樊利虹，郭紅瑞，吳 江，易 軍，馬曉平，茍麗萍，謝 躍，葉 剛，左之才，*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 溫江 611130；2.深圳海關(guān)動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東 深圳 518045；3.四川省畜牧科學(xué)研究院，四川 成都 610066)

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株來(lái)源

供試的5株皮特不動(dòng)桿菌分別于2018年7月分離自四川南充(ZZCNC1807-4、ZZCNC1807-6和ZZCNC1807-7菌株)、宜賓(ZZCJL1807-8菌株)、什邡(ZZCSF1807-9菌株)發(fā)生BRDC的肉牛鼻拭子。發(fā)病牛臨床表現(xiàn)為體溫升高(達(dá)41 ℃)，流鼻液，呼吸困難，口有泡沫，部分牛有口腔潰瘍等癥狀，但蹄部、關(guān)節(jié)等無(wú)異常，有環(huán)丙沙星、阿莫西林、青霉素、頭孢喹肟、氟苯尼考、替米考星、板藍(lán)根等用藥史，但病情總是反復(fù)。

1.1.2 主要試劑與配置

營(yíng)養(yǎng)肉湯(NB)、革蘭氏染色液、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)，購(gòu)自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；瓊脂粉、GoldView Ⅰ核酸染色劑，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；多聚甲醛，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；PBS磷酸鹽緩沖液(0.01 mol·L-1，pH值7.2～7.4)，購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒，購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；BM 2000+DNA marker、2×TaqPCR MasterMix，購(gòu)自北京博邁德生物技術(shù)有限公司。

普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA)：分別稱取1.8 g NB、1.5 g瓊脂粉，加100 mL雙蒸水(ddH2O)，高壓蒸汽滅菌后使用。

4%多聚甲醛：稱取多聚甲醛40 g，加PBS磷酸鹽緩沖液500 mL，置于50 ℃水浴鍋加熱攪拌至完全溶解，待冷卻后加PBS磷酸鹽緩沖液定容至1 000 mL，最后調(diào)節(jié)pH值至7.4左右。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

選用健康的4～5周齡、體重18～20 g的雄性SPF級(jí)昆明小鼠78只作為試驗(yàn)對(duì)象。試驗(yàn)動(dòng)物均購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2 毒力基因檢測(cè)

將5株皮特不動(dòng)桿菌分別接種于TSB中，37 ℃培養(yǎng)24 h后，按照細(xì)菌基因組提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)提取基因組DNA。ompA、bfmS、kpsMTⅡ、cnf1、cnf2、bap、epsA、plcD、lpxM、feoA、blaPER-1等11種毒力基因的檢測(cè)均采用PCR法，引物序列和反應(yīng)條件均參照文獻(xiàn)[14-15]，并總結(jié)于表1。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 皮特不動(dòng)桿菌毒力基因檢測(cè)的PCR引物序列Table 1 Primers sequence of virulence gene of Acinetobacter pittii

1.3 小鼠致病性試驗(yàn)

1.3.1 菌液制備

gyrB基因序列同源性分析和MLST分型結(jié)果顯示，ZZCNC1807-4、ZZCNC1807-6、ZZCNC1807-7和ZZCJL1807-8菌株為同一序列型?；诖耍x擇菌株ZZCNC1807-6和ZZCSF1807-9用于小鼠致病性試驗(yàn)。將2株菌的純培養(yǎng)物接種于TSB中，37 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)24 h后，采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定2株菌的菌落形成單位(CFU)，計(jì)算稀釋前菌液的濃度(CFU·mL-1)。

1.3.2 動(dòng)物分組與細(xì)菌接種量

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，將小鼠隨機(jī)分為2組，每組分為6個(gè)濃度梯度，每個(gè)梯度6只，分別給不同組別小鼠注射0.2 mL相應(yīng)濃度的菌液(攻菌組)，對(duì)照組6只小鼠采用同樣方式注射等體積的NB。攻菌組和對(duì)照組小鼠飼養(yǎng)條件(飼料、飲水等)相同，隔離飼養(yǎng)。

1.3.3 臨床癥狀觀察與LD50測(cè)定

感染細(xì)菌后24 h內(nèi)，每隔2 h觀察一次小鼠的發(fā)病情況、精神狀態(tài)和外觀體況；感染24 h后，每天觀察一次，連續(xù)觀察7 d，并詳細(xì)記錄不同組別中小鼠的死亡數(shù)量。根據(jù)小鼠死亡情況，采用改良寇氏法計(jì)算菌株ZZCNC1807-6和ZZCSF1807-9對(duì)SPF級(jí)昆明小鼠的LD50。

