洪曉綠 黃小華程 璐 賴金國 潘小平，#

外泌體(Exosome)是一種直徑為40-100nm 的盤狀囊泡，其主要來源于細胞內(nèi)溶酶體微粒內(nèi)陷形成的多囊泡體，囊泡內(nèi)包含多種蛋白質(zhì)類型，包括細胞表面受體、胞漿信號蛋白、代謝酶、細胞骨架成分和核蛋白，也含有RNA轉(zhuǎn)錄物、長鏈非編碼RNA、小分子RNA(small RNA)等[1]。Small RNA包括微小RNA(miRNA)、轉(zhuǎn)運RNA來源的小RNA(tRNA-derived small RNAs, tsRNA)、與Piwi蛋白相作用的RNA(Piwi-interacting RNA, piRNA)和干擾小RNA(small Interfering RNA, siRNA)等。外泌體攜帶small RNA在許多疾病和腫瘤中發(fā)揮重要作用[2-4]，包括乳腺癌[5]，外泌體攜帶small RNA還能介導(dǎo)乳腺癌細胞的耐藥性[6]，但對其影響乳腺癌耐藥機制的研究大部分集中在miRNAs[7]。鑒于此，本文檢測乳腺癌細胞株和乳腺癌耐藥細胞株外泌體中small RNA表達的差異，旨在為研究外泌體攜帶small RNA在乳腺癌耐藥機制中的作用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

人乳腺癌上皮細胞系MCF-7/S和乳腺癌阿霉素耐藥細胞株MCF-7/ADR購買于中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫(上海，中國)，上述細胞株復(fù)蘇后分別置于含10% 胎牛血清(Hyclone，美國)和10%青霉素-鏈霉素(Gibco，澳洲)的RPMI-1640 (Gibco，澳洲)培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待培養(yǎng)皿中的細胞覆蓋率達到80%-90%時，用0.25%胰酶消化細胞，按1∶3的量進行細胞傳代，將細胞分別接種于6孔板(3×105個/孔)內(nèi)，取處于對數(shù)生長期的細胞用于后續(xù)實驗。

1.2 外泌體提取

取對數(shù)生長期的MCF-7/S細胞株和MCF-7/ADR細胞株(4×105個/孔)，在無血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，24h后當細胞融合率達到80%-90%時收集上清，4℃ 2 000g離心20min除去細胞碎片，收集離心后的上清4℃ 10 000g高速離心1h后，用不含血清RPMI-1640 培養(yǎng)基懸浮沉淀，再重復(fù)之前的高速離心步驟一次[8]，棄上清，沉淀即為外泌體，于-80℃保存待用。

1.3 外泌體鑒定

1.3.1透射電鏡(TEM)鑒定外泌體形態(tài)：網(wǎng)格內(nèi)滴加30μl外泌體，靜置1min后，用濾紙從側(cè)面吸干液體，滴加30μl磷鎢酸溶液(pH=6.8)，室溫復(fù)染5min，白熾燈烤干，透射電鏡(JEM-1200EX，日本)下拍照。

1.3.2動態(tài)光散射法檢測外泌體直徑：將外泌體樣品用0.15M NaCl稀釋至適當?shù)墓鈱W信號檢測水平(比例為1∶50)，混勻后采用Zetasizer Nano-ZS90(Malvern，英國)儀進行檢測，激發(fā)光波長λ=532nm。

1.3.3流式細胞儀檢測外泌體表面標志物CD63含量：在提取的外泌體中，加入1ml PBS(含1% BSA)重懸，室溫孵育30min封閉非特異性抗原，1000g離心5min，棄上清，再以200μl/EP管PBS輕輕重懸外泌體，每組分別加入CD63-PE抗體(Thermo Fisher，美國)，室溫孵育30min，1 000g離心5min，棄上清，然后用含有1% BSA的PBS重懸外泌體，以未加抗體的EP管作為空白對照，以加入PE標記的抗人IgG(Thermo Fisher，美國)EP管作為同型對照，采用Guava easyCyteTM system流式細胞儀(Merck millipore，德國)檢測外泌體表面標志物CD63的含量。

