王治會，彭 華，楊普香，*，江新鳳，李文金，岳翠男，李 琛，李延升

(1.江西省蠶桑茶葉研究所/江西省茶葉質(zhì)量與安全控制重點實驗室，江西 南昌 330202；2.江西省經(jīng)濟(jì)作物研究所 ，江西 南昌 330202)

白化、黃化茶樹屬于茶樹中的珍稀資源，是一類代謝機制特異的葉色突變體[1-2]。用此類葉色突變體為原料制作的茶產(chǎn)品，因形美香高、滋味鮮爽、苦澀味低而受到消費者青睞，使其經(jīng)濟(jì)價值更高，已成為各地茶企茶農(nóng)增收的重要途徑[3]。黃金菊為黃化茶樹品種中的一種，是20世紀(jì)80年代江西省修水縣茶葉科學(xué)研究所科研人員從寧州群體種中經(jīng)單株優(yōu)選培育而成，嫩梢芽葉呈黃色，似菊花而得名[4]；后引種到贛中丘陵地區(qū)江西省蠶桑茶葉研究所，未因地理環(huán)境不同而改變其特性[5]。江西省蠶桑茶葉研究所科研人員將黃金菊自然雜交的種子播種之后，萌發(fā)率高，且其實生苗單株表型差異性極大，芽葉色澤與葉片性狀多樣，為葉色特異資源篩選提供了另外一種可能性，且極具篩選優(yōu)異單株的潛力。

自然雜交指的是近期或者歷史上自然發(fā)生的沒有受到人為因素干擾的物種雜交事件，是植物物種形成的主要驅(qū)動力[6]，不僅可以增加遺傳多樣性和物種的適應(yīng)性，而且可以導(dǎo)致物種的輻射式演化，促進(jìn)大量物種在相對較短的時期內(nèi)形成，也可增加物種對植食作用、病原體和寄生蟲壓力的抗性，在應(yīng)對氣候劇變、蟲害爆發(fā)、病原菌等環(huán)境壓力時，可能會表現(xiàn)更出色[7-9]。沈紅香等[10]對王族觀賞海棠的自然雜交遺傳多樣性進(jìn)行研究，結(jié)果表明，其在形態(tài)和分子遺傳水平上都具有豐富的多樣性，尤其在形態(tài)上的差異更為顯著，這些變異為觀賞海棠的品種育種提供了良好材料。王玉等[11]的研究結(jié)果表明，玫瑰自然雜交后代的遺傳多樣性豐富，親本來源的多樣性使得玫瑰的分類體系增加了2個類系，為培育玫瑰新品種提供材料與依據(jù)。趙麗娜等[12]對藍(lán)莓的自然雜交品系進(jìn)行綜合評價，從中篩選到了5個優(yōu)良品系。范凱等[13]研究表明，茶樹黃山種自然雜交后代發(fā)生了基因的分離和重組，產(chǎn)生了豐富的遺傳變異，部分單株一芽三葉長、百芽質(zhì)量較大，為后續(xù)系統(tǒng)選種提供了優(yōu)異種質(zhì)材料。楊軍等[14]對茶樹6個自然雜交群體進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)各群體遺傳多樣性差異不同，福云6號最高，白雞冠、悅茗香、紫玫瑰相當(dāng)，金觀音、金牡丹次之。本研究以前期標(biāo)記的17份芽葉性狀表現(xiàn)較好的黃金菊自然雜交單株為材料，鑒定其23項表型性狀，分析其表型變異與Shannon-Weaver多樣性，從中篩選表型優(yōu)良單株，分析其生化成分差異，最終利用主成分分析進(jìn)行生化品質(zhì)評價。以期明確黃金菊自然雜交單株的表型變異與多樣性，從中篩選優(yōu)良單株，為進(jìn)一步探索其自然雜交后表型變異的分子機理與開發(fā)利用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗樣品