1.3.4 組織病理學(xué)檢查

及時(shí)剖檢死亡小鼠，無(wú)菌采集攻菌組和對(duì)照組小鼠的心、肝、脾、肺、腎等器官，置于4%的多聚甲醛內(nèi)(多聚甲醛體積為組織樣品體積的10～15倍)，固定24 h以上，送成都里來(lái)生物科技有限公司制作病理切片，并對(duì)所制作的切片進(jìn)行顯微鏡觀察。

1.3.5 器官載菌量分析

無(wú)菌取病死小鼠的肝、心、脾、肺、腎和腦等器官，先用微量電子天平稱量質(zhì)量，然后放置于預(yù)冷的玻璃研磨器中，加入1 mL無(wú)菌預(yù)冷PBS磷酸鹽緩沖液一起研磨，將勻漿加入無(wú)菌EP管中，再加入2 mL無(wú)菌預(yù)冷PBS磷酸鹽緩沖液將研磨器中的部分殘?jiān)鼪_洗下來(lái)，然后進(jìn)行10倍的梯度稀釋。吸取各濃度勻漿液100 μL，接種于NA中37 ℃孵育24 h，記錄培養(yǎng)基表面的單個(gè)菌落數(shù)，計(jì)算載菌量。

2 結(jié)果與分析

2.1 毒力基因檢測(cè)結(jié)果

供試的5株牛源皮特不動(dòng)桿菌中，bap(圖1-A)、plcD(圖1-B)、lpxM(圖1-C)和feoA(圖1-D)基因的檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性；菌株ZZCSF1807-9中ompA基因(圖1-E)的檢測(cè)結(jié)果為陰性，其余4株菌為陽(yáng)性；epsA基因僅在ZZCSF1807-9中檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性(圖1-F)；其余毒力基因的檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

2.2 臨床癥狀與死亡情況

接種ZZCNC1807-6和ZZCSF1807-9菌株的小鼠，8 h后均開(kāi)始出現(xiàn)精神沉郁、飲食欲降低、扎堆畏寒等現(xiàn)象(圖2-A)；10 h時(shí)，部分小鼠出現(xiàn)被毛紊亂，并伴有呼吸頻率加快、眼眶發(fā)炎癥狀(圖2-B)；12 h時(shí)，攻菌組小鼠開(kāi)始出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，且較高劑量組小鼠在感染12～24 h內(nèi)全部死亡。試驗(yàn)期間，對(duì)照組小鼠健康狀況良好，未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。

采用改良寇氏法計(jì)算得知，菌株ZZCNC1807-6和ZZCSF1807-9的LD50分別為4.487×107CFU·mL-1和3.177×108CFU·mL-1。感染劑量與死亡率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果詳見(jiàn)表2。

表2 供試菌株對(duì)SPF級(jí)昆明小鼠的感染試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Test result of strains to SPF Kunming mice

2.3 病理學(xué)觀察

剖檢死亡小鼠，ZZCNC1807-6和ZZCSF1807-9攻菌組小鼠均出現(xiàn)皮下充血、腸道積氣積液現(xiàn)象，且接種菌株ZZCNC1807-6的小鼠肺中淤血現(xiàn)象較接種ZZCSF1807-9的小鼠嚴(yán)重，其余實(shí)質(zhì)器官(肝、腎、心、脾、腦)未見(jiàn)明顯眼觀病理變化(圖3)。

2.4 組織病理學(xué)觀察

如圖4所示：ZZCNC1807-6攻菌組小鼠肺間質(zhì)明顯增寬，其中有少量炎性細(xì)胞(淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞)浸潤(rùn)，肺泡壁毛細(xì)血管充血，血管內(nèi)可見(jiàn)少量白細(xì)胞和白細(xì)胞邊緣化；肝淤血，肝細(xì)胞腫脹，發(fā)生空泡變性，可見(jiàn)少數(shù)肝細(xì)胞壞死，中央靜脈血管內(nèi)較多白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞邊緣化；脾充血、出血，脾白髓區(qū)可見(jiàn)淋巴細(xì)胞變性壞死，見(jiàn)胞核碎裂，周圍少量纖維增生；心、腎未見(jiàn)明顯病理變化。ZZCSF1807-9攻菌組小鼠肺間質(zhì)明顯增寬，其中有少量炎性細(xì)胞(淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞)浸潤(rùn)，肺泡壁毛細(xì)血管充血，血管內(nèi)可見(jiàn)少量白細(xì)胞和白細(xì)胞邊緣化；肝細(xì)胞腫脹，肝中少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，中央靜脈內(nèi)少量白細(xì)胞邊緣化；脾白髓部分脾小結(jié)細(xì)胞變性壞死，見(jiàn)胞核碎裂，周圍少量纖維增生，紅髓未見(jiàn)明顯淤血和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；心、腎未見(jiàn)明顯病理變化。

