趙海專 袁明杰 余 波

高脂飲食誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化模型通常被用來研究心血管疾病的相關(guān)機(jī)制[1,2]。動(dòng)脈粥樣硬化引起心血管疾病的死亡率逐漸增加[3]，且發(fā)病年齡有年輕化的趨勢(shì)[4]，是臨床關(guān)注的熱點(diǎn)之一，但其發(fā)病機(jī)制還不明確。研究認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化的變化過程是多因素作用的結(jié)果，炎癥是其中一個(gè)重要原因[5-7]。高脂飲食是引起肥胖的因素之一，肥胖者易發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)心血管疾病[8]。但高脂飲食引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷或功能障礙而致炎癥反應(yīng)還未見明確的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用高脂飲食誘導(dǎo)兔子動(dòng)脈粥樣硬化造模，分析高脂飲食與炎癥反應(yīng)的關(guān)系，為預(yù)防肥胖或動(dòng)脈粥樣硬化提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物造模和分組

12只健康新西蘭兔子，雌雄各半，體重2.50±0.35kg，購于湖北省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(SCXK(鄂)2019-0004)。所有兔子購回后飼養(yǎng)于本院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。維持室溫25℃±2℃，相對(duì)濕度為45%—60%，12h光照/黑暗交替。將12只兔子平分為兩組：普通飲食組 (OD組，n=6)和高脂飲食組 (HFD組，n=6)。普通飼料主要包括玉米、麥麩、豆粕、魚粉、殼粉、食鹽和復(fù)合維生素。高脂飲食配方在普通飼料的基礎(chǔ)上增加了蛋黃粉、膽固醇和豬油，所有兔子飼養(yǎng)8周后，耳靜脈逐漸注射戊巴比妥麻醉后抽血液，隨后處死取頸動(dòng)脈。

1.2 實(shí)驗(yàn)室相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

兔子麻醉后經(jīng)耳靜脈采集血液8.0ml ，其中2.0ml置入EDTA-K2抗凝管中，混勻使用SYSMEX NE-9000型全自動(dòng)血球分析儀及配套試劑(日本希森美康公司)檢測(cè)血細(xì)胞相關(guān)參數(shù)：包括白細(xì)胞(WBC)、紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白(HB)、紅細(xì)胞壓積(HCT)、血小板(PLT)等，另6.0ml血置入促凝劑管中，以3000轉(zhuǎn)/min離心10min分離血清，分別使用ADVIA-2400型全自動(dòng)血液生化分析儀(德國(guó)西門子公司)檢測(cè)血液生化參數(shù)：包括總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、血糖(GLU)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、載脂蛋白A(ApoA)、載脂蛋白B(ApoB)、載脂蛋白小α[Lp(α)]，以及ELISA法檢測(cè)血清炎性因子水平：包括白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)濃度，試劑盒為上海通蔚生物科技有限公司生產(chǎn)(IL-1β貨號(hào)：TWp027836，TNF-α貨號(hào)：TWp028087)；酶標(biāo)儀為邁瑞醫(yī)療器械公司全自動(dòng)酶標(biāo)儀MR-96A，所有檢測(cè)均由本院檢驗(yàn)科按操作手冊(cè)說明書進(jìn)行。

1.3 組織病理學(xué)觀察

兔子處死后，取頸動(dòng)脈常規(guī)石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，用蘇木精和伊紅(HE)染色，由專業(yè)的病理學(xué)科醫(yī)師閱片。使用Axiophot顯微鏡(德國(guó)蔡司公司)和數(shù)碼相機(jī)(Leaf Systems Lumina, 日本瑪米亞利圖公司)拍攝圖像。采用圖像處理軟件(Version 6.5, Media Cybernetics, 美國(guó)Silver Springs公司)分析血管內(nèi)膜平均厚度。

1.4 Western Blot分析蛋白表達(dá)[9]

頸動(dòng)脈組織用1ml裂解液充分裂解，4℃、12 500g離心15min取上清。使用BCA蛋白質(zhì)分析試劑(Pierce Com, Rockford, IL, USA)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。將每個(gè)樣品的等量裂解蛋白(20μg)裝載在7.5%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，然后將條帶轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA)。室溫下用3%牛血清白蛋白在Tris緩沖鹽液中阻斷與膜的非特異性結(jié)合1h。 然后在4℃下與不同的一抗抗體孵育過夜，抗IL-1β兔多克隆抗體(上海艾博抗，編號(hào)ab2105)，抗TNF-α兔多克隆抗體(深圳子科生物科技有限公司，編號(hào)ZIKER-0078R)和抗GAPDH(Santa Cruz, CA,美國(guó). 編號(hào)sc-25778)。辣根過氧化物酶結(jié)合山羊抗兔IgG2a二抗(Santa Cruz, CA, 美國(guó). 編號(hào)sc-2061)孵育2h。通過Bio-Rad GelDoc XR和Chemi-Doc XRS系統(tǒng)(Bio-Rad，Hercules，美國(guó)Bio-Rad公司)掃描蛋白質(zhì)條帶，并使用Quantity One一維分析軟件(Version 4.6.3，美國(guó)Bio-Rad公司)進(jìn)行分析。以目標(biāo)蛋白與GAPDH蛋白條帶灰度值的比值表示該目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組兔子各項(xiàng)血液參數(shù)結(jié)果比較