1.4 外泌體RNA提取

按照exoRNeasy Serum/Plasma Maxi Kit(QIAGEN, 德國)試劑盒說明書操作步驟提取外泌體總RNA，用于后續(xù)文庫制備。

1.5 文庫制備與測序

按照QIAseq?miRNA Library Kit(QIAGEN, 德國)試劑盒說明書操作步驟制備小RNA測序文庫，文庫質(zhì)檢采用Bioptic Qsep100 Analyzer(BIOptic，臺灣)檢測片段分布，插入片段復(fù)合小RNA長度、峰型單一、無雜峰、無接頭和無引物二聚體，為合格文庫的標準。采用NextSeq CN500測序儀(illumina，美國)進行測序。

1.6 數(shù)據(jù)分析

1.6.1質(zhì)控：采用Trimmomatic軟件對原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)量預(yù)處理，去掉接頭序列和低質(zhì)量堿基，再用FastQC軟件對預(yù)處理后的原始數(shù)據(jù)進行整體評估，包括測序序列長度分布、堿基質(zhì)量值分布、GC含量分布等。

1.6.2比對與定量：采用BWA軟件將預(yù)處理后的原始數(shù)據(jù)與各大數(shù)據(jù)庫比對，首先比對到miRBase數(shù)據(jù)庫(http://www.mirbase.org/)，未比對上miRBase數(shù)據(jù)庫的序列分為兩部分，一部分是24-33bp序列，另一部分是12-23bp和34-43bp的序列。將24-33bp的序列比對到piRNAcluster數(shù)據(jù)庫(https://labworm.com/tool/pirna-cluster-database)，將12-23bp和34-43bp的序列與rRNA比對，過濾rRNA，進而與tRFdb數(shù)據(jù)庫(http://genome.bioch.virginia.edu/trfdb/)比對獲得tsRNA。獲得各類型小RNA的測序序列長度分布以及堿基偏好性分布，統(tǒng)計各類型small RNA的表達量，采用TPM(以標準化的TPM值來表示small RNA的表達量)對原始表達量進行定量分析。

1.6.3差異表達：采用DEGseq R軟件包分析各small RNA差異表達，篩選標準為：log2FC>1，F(xiàn)DR<0.05。

2 結(jié) 果

2.1 外泌體鑒定結(jié)果

透射電鏡下外泌體呈形態(tài)基本一致的圓形或者橢圓形膜性囊泡樣(圖1)，動態(tài)光散射檢測外泌體顆粒直徑在30nm-120nm不等(圖2)，流式細胞儀檢測外泌體表面標志物CD63(0.31±0.04mg/ml )顯著高表達(P<0.05)(圖3)。

圖1 透射電鏡鑒定外泌體(20 000×)