2013年秋季，從黃化變異茶樹品種黃金菊母株上采集種子，母株周邊均為國內(nèi)各區(qū)域茶樹種質(zhì)資源，位于江西省蠶桑茶葉研究所茶樹品種園內(nèi)。2014年春季進(jìn)行播種，2017—2018年從中標(biāo)記17份芽葉性狀表現(xiàn)較好的單株，見圖1。2018—2020年連續(xù)3 a對標(biāo)記單株進(jìn)行表型性狀鑒定與生化成分分析，生化樣品為春季采摘各單株一芽二葉鮮葉，采用微波殺青，然后于80 ℃烘干固樣。

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品

咖啡堿、沒食子酸(GA)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表沒食子兒茶素(EGC)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG)、表兒茶素(EC)、兒茶素沒食子酸酯(CG)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)和兒茶素(C)等標(biāo)準(zhǔn)品的純度為98%，購買于成都普瑞法科技開發(fā)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 表型性狀鑒定

參考《NY/T 2422—2013 植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南 茶樹》，測定黃金菊生長勢，結(jié)果為中等。以黃金菊為標(biāo)準(zhǔn)品種，比其生長勢差的標(biāo)記為弱，比其生長勢好的標(biāo)記為強；物候期測定以福鼎大白茶為對照，在春季固定觀察單株越冬頂芽，當(dāng)有三分之一達(dá)到一芽一葉時，即為此單株的一芽一葉期。一芽一葉期與福鼎大白茶相差在5 d之內(nèi)的物候期為早，比福鼎大白茶晚5～10 d的為中，晚10 d以上的為晚；樹型、樹姿、葉片大小、葉片著生狀態(tài)、葉形、葉色、葉基、葉身、葉尖、葉面、葉緣、葉質(zhì)、葉齒形態(tài)、芽葉茸毛、葉長、葉寬、葉面積、葉脈對數(shù)、單芽長、一芽二葉長等測定參考《NY/T 1312—2007 農(nóng)作物種質(zhì)資源鑒定技術(shù)規(guī)程 茶樹》；芽葉色澤為實際觀察到的色澤。

1.2.2 生化成分測定

咖啡堿、兒茶素組分(GA、GC、EGC、C、EC、EGCG、GCG、ECG)含量測定采用高效液相色譜法。色譜柱為Hypersil BDS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相A為3‰冰乙酸溶液，流動相B為純乙腈。流動相A：0～5 min為95%～92%，5～15 min為92%～88%，15～30 min為88%～80%，30～31 min為88%～0%，31～35 min為0%；流動相B：0～5 min為5%～8%，5～15 min為8%～12%，15～30 min為12%～20%，30～31 min為20%～100%，31～35 min為100%。進(jìn)樣量為10 μL，柱溫為35 ℃，流速為1 mL·min-1；檢測波長為278 nm。茶多酚含量測定參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 8313—2018，游離氨基酸含量測定參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 8314—2013，水浸出物含量測定參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 8305—2013。每個樣品測定進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。酚氨比=茶多酚含量/游離氨基酸含量，兒茶素苦澀味指數(shù)=(EGCG+ECG+EGC+GC)/(EC+C)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

在對表型性狀中的描述型性狀進(jìn)行數(shù)據(jù)分析時，先對各性狀的描述等級進(jìn)行賦值，然后進(jìn)行統(tǒng)計分析。表型性狀Shannon-Weaver多樣性指數(shù)=-ΣXj×lnXj，Xj是某生化成分第j個級別出現(xiàn)的頻率。

級別劃分利用各性狀指標(biāo)平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差分為10級：第1級為Y1<(-2θ)，第10級為Y10≥(+2θ)。其中，為各性狀指標(biāo)的平均數(shù)，θ為各性狀指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)差，每0.5θ為1級。數(shù)據(jù)描述性統(tǒng)計、LSD方差分析采用軟件SPSS 19.0，柱狀圖制作采用Excel 2016，主成分分析、變異系數(shù)與多樣性指數(shù)的分布圖制作采用軟件Origin 2018。

