腎臟缺血再灌注損傷后的

TLR4蛋白和NF-κB蛋白表達(dá)水平腎再灌注損傷24h后，麻醉大鼠，獲取左腎組織，切取1g腎上極皮質(zhì)組織，在含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液中勻漿后，4℃離心15min，取上清液，收集腎組織總蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)。隨后用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì)，將其轉(zhuǎn)移到冰水浴中的PVDF膜上，常溫下用5%的無(wú)脂牛奶封閉1h，加入一抗4℃孵育12h，之后用TBST洗膜3次，每次20min。加入二抗室溫下孵育2h，然后用TBST洗膜3次，每次10min，最后使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑將條帶可視化，使用Image Pro Plus軟件進(jìn)行光密度分析，以目的條帶與β-actin條帶灰度值的比值表示該蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 大鼠血清BUN和Cr水平檢測(cè)

將大鼠處死后固定在實(shí)驗(yàn)臺(tái)邊緣位置，左手抓緊大鼠頸部皮膚固定頭部，并輕輕向下壓迫頸兩側(cè)，使眼球充血。用事先準(zhǔn)備好的10號(hào)金屬針頭頂端(針尖斜面朝內(nèi))，垂直插入內(nèi)眥并向眼底方向轉(zhuǎn)動(dòng)以切開(kāi)靜脈叢，觀察采集管刻度,待所收集的血液量達(dá)到1ml時(shí)停止采血。而后將血樣常溫離心獲得血清后備用，取三只試管按空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、測(cè)定管分為三組，分別加入雙蒸水，10mol/L BUN標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液，待測(cè)血清樣本0.02ml，而后三只試管皆加入緩沖酶液0.25ml，酚顯色劑1ml及堿性次氯酸鈉1ml后充分混勻于37℃水浴加熱10min。制備好待測(cè)樣本后，將儀器用雙蒸水調(diào)零，測(cè)定各管于波長(zhǎng)640nm處吸光度OD值，Cr測(cè)量方法類同，于546nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、測(cè)定管三組吸光度OD值。OD值測(cè)定后以分光光度法計(jì)算得出血清BUN和Cr水平。

1.5 大鼠腎臟組織的病理學(xué)觀察

將大鼠腎臟組織以10%甲醛固定、常規(guī)石蠟包埋、4μm切片。H-E染色后，光鏡觀察腎臟組織學(xué)病變；TUNEL染色，光鏡觀察腎臟組織的細(xì)胞凋亡變化，染色后呈褐色的即為凋亡細(xì)胞。利用Image Pro Plus對(duì)凋亡細(xì)胞和正常細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并計(jì)算細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/(凋亡細(xì)胞數(shù)+正常細(xì)胞數(shù)) × 100%。

1.6 腎組織WDR5表達(dá)

采用免疫組化(Streptavidin-Perosidase，SP)法檢測(cè)。取腎組織石蠟切片，厚度為4μm，加入WDR5(1∶100)抗體及相應(yīng)二抗，DAB顯色5min后封片。細(xì)胞核有棕黃色表達(dá)者為WDR5陽(yáng)性細(xì)胞。

1.7 腎臟組織內(nèi)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)等炎性因子mRNA水平檢測(cè)

采用qRT-PCR法檢測(cè)炎性因子mRNA水平，取1g大鼠左腎皮質(zhì)組織,應(yīng)用Trizol試劑分別提取對(duì)照組、IR組、DMSO組和WDR5-0103高劑量組4組細(xì)胞的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄后得到cDNA,逆轉(zhuǎn)錄體系為: 5× iScript Reaction Mix 4μl, iScript Reverse Transcriptase 1μl, RNA模板1μg,后加水至20μl,然后進(jìn)行qRT-PCR。10μl反應(yīng)體系如下: iTaqTM universal SYBR Green supermix(2×)5μl,上、下游引物1μl,DNA模板2μl,最后加水至10μl。95℃預(yù)變性5min,95℃ 10s, 60℃ 30s,40個(gè)循環(huán)。每組重復(fù)3次實(shí)驗(yàn),用2-ΔΔCt法計(jì)算各組mRNA的相對(duì)表達(dá)量。所用引物(由生工科技武漢有限公司合成序列)如下：TNF-α上游引物：5’- CTT CTC ATT CCT GCT CGT GG -3’，下游引物：5’- TCC GCT TGG TGG TTT GCT AC - 3’；IL-1β上游引物：5’- ACT ATG GCA ACT GTC CCT GAA C -3’，下游引物：5’- GTG CTT GGG TCC TCA TCC TG -3；ICAM-1上游引物：5’-GGG ATG GTG AAG TCT GTC AA-3’，下游引物：5’- GGC GGT AAT AGG TGT AAA TGG-3’；內(nèi)參β-actin：上游引物：5’-TGC TAT GTT GCC CTA GAC TTC G-3’，下游引物：5’-GTT GGC ATA GAG GTC TTT ACG G-3’。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清Cr和BUN水平比較