圖2 動態(tài)光散射檢測外泌體直徑

圖3 流式細胞術(shù)檢測外泌體表面標志物CD63含量

2.2 miRNAs在MCF-7/ADR外泌體和MCF-7外泌體中的比較

結(jié)果顯示，MCF-7/Adr外泌體中miRNAs TPM均值較MCF-7外泌體中miRNAs TPM均值高(26.251 vs 3.292，P<0.05)，相對MCF-7外泌體，MCF-7/ADR外泌體中表達上調(diào)的miRNAs有960種，分別為：miR-590-3p、miR-574-5p、miR-24-3p、miR-3911、miR-4653-3p、miR-6753-3p、miR-483-3p、miR-let-7b-5p、miR-7704、miR-6799-5p、miR-6891-3p、miR-1301-3p、miR-1249-3p、miR-7851-3p、miR-128-3p、miR-1307-5p、miR-6851-3p、miR-7113-3p、miR-1912-5p、miR-8088、miR-4667-3p、miR-8077、miR-4512、miR-183-5p、miR-1224-3p、miR-6088、miR-4687-5p、miR-718、miR-3182、miR-3184-5p、miR-6873-3p、miR-1909-3p、miR-1183、miR-5187-5p、miR-376c-5p、miR-6769a-3p、miR-7113-5p、miR-4743-3p、miR-5195-3p、miR-148a-5p、miR-10226、miR-497-3p、miR-708-5p、miR-7110-3p、miR-3160-3p、miR-708-3p、miR-6736-3p、miR-4740-5p、miR-6877-5p、miR-3646、miR-6748-5p、miR-668-3p、miR-5684、miR-576-3p、miR-6814-5p、miR-7515、miR-1236-5p、miR-6877-3p、miR-5003-3p、miR-4635、miR-4692、miR-6134、miR-378a-5p、miR-365b-3p、miR-4269、miR-3661、miR-6846-3p、miR-1538、miR-6890-5p、miR-638、miR-let-7i-3p、miR-3934-5p、miR-1273h-3p、miR-196a-5p、miR-4739、miR-611、miR-6076、miR-5006-3p、miR-421、miR-3160-5p、miR-3665、miR-2115-5p、miR-3940-5p、miR-6734-3p、miR-let-7e-3p、miR-143-5p、miR-6763-3p、miR-6780a-3p、miR-339-5p、miR-769-5p、miR-6892-3、miR-4800-5p、miR-3679-5p、miR-9851-5p、miR-4647、miR-6860、miR-1273h-5p、miR-181b-5p、miR-6512-5p、miR-193b-3p、miR-6832-3p、miR-146b-5p、miR-1226-5p、miR-3085-5p、miR-6886-3p、miR-541-5p、miR-4722-3p、miR-4783-5p、miR-3198、miR-6884-5p、miR-328-3p、miR-3605-3p、miR-6836-3p、miR-6817-5p、miR-4791、miR-2276-5p、miR-595、miR-6809-3p、miR-4737、miR-6805-3p、miR-3939、miR-185-3p、miR-877-3p、miR-1285-3p、miR-3196、miR-320b、miR-6867-5p、miR-320a-5p、miR-378d、miR-99b-3p、miR-4513、miR-1249-5p、miR-4644、miR-5689、miR-1229-5p、miR-4732-5p、miR-3680-5p、miR-711、miR-6834-5p、miR-190b-5p、miR-let-7e-5p、miR-125a-3p、miR-10398-3p、miR-622、miR-5585-5p、miR-7-5p、miR-3135a、miR-629-5p、miR-6724-5p、miR-95-3p、miR-338-3p、miR-7155-5p、miR-7108-5p、miR-320d、miR-185-5p、miR-6802-5p、miR-6789-5p、miR-1285-5p、miR-6727-5p、miR-500a-3p、miR-5585-3p、miR-92b-5p、miR-19b-3p、miR-675-5p、miR-762、miR-6797-3p、miR-483-5p、miR-1910-3p、miR-3529-3p、miR-320c、miR-6766-3p、miR-4640-5p、miR-1281、miR-942-5p、miR-619-5p、miR-6775-5p、miR-3168、miR-4516、miR-3195、miR-205-5p、miR-324-5p、miR-6789-3p、miR-492、miR-4430、miR-1273c、miR-2278、miR-8052、miR-615-3p、miR-12118、miR-210-3p、miR-4511、miR-423-5p、miR-1915-3p、miR-296-5p、miR-1304-3p、miR-106b-3p、miR-4508、miR-181c-5p、miR-4787-3p、miR-296-3p、miR-4674、miR-3184-3p、miR-4472、miR-9899、miR-let-7d-5p、miR-6510-5p、miR-1303、miR-6821-5p、miR-3135b、miR-671-5p、miR-4763-3p、miR-6717-5p、miR-6743-5p、miR-27a-5p、miR-181a-5p、miR-10401-5p、miR-1247-5p、miR-6090、miR-3929、miR-4700-5p、miR-5100、miR-320a-3p；表達下調(diào)的miRNAs有29種，分別為：miR-663b、miR-11399、miR-4523、miR-10396b-5p、miR-10401-3p、miR-3162-5p、miR-10396a-5p、miR-3648、miR-4706、miR-935、 miR-1470、 miR-4449、miR-664b-5p、miR-375-3p、miR-25-5p、miR-212-5p、miR-141-3p、miR-10396b-3p、miR-200c-3p、miR-4750-5p、miR-6743-3p、miR-12136、miR-125a-5p、miR-5787、miR-606、miR-887-3p、miR-4787-5p、miR-200a-3p、miR-10395-3p。