2 結(jié)果與分析

2.1 描述型性狀的變異與多樣性

17份自然雜交后代單株的描述型性狀統(tǒng)計見表1，描述型性狀的變異系數(shù)與多樣性分布見圖2。變異系數(shù)范圍為0%～57.23%，均值為33.88%。從圖2的變異系數(shù)分布圖中可以看出，存在2個離群點，分別為樹型和樹姿，它們的變異系數(shù)均為0，說明經(jīng)過自然雜交之后，其后代在樹型與樹姿2個性狀上沒有發(fā)生變異，樹型均為灌木型，樹姿均為開張。其他性狀的變異較大，且分布較為均勻，變異系數(shù)高于均值的性狀依次為芽葉色澤、芽葉茸毛、葉緣、物候期、葉質(zhì)、葉面、生長勢、葉齒形態(tài)、葉色、葉片大小。多樣性指數(shù)范圍為0～1.78，均值為0.81；從多樣性指數(shù)分布圖上來看，存在3個離群點，分別是樹型、樹姿和芽葉色澤，因樹型和樹姿這2個性狀未發(fā)生變異，所以不存在多樣性；芽葉色澤的多樣性明顯高于其他性狀，主要原因在于芽葉色澤的變異系數(shù)最大，變異程度最高，所以自然雜交后代中產(chǎn)生了豐富的多樣性，多樣性指數(shù)高于均值的性狀依次為芽葉色澤、葉色、生長勢、物候期、葉尖、葉質(zhì)、葉面、葉緣、葉齒形態(tài)、芽葉茸毛。江西省茶樹種質(zhì)資源的表型多樣性均值為0.9，變異系數(shù)為35.32%[15]。與本研究相比，黃金菊自然雜交后代的變異系數(shù)與多樣性稍低，但相差不大，由此說明黃金菊自然雜交后代的多樣性極其豐富，遺傳改良潛力巨大。

表1 描述型性狀的描述性統(tǒng)計Table 1 Descriptive statistics of descriptive traits

黃金菊自然雜交后代的芽葉色澤極其多樣化，包括8種，黃金菊本身為黃化變異品種，經(jīng)過自然雜交之后，其顏色變異更加豐富，維持了母株芽葉黃色的有3株，淺黃色1株，紫黃色1株，紫色1株，綠色系列11株。葉片大小有2種類型，包括中葉和小葉，以小葉形為主，占比76%。葉片著生狀態(tài)以上斜為主；葉形包括近圓形、橢圓形、長橢圓形這3種，以橢圓形為主，占比65%。葉色較為多樣化，包括深綠、綠、淺綠和黃綠這4種。葉基有2種，主要為近圓形。葉身主要為內(nèi)折。葉尖主要為漸尖，葉面主要為微隆起和平。葉緣主要為平。葉質(zhì)主要為中和柔軟。葉齒形態(tài)主要為鋸齒形和少齒形。芽葉茸毛主要為少。生長勢和物候期是茶樹品種選育所關(guān)注的主要性狀，生長勢決定了茶樹成活之后的生長能力，生長勢越強，茶樹的育芽能力越強，往往適應(yīng)性越強。物候期與春茶上市時間息息相關(guān)，春茶上市時間越早，其經(jīng)濟(jì)價值越大。所以在資源篩選時，一般選擇生長勢較好和物候期較早的茶樹品系[16-17]。黃金菊自然雜交后代中生長勢達(dá)到強的有5個單株，占比29%，達(dá)到中的有7株，占比41%；物候期達(dá)到早的有4個單株，占比24%，達(dá)到中的有6株，占比35%。黃金菊母株的生長勢為中，物候期為晚；在自然雜交后代中有7份生長勢和物候期均在中等以上，分別為HJJ-1、HJJ-7、HJJ-9、HJJ-11、HJJ-12、HJJ-14和HJJ-17，這7份單株的表型性狀表現(xiàn)較好。