與對(duì)照組相比，IR組血清Cr、BUN水平明顯上升(t=27.36、18.24，P均<0.01)；與IR組比較，各不同濃度WDR5-0103組血清Cr、BUN水平明顯降低(t均<17.83，P均<0.01)。不同濃度的WDR5-0103組中，高劑量組的血清Cr和BUN水平下降最明顯(t=29.27、15.68，P均<0.01)，見(jiàn)表1。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中均以WDR5-0103高劑量組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

表1 各組大鼠血Cr及均=8)

2.2 各組大鼠腎臟WDR5蛋白表達(dá)水平比較

SP染色結(jié)果(圖1和表2)顯示，WDR5蛋白在腎缺血再灌注損傷的大鼠腎小球基底膜和腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)均有顯著表達(dá)(棕黃色顆粒)，主要定位在細(xì)胞核，各組WDR5蛋白表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=405.94，P<0.01)。與對(duì)照組比較，IR組WDR5表達(dá)明顯增高,OD值分別為0.12±0.07、0.58±0.25(t=48.62,P<0.01)；與IR組比較，WDR5-0103高劑量組其表達(dá)明顯降低,OD值為0.27±0.12(t=31.53，P<0.01)。

圖1 各組大鼠腎組織內(nèi)WDR5蛋白表達(dá)(SP法，×200)

2.3 各組大鼠腎臟缺血再灌注損傷后的病理學(xué)改變

對(duì)照組腎小管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，腎小球及腎小管未見(jiàn)明顯異常改變(見(jiàn)圖2)，IR組和DMSO組可見(jiàn)明顯腎組織損傷，腎小管上皮細(xì)胞腫脹，管腔擴(kuò)張，刷狀緣消失，腎小管結(jié)構(gòu)排列紊亂、松散，間質(zhì)部分狹窄和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，蛋白管型也有明顯增加。WDR5-0103高劑量組損害較輕，僅有細(xì)胞輕度腫脹，細(xì)胞排列較為整齊，無(wú)明顯改變。

圖2 各組大鼠腎臟缺血再灌注損傷后的病理學(xué)改變(HE染色，×200)

2.4 各組大鼠腎臟組織細(xì)胞凋亡率比較

各組腎臟組織細(xì)胞凋亡率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=167.23，P<0.01)，與對(duì)照組(1.80±0.20)比較，IR組(31.18±1.27)和DMSO組(30.62±1.13)細(xì)胞凋亡率明顯增加(t=19.53、13.81，P<0.01)；與IR組比較，WDR5-0103高劑量組細(xì)胞凋亡率(9.70±0.81，t=12.31，P<0.01)明顯減少。

2.5 各組大鼠腎組織TNF-α、IL-1β、ICAM-1 mRNA水平比較

各組大鼠腎臟組織TNF-α、IL-1β、ICAM-1 mRNA水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與對(duì)照組比較，IR組炎性因子mRNA水平明顯升高(t=17.63、23.57、12.41，P<0.01)；與IR組比較，WDR5-0103高劑量組炎性因子mRNA水平明顯降低(t=23.81、47.33、19.82，P<0.01)。

圖3 各組大鼠腎臟缺血再灌注損傷后細(xì)胞的凋亡反應(yīng)(TUNEL法，×200)

表2 各組大鼠腎臟組織炎性因子mRNA水平(OD值，均=8)

2.6 各組大鼠腎臟組織TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)水平比較

各組大鼠腎臟組織TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與對(duì)照組相比，IR組TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)明顯上升(t=58.82、46.62，P均<0.01)；與IR組相比，WDR5-0103高劑量組TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)水平明顯降低(t=24.13、47.14，P均<0.01)，見(jiàn)圖4和表3。

圖4 各組大鼠腎臟缺血再灌注損傷后的TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)(Western Blot)