2.3 piRNAs在MCF-7/ADR外泌體和MCF-7外泌體中的比較

結(jié)果顯示，MCF-7/ADR外泌體中piRNAs TPM均值較MCF-7外泌體中piRNAs TPM均值高(2 257.60 vs 587.56，P<0.05)，相對MCF-7外泌體，MCF-7/ADR外泌體中表達上調(diào)的piRNAs有44種，分別為：pir-33470@tRNA、pir-41892@piRNAcluster、pir-52324@piRNAcluster、pir-58790@piRNAcluster、pir-52368@piRNAcluster、pir-50968@piRNAcluster、pir-35729@piRNAcluster、pir-53295@piRNAcluster、pir-36251@tRNA、pir-31199@piRNAcluster、pir-36248@tRNA、pir-31109@piRNAcluster、pir-36038@piRNAcluster、pir-35468@tRNA、pir-36254@tRNA、pir-36242@tRNA、pir-39538@piRNAcluster、pir-36378@tRNA、pir-36249@tRNA、pir-50603@piRNAcluster、pir-31368@tRNA、pir-35467@tRNA、pir-31038@rRNA、pir-60146@piRNAcluster、pir-34093@piRNAcluster、pir-46079@piRNAcluster、pir-35304@piRNAcluster、pir-35463@tRNA、pir-36041@piRNAcluster、pir-36253@tRNA、pir-39980@piRNAcluster、pir-36247@tRNA、pir-41405@piRNAcluster、pir-34442@piRNAcluster、pir-36039@piRNAcluster、pir-31141@piRNAcluster、pir-36245@tRNA、pir-34896@piRNAcluster、pir-36318@tRNA、pir-44984@piRNAcluster、pir-36255@tRNA、pir-36243@tRNA、pir-55891@piRNAcluster、pir-36074@tRNA；表達下調(diào)的piRNAs有60種，分別為：pir-33519@tRNA、pir-33160@rRNA、pir-43997@tRNA、pir-33082@rRNA、pir-43996@tRNA、pir-43995@tRNA、pir-43994@tRNA、pir-43993@tRNA、pir-30924@rRNA、pir-60577@tRNA、pir-33387@piRNAcluster、pir-43770@piRNAcluster、pir-36743@tRNA、pir-56450@rRNA、pir-60576@tRNA、pir-43604@tRNA、pir-33164@tRNA、pir-33081@tRNA、pir-33486@tRNA、pir-34358@tRNA、pir-36742@tRNA、pir-44610@piRNAcluster、pir-34822@piRNAcluster、pir-43604@piRNAcluster、pir-35413@piRNAcluster、pir-33520@tRNA、pir-43772@piRNAcluster、pir-41209@rRNA、pir-35410@piRNAcluster、pir-33226@piRNAcluster、pir-36173@tRNA、pir-32512@piRNAcluster、pir-35952@piRNAcluster、pir-33466@piRNAcluster、pir-33065@piRNAcluster、pir-33270@piRNAcluster、pir-34604@rRNA、pir-60565@piRNAcluster、pir-43771@piRNAcluster、pir-35411@piRNAcluster、pir-31104@piRNAcluster、pir-31103@piRNAcluster、pir-35412@piRNAcluster、pir-44312@tRNA、pir-35284@tRNA、pir-36441@tRNA、pir-33468@piRNAcluster、pir-50725@piRNAcluster、pir-31142@piRNAcluster、pir-31925@tRNA、pir-61646@tRNA、pir-35414@piRNAcluster、pir-36256@tRNA、pir-34810@rRNA、pir-33161@piRNAcluster、pir-61647@tRNA、pir-61648@tRNA、pir-57942@tRNA、pir-61645@tRNA、pir-36258@tRNA(@tRNA為tRNA派生的piRNA，@rRNA為rRNA派生的piRNA，@piRNAcluster為已報道的piRNA)。