2.2 數(shù)量型性狀的變異與多樣性

數(shù)量型性狀的描述統(tǒng)計見表2，變異系數(shù)與多樣性指數(shù)分布見圖3，數(shù)量型性狀的變異系數(shù)范圍為10.33%～19.82%，均值為14.68%；從分布圖上來看，沒有離群點，呈兩極分散，葉面積、單芽長和一芽二葉長變異較大，葉長、葉寬和葉脈對數(shù)變異較小。多樣性指數(shù)范圍為1.14～1.95，均值為1.75；從分布圖上可以看出存在1個離群點，為葉脈對數(shù)，其他性狀分布集中。葉脈對數(shù)的變異較小，其多樣性程度最低。

表2 黃金菊自然雜交后代數(shù)量型性狀的描述性統(tǒng)計Table 2 Descriptive statistics of quantitative traits in natural hybrid progenies of Huangjinju

2.3 化學(xué)成分差異性

通過對黃金菊自然雜交單株的物候期和生長勢進(jìn)行分析，篩選出7份表現(xiàn)較好的單株，其主要生化成分和LSD方差分析結(jié)果見表3。水浸出物、茶多酚、游離氨基酸、咖啡堿是影響茶葉品質(zhì)的重要次生代謝物質(zhì)[18]。水浸出物含量影響茶湯濃度，其含量范圍為35.67%～44.84%，HJJ-9、HJJ-14和HJJ-17的水浸出物含量與黃金菊無顯著性差異(P>0.05)，另外4份單株的水浸出物含量顯著低于黃金菊。游離氨基酸是茶湯鮮爽味的重要貢獻(xiàn)成分，也是茶葉香氣形成的關(guān)鍵因子，含量越高，茶葉品質(zhì)越好[19]。7份單株中游離氨基酸含量范圍為3.34%～4.47%，有6份高于黃金菊，HJJ-9、HJJ-12和HJJ-14的游離氨基酸含量顯著(P<0.05)高于黃金菊。咖啡堿是茶湯苦味的主要貢獻(xiàn)成分，也影響茶樹的抗蟲性與抗病性[19]，其含量范圍為4.07%～4.66%，7份單株的咖啡堿含量均與黃金菊無顯著(P>0.05)差異，說明黃金菊自然雜交后代中咖啡堿含量無明顯變化。茶多酚對茶湯的苦澀味、色澤等有重要貢獻(xiàn)，同時也影響茶樹的抗蟲性和抗病性[19]，其含量范圍為15.32%～21.39%，除HJJ-9外，其他6個單株的茶多酚含量均顯著(P<0.05)低于黃金菊。酚氨比對茶葉適制性有參考意義，一般認(rèn)為比值高的茶葉適制紅茶，低的適制綠茶[20-21]。7份單株的酚氨比范圍為3.46～5.20，均顯著(P<0.05)低于黃金菊。

表3 黃金菊自然雜交后代主要生化成分的差異分析Table 3 Difference analysis of main biochemical components in natural hybrid progenies of Huangjinju

續(xù)表3 Continued Table 3

兒茶素對茶湯的苦澀味有重要貢獻(xiàn)，包括簡單兒茶素和酯型兒茶素，兒茶素苦澀味指數(shù)越大，苦澀味越重，能夠在一定程度上反映兒茶素品質(zhì)[22-24]。7份單株的總兒茶素含量為11.67%～17.71%，均顯著(P<0.05)低于黃金菊。酯型兒茶素的變化趨勢與總兒茶素相同；而簡單兒茶素的變化趨勢與總兒茶素相反，7份單株中有6份高于黃金菊，其中4份顯著(P<0.05)高于黃金菊?？酀吨笖?shù)范圍為4.69～10.72，除HJJ-14外，其他6份單株的苦澀味指數(shù)顯著(P<0.05)低于黃金菊。

從上述生化成分分析可以看出，黃金菊在自然雜交之后，除咖啡堿在各單株中無顯著差異之外，其他各成分之間均有顯著差異。自然雜交后代部分單株的游離氨基酸和簡單兒茶素含量顯著(P<0.05)提高；茶多酚、總兒茶素、酯型兒茶素含量，以及酚氨比和苦澀味指數(shù)顯著(P<0.05)降低。這些改變對茶樹鮮葉制茶品質(zhì)提升具有重要作用，說明能夠從這些自然雜交后代中篩選出生化成分優(yōu)良的單株。