兩組血液學(xué)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果見表1。與OD組比較，HED組TG、TC、LDL-C、ApoB、IL-1β和TNF-α水平均升高，而HDL-C水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，兩組其它指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 不同組血液參數(shù)檢測(cè)均=6)

2.2 兩組兔子血管內(nèi)膜厚度比較

HFD組血管內(nèi)膜厚度明顯高于OD組(2.34±0.08mm vs 1.73±0.11mm),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.93 ，P<0.01)。見圖1。

2.3 兩組兔子血管內(nèi)膜TNF-α和IL-1β蛋白表達(dá)比較

HFD組TNF-α蛋白表達(dá)高于OD組(0.51±0.03 vs 0.25±0.02)。IL-1β 蛋白表達(dá)亦高于OD組(0.42±0.02 vs 0.22±0.03)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.22、 6.27，P<0.01)。見圖2。

圖1 兩組兔子血管內(nèi)膜厚度

圖2 兩組兔血管內(nèi)膜IL-1β和TNF-α蛋白表達(dá)(Western Blot)

3 討 論

高脂飲食已經(jīng)成為許多人的日常飲食常態(tài)，特別是年輕人。但長(zhǎng)期高脂飲食容易引發(fā)多種疾病，例如糖尿病、肥胖、心血管疾病、膽囊炎和癌癥等[9,10]。高脂飲食引起肥胖和動(dòng)脈粥樣硬化被臨床重點(diǎn)關(guān)注[2]。流行病學(xué)調(diào)查研究顯示高脂飲食人群肥胖和動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病率明顯高于普通飲食者[8,10]。高脂飲食與肥胖和動(dòng)脈粥樣硬化可能存在一定的相關(guān)性。

本研究結(jié)果揭示高脂飲食可上調(diào)兔子血管內(nèi)膜炎性因子的表達(dá)。以高脂飲食誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化模型為研究對(duì)象，我們發(fā)現(xiàn)高脂飲食不僅影響一些常規(guī)血脂指標(biāo)的改變，而且上調(diào)血液炎性因子IL-1β和TNF-α水平，且Western blot檢測(cè)顯示增生的血管內(nèi)膜IL-1β和TNF-α蛋白表達(dá)增加。提示高脂飲食可以引起炎性因子水平的變化，或可予動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)。

本研究高質(zhì)飲食可引起血液脂質(zhì)檢測(cè)參數(shù)的改變，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)高脂飲食兔子體重明顯高于普通飲食的兔子，說明了高脂飲食與引發(fā)肥胖有關(guān)，但對(duì)于高脂飲食引起肥胖的明確機(jī)理還不清楚。

有研究表明炎性因子IL-1β和TNF-α高表達(dá)引起血管內(nèi)膜的增生[13-15]，此與HFD實(shí)驗(yàn)組兔子血管內(nèi)膜增生明顯高于OD組一致。TNF-α高表達(dá)還引起細(xì)胞的凋亡或組織的壞死[15]，炎性因子水平升高可能與動(dòng)脈粥樣硬化引起血管內(nèi)皮的損傷、壞死或破裂相關(guān)。因此，即高脂飲食可能通過上調(diào)炎性因子IL-1β和TNF-α高表達(dá)引起肥胖或動(dòng)脈粥樣硬化。

本研究的結(jié)果還存在一些不足之處：1)雖然觀察到高脂飲食可上調(diào)炎性因子水平，但高脂飲食上調(diào)炎性因子的機(jī)理未知；2)實(shí)驗(yàn)研究檢測(cè)的僅僅是頸總動(dòng)脈內(nèi)膜，其它器官組織未作檢測(cè)。3)是否還存在著其它因素影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果還未明確；4)炎性因子種類多，各因子作用不一樣，本研究只檢測(cè)IL-1β和TNF-α因子。

綜上所述，高脂飲食影響血脂指標(biāo)，可能是高脂飲食脂質(zhì)代謝紊亂相關(guān)，導(dǎo)致肥胖的重要原因之一。 同時(shí)高脂飲食促進(jìn)血液炎性因子IL-1β和TNF-α水平增高，且明顯上調(diào)血管內(nèi)膜炎性因子IL-1β和TNF-α的表達(dá)，但高脂飲食上調(diào)炎性因子的機(jī)理尚不清楚，有待進(jìn)一步的研究。