2.4 tsRNAs在MCF-7/ADR外泌體和MCF-7外泌體中的比較

結(jié)果顯示，MCF-7/ADR外泌體中tsRNAs TPM均值較MCF-7外泌體中tsRNAs TPM均值高(2 815.36 vs 1 669.43，P<0.05)，相對MCF-7外泌體，MCF-7/ADR外泌體中表達上調(diào)的tsRNAs有93種，分別為：tsrna-5028a-gluttc、tsrna-5020b-valtac、tsrna-3004b/3005b-glnttg、tsrna-3014a-seraga/sertga、tsrna-5017c-alaagc/alacgc、tsrna-5017b-alaagc/alacgc/alatgc/cysgca/valaac、tsrna-5028b-gluttc、tsrna-3017a-valtac、tsrna-3017b-valtac、tsrna-3014b-seraga/sertga、tsrna-3028b-glygcc、tsrna-3033a-asngtt、tsrna-3005a-glnttg、tsrna-5005b-lysttt、tsrna-3031a-tyrgta、tsrna-1039-argcct、tsrna-3022b-ileaat、tsrna-3020a-alaagc/alatgc、tsrna-5032a-aspgtc、tsrna-1006-argacg、tsrna-5028c-gluttc、tsrna-3021a-alacgc/alatgc、tsrna-5021a-glnctg、tsrna-3030b-tyrgta、tsrna-1035-thrcgt、tsrna-1005-sergct、tsrna-5007c-glyccc、tsrna-3003b-cysgca、tsrna-5016a-alaagc/tyrgta/cysgca、tsrna-3026b-glytcc、tsrna-3008a-valaac/valcac、tsrna-3023a-phegaa、tsrna-5001b-tyrgta、tsrna-1029-alatgc、tsrna-3028a-glygcc、tsrna-3027a-glyccc/glygcc、tsrna-3023b-phegaa、tsrna-3008b-valaac/valcac、tsrna-3030a-tyrgta、tsrna-5032b-aspgtc、tsrna-3012a-leucaa/leucag、tsrna-3012b-leucaa/leucag、tsrna-3022a-ileaat、tsrna-5010a-ileaat/ilegat/seract、tsrna-3018b-metcat、tsrna-5007a-glyccc、tsrna-5017a-alaagc/alacgc/alatgc/cysgca/valaac、tsrna-3004a-glnctg、tsrna-5022b-seraga/sertga、tsrna-3027b-glygcc、tsrna-5015a-alaagc/cysgca/tyrgta、tsrna-5008b-glytcc、tsrna-3018a-metcat、tsrna-5013c-proagg/protgg/procgg、tsrna-5005c-lysctt、tsrna-1025-ileaat、tsrna-1001-sertga、tsrna-5030b-gluctc、tsrna-5005b-lysctt、tsrna-5008c-glytcc、tsrna-3031b-tyrgta、tsrna-5005c-lysttt、tsrna-3011b-leucag、tsrna-5021b-glnctg、tsrna-5003b-glygcc、tsrna-5023b-leucag、tsrna-5020c-valtac、tsrna-5026a-valaac/valcac、tsrna-3021b-alacgc/alatgc、tsrna-3020b-alatgc、tsrna-5022a-seraga/sertga、tsrna-3015a-gluttc、tsrna-5023a-leucaa/leucag、tsrna-3016a-lysctt、tsrna-5004b-glygcc/glyccc、tsrna-5026c-valaac、tsrna-5030c-gluctc、tsrna-5019b-leuaag/leutag、tsrna-5026b-valaac、tsrna-3006b-lysttt、tsrna-3029a-gluctc/gluttc/phegaa、tsrna-5027b-valaac/valcac、tsrna-3016b-lysctt、tsrna-5019a-leuaag/leutag、tsrna-3006a-lysttt、tsrna-5005a-lysctt、tsrna-3015b-gluttc、tsrna-5016c-cysgca、tsrna-5009b-valcac、tsrna-5014a-argacg、tsrna-3002b-proagg/protgg/procgg、tsrna-3019b-alaagc、tsrna-5032c-aspgtc；表達下調(diào)的tsRNAs有3種，分別為：tsrna-5027c-valaac/valcac、tsrna-5004c-glygcc/glyccc、tsrna-5009c-valcac。