2.4 優(yōu)選單株綜合評價

《非主要農(nóng)作物品種登記指南 茶樹》中以水浸出物、茶多酚、游離氨基酸和咖啡堿作為茶樹品種品質(zhì)分析的主要成分。兒茶素苦澀味指數(shù)能夠體現(xiàn)兒茶素品質(zhì)[22]，所以本研究以水浸出物、茶多酚、游離氨基酸、咖啡堿和兒茶素苦澀味指數(shù)為變量，采用主成分分析對篩選的7份表型性狀較好的單株進(jìn)行生化成分綜合評價，評價結(jié)果見圖4。提取的前2個主成分能夠解釋85.5%的變異，說明模型的解釋度較高。最終建立的綜合評價指數(shù)模型為Y=0.69PC1+0.31PC2(PC1和PC2分別代表第一主成分和第二主成分的線性模型)。從載荷圖上可以看出各生化成分分散在4個不同的象限內(nèi)，說明采用的5個變量相互之間的信息重疊較少，具有代表性。從圖4可以看出，HJJ-12、HJJ-1、HJJ-7、HJJ-11和HJJ-17這5份單株的評價結(jié)果比黃金菊好，HJJ-9和HJJ-14比黃金菊差，說明HJJ-12、HJJ-1、HJJ-7、HJJ-11和HJJ-17這5份單株的表型與生化品質(zhì)均較好，可以進(jìn)一步進(jìn)行扦插繁育，形成系列新品系。江新鳳等[5]的研究表明，黃金菊適合制作綠茶。通過各單株的酚氨比可以初步判斷其適制性，黃金菊的酚氨比為6.51，所篩選的這5份單株的酚氨比均在5.2以下，初步判斷均適合制作綠茶。HJJ-12的特征為芽葉綠色，生長勢強，物候期早，游離氨基酸含量高，茶多酚含量低；HJJ-1的特征為芽葉深綠色，生長勢強，物候期早，咖啡堿含量低；HJJ-7的特征為芽葉黃色，生長勢中，物候期中，茶多酚含量低；HJJ-11的特征為芽葉黃色，生長勢中等，物候期早，酚氨比低；HJJ-17的特征為芽葉紫色，生長勢中等，物候期中，水浸出物含量高。

3 結(jié)論

17份黃金菊自然雜交單株的表型性狀中樹型與樹姿無變異，也無多樣性，其他表型性狀變異較大且多樣性豐富，其中以芽葉色澤、芽葉茸毛、物候期、生長勢和部分葉片性狀的變異較大。篩選出7份表型優(yōu)良單株，其生化成分中咖啡堿含量無顯著差異，其他成分差異顯著；與黃金菊相比，部分自然雜交單株的游離氨基酸和簡單兒茶素含量顯著提升，而茶多酚、總兒茶素、酯型兒茶素含量顯著下降。最終篩選出了5份表型與生化品質(zhì)較好的單株，初步判斷它們均適合制作綠茶，各單株具有典型特征；其中，HJJ-12和HJJ-1芽葉為綠色，HJJ-7和HJJ-11芽葉為黃色，HJJ-17芽葉為紫色。特異性(芽葉顏色、功能成分等)茶樹資源發(fā)掘是茶樹品種選育工作的重點，通過對黃化品種黃金菊自然雜交后代的表型變異與多樣性的研究，能夠初步看到變異茶樹品種經(jīng)過雜交之后，能夠產(chǎn)生更加多樣化的種質(zhì)，所以以變異的白化、黃化、紅芽和紫芽等特異品種為親本進(jìn)行雜交，可以作為一種種質(zhì)創(chuàng)新的途徑。另外，本研究僅對表型性狀和部分生化成分進(jìn)行了鑒定，產(chǎn)生表型變異和多樣性的原因之一為功能基因的表達(dá)差異，進(jìn)一步的研究將集中在探索其產(chǎn)生變異的分子機理。