3 討 論

隨著泌尿外科手術(shù)的發(fā)展，急性腎損傷的發(fā)生率與日俱增，而腎缺血再灌注損傷是其形成的最主要原因之一。急性腎衰竭在臨床上較為常見(jiàn)，其發(fā)病兇險(xiǎn)，致死率高，即使在很多發(fā)達(dá)國(guó)家，其發(fā)生率也達(dá)到3.2-9.6%，死亡率更是占據(jù)住院患者的20%左右[3]。腎缺血再灌注損傷患者血液中Cr和BUN水平明顯升高；體內(nèi)炎癥反應(yīng)加劇，患者血液中可檢測(cè)到高濃度的TNF-α、IL-1β及ICAM-1等炎性因子[4]。由于腎小管上皮細(xì)胞線粒體高度腫脹，腎小管細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死，在鏡下可觀察到細(xì)胞排列紊亂甚至崩解以及細(xì)胞中新形成的空泡[5]。因此，為了有效減少泌尿外科術(shù)后的并發(fā)癥，積極有效地預(yù)防腎缺血再灌注損傷顯得尤為重要。目前，由于缺乏有效應(yīng)對(duì)腎缺血再灌注損傷的特定藥物，使得腎缺血再灌注損傷的機(jī)制研究顯得尤為重要。

表3 各組大鼠大鼠腎臟組織的TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)(OD值，均=8)

WDR5基因是編碼WD重復(fù)蛋白家族的一個(gè)重要成員，每個(gè)WD重復(fù)蛋白是都是由多個(gè)高度保守的 WD基元組成 ,基元間的許多結(jié)構(gòu)具有相關(guān)性，在生理功能上則呈現(xiàn)為多樣性。例如：細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、染色體的修飾、蛋白質(zhì)的運(yùn)輸以及RNA的轉(zhuǎn)錄和加工過(guò)程中，WD蛋白家族都扮演了重要的角色。盡管大部分WD重復(fù)蛋白結(jié)構(gòu)非常保守 ,但其可通過(guò)改變基元數(shù)目和利用不同外在結(jié)構(gòu)域的修飾，使其在功能上表現(xiàn)出明顯的差異 。因此 ,保守的 WD重復(fù)蛋白能夠參與多種生物機(jī)制調(diào)節(jié)過(guò)程,如細(xì)胞分裂、細(xì)胞程序性死亡、分生組織的形成等[6]。本研究首次發(fā)現(xiàn)WDR5在腎臟缺血再灌注過(guò)程中表達(dá)水平升高，抑制WDR5水平，可減輕腎缺血再灌注損傷后的血清Cr及BUN水平，抑制缺血再灌注損傷。本實(shí)驗(yàn)采用的WDR5-0103是一類脂溶性小分子，不溶于水，經(jīng)DMSO溶解后腹腔注射給藥。WDR5-0103可與WDR5上的肽結(jié)合袋結(jié)合(Kd=450nM)，在體外抑制髓系混合系白血病核心復(fù)合物的催化活性(IC50=39M)，從而達(dá)到抑制WDR5蛋白在細(xì)胞內(nèi)功能的表達(dá)。

TLR4屬于跨膜蛋白的一種，主要功能為調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的免疫過(guò)程。 NF-κB是一種可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)多種基因的表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，其功能包括編碼細(xì)胞粘附分子、炎癥趨化因子和細(xì)胞因子(例如TNF-α、IL-6和MCP-1等)[7]。TLR4/NF-κB是一種常見(jiàn)的信號(hào)通路，廣泛參與了細(xì)胞內(nèi)生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)。研究表明，TLR4/NF-κB調(diào)節(jié)通路在細(xì)胞增殖和凋亡過(guò)程中起著重要作用[8],其調(diào)控過(guò)程受到多種細(xì)胞內(nèi)活性因子及生物活性物質(zhì)影響[9]，脂多糖(LPS)可通過(guò)抑制RAW 264.7巨噬細(xì)胞中的TLR4/NF-κB信號(hào)通路來(lái)降低其所誘導(dǎo)的炎癥水平[10]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)WDR5-0103不僅可降低細(xì)胞內(nèi)的TNF-α、IL-1β及ICAM-1等炎性因子mRNA水平，還可減輕腎缺血再灌注組織的細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與降低TLR4/NF-κB通路表達(dá)有關(guān)，表明WDR5-0103在大鼠腎缺血再灌注組織損傷中發(fā)揮了保護(hù)作用。

綜上所述，WDR5-0103可減輕腎缺血再灌注損傷后的細(xì)胞凋亡，抑制組織內(nèi)炎癥反應(yīng)，其作用機(jī)制可能與下調(diào)TLR4 /NF-κB通路表達(dá)水平有關(guān)，這為臨床上防治腎缺血再灌注損傷提供了新的思路。