3 討 論

Small RNA包括miRNA、tsRNA、piRNA、siRNA等。miRNA為基因表達轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，屬于非編碼RNA，結(jié)合其靶mRNA的非翻譯區(qū)導(dǎo)致mRNA翻譯過程被抑制[9]，它在腫瘤發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移、耐藥等方面起至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用[10]；piRNA是一類長度為24-31nt單鏈的小RNA，大部分集中在29-30nt，與PIWI蛋白家族成員相結(jié)合才能發(fā)揮調(diào)控作用，在細胞增殖、腫瘤的發(fā)生發(fā)展、干細胞分化等過程中起著重要作用[11]；tsRNA是近年來發(fā)現(xiàn)的、存在于多種生物體內(nèi)的一類非編碼小RNA，來源于成熟tRNA或tRNA前體，其表達和修飾具有組織和細胞特異性，tsRNA參與應(yīng)激反應(yīng)、蛋白質(zhì)翻譯調(diào)控、核糖體生物合成、腫瘤發(fā)生、細胞增殖與凋亡、表觀遺傳信息的跨代傳遞等多種生理和病理過程[12]。Small RNA與許多疾病和腫瘤密切相關(guān)[13-15]，在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展、腫瘤轉(zhuǎn)移、腫瘤耐藥等方面奕發(fā)揮重要作用[16-18]。

越來越多的基礎(chǔ)和臨床研究表明，外泌體與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)[19,20]，其能夠調(diào)控免疫功能，促進腫瘤血管新生和侵襲轉(zhuǎn)移，甚至直接作用于其它腫瘤或非腫瘤細胞，從而影響細胞或組織的命運[21]。外泌體可攜帶多種類型的small RNA參與不同腫瘤的發(fā)生發(fā)展，侵襲轉(zhuǎn)移[22-24]，在腫瘤耐藥方面亦發(fā)揮重要作用，如外泌體miR-744可通過調(diào)控PAX2，促進肝癌細胞HepG2的增殖，并抑制HepG2細胞對索拉非尼的化學敏感性[25]。外泌體攜帶small RNA在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中的研究，主要集中在miRNA[26]和siRNA[27]，而在乳腺癌耐藥性方面的研究主要集中在miRNA，如Mao等[28]研究外泌體可通過傳遞miRNA降低乳腺癌細胞對阿霉素的敏感性，Chen等[29]研究外泌體亦可通過傳遞miRNA降低乳腺癌細胞對多西紫杉醇的敏感性，但外泌體攜帶piRNA和tsRNA影響乳腺癌耐藥性的研究少見報道，因此，本文對乳腺癌耐藥細胞株外泌體中多種類型的small RNA進行了測序檢測，除了獲得了960種表達上調(diào)和29種表達下調(diào)的miRNA外，還獲得了44種表達上調(diào)和60種表達下調(diào)的piRNA以及93種表達上調(diào)和3種表達下調(diào)的tsRNA，為外泌體攜帶small RNA影響乳腺癌耐藥性方面的研究提供實驗基礎(chǔ)。在乳腺癌耐藥機制研究中，有研究報道，外泌體可攜帶miRNA通過MAPK，TGF-β，Wnt，mTOR和PI3K/Akt等多種信號通路，參與乳腺癌的耐藥性[30,31]。而根據(jù)本文測序得到的實驗數(shù)據(jù)，結(jié)合生信分析方法，并通過分子生物學實驗證實，可獲得外泌體攜帶small RNA通過其他未知通路在乳腺癌耐藥中的作用，因此，本文的測序結(jié)果還可為泌體攜帶small RNA在乳腺癌耐藥中的分子機制研究提供依據(jù)。

然而，siRNA由雙鏈RNA(Double Strand RNA，dsRNA) 在細胞內(nèi)被RNase III (如Dicer) 切割成21-25bp大小的雙鏈RNA，因siRNA可以是外源的，如病毒RNA復(fù)制中間體所形成或由人工導(dǎo)入；也可以是內(nèi)源的，如細胞中單鏈RNA在RNA依賴的RNA聚合酶的作用下所形成，用常規(guī)測序方法難以區(qū)分，因此，在本研究中并未測序檢測。

綜上所述，本研究測序檢測了乳腺癌耐藥株外泌體中small RNA表達差異，為外泌體攜帶small RNA在乳腺癌耐藥中的機制研究提供依據(jù)。