2.5 小鼠各器官細(xì)菌定殖情況和載菌量

無(wú)菌采集死亡小鼠各器官劃線培養(yǎng)，ZZCNC1807-6和ZZCSF1807-9攻菌組小鼠均分離到與試驗(yàn)菌株培養(yǎng)特性、革蘭氏染色形態(tài)相同的細(xì)菌(圖5、圖6)，經(jīng)16S rDNA和gyrB基因測(cè)序比對(duì)，從小鼠各器官中分離到的細(xì)菌與所接種的試驗(yàn)菌株一致；對(duì)照組小鼠各器官中未分離出細(xì)菌。

小鼠器官載菌量分析結(jié)果(表3)顯示，2株皮特不動(dòng)桿菌對(duì)小鼠肝、心、脾、肺和腎的侵襲力差異不大，但ZZCNC1807-6對(duì)小鼠腦部的侵襲力強(qiáng)于ZZCSF1807-9。

表3 ZZCNC1807-6和ZZCSF1807-9菌株接種小鼠各臟器的載菌量Table 3 Bacterial load in various organs of mice inoculated with ZZCNC1807-6 and ZZCSF1807-9 CFU·g-1

3 討論

近年，皮特不動(dòng)桿菌在醫(yī)院內(nèi)的分離率越來(lái)越高，僅次于鮑曼不動(dòng)桿菌[16]。然而，關(guān)于皮特不動(dòng)桿菌與動(dòng)物疾病相關(guān)的報(bào)道較少?，F(xiàn)有報(bào)道中該菌主要引起水生動(dòng)物患敗血癥或菌血癥[17]，也有報(bào)道稱該菌可能與犬、貓的呼吸道疾病有關(guān)[18]。Li等[19]和Malick等[17]研究發(fā)現(xiàn)，皮特不動(dòng)桿菌感染武昌魚(yú)和鯪魚(yú)后，可致其出現(xiàn)鱗片脫落、腹水、皮膚潰爛、尾鰭腐爛等敗血癥癥狀，組織病理學(xué)觀察均可見(jiàn)肝臟空泡變性。Wang等[20]報(bào)道，皮特不動(dòng)桿菌可致泥鰍出現(xiàn)精神沉郁、嗜睡、食欲下降、皮膚黏液脫落、全身多處淤血等臨床癥狀，剖檢可見(jiàn)腹水、肝臟充血等病變。但目前關(guān)于皮特不動(dòng)桿菌引起畜禽動(dòng)物感染發(fā)病的報(bào)道極少，僅少量報(bào)道從家兔體內(nèi)[21]和部分家畜寄生蟲(chóng)體內(nèi)[16]檢測(cè)到該菌，且未見(jiàn)皮特不動(dòng)桿菌對(duì)小鼠致病性的研究報(bào)道。

本試驗(yàn)對(duì)5株牛源皮特不動(dòng)桿菌進(jìn)行了毒力基因檢測(cè)，結(jié)果顯示，5株菌均攜帶有參與生物膜形成的bap基因、侵襲性毒力因子plcD、對(duì)不動(dòng)桿菌拮抗陽(yáng)離子肽和干燥環(huán)境起關(guān)鍵作用的lpxM基因和具有鐵攝取能力的feoA基因。其中，ZZCSF1807-9的ompA基因檢測(cè)結(jié)果為陰性，另4株菌為陽(yáng)性；ZZCSF1807-9含有免疫逃逸作用的epsA基因，而其余4株菌未攜帶該基因。以上現(xiàn)象的出現(xiàn)可能與來(lái)自不同地區(qū)的菌株毒力強(qiáng)弱差異有關(guān)。小鼠致病性試驗(yàn)中，菌株ZZCNC1807-6和ZZCSF1807-9腹腔感染小鼠后，可在較短時(shí)間內(nèi)致小鼠出現(xiàn)精神沉郁、被毛紊亂、呼吸頻率加快、眼眶發(fā)炎等癥狀，并在24 h內(nèi)出現(xiàn)死亡，但其LD50差異較大。從試驗(yàn)結(jié)果判斷，ZZCNC1807-6的毒力強(qiáng)于ZZCSF1807-9。剖解死亡小鼠可見(jiàn)，皮特不動(dòng)桿菌主要造成小鼠皮下充血、肺淤血腫脹和腸道積氣積液，且ZZCNC1807-6攻菌組小鼠的肺病變較ZZCSF1807-9攻菌組嚴(yán)重，其余器官中并未觀察到明顯眼觀病變。組織病理學(xué)觀察結(jié)果顯示，該菌對(duì)小鼠機(jī)體的損傷主要表現(xiàn)在肝和肺中有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，脾中白髓細(xì)胞壞死和纖維增生，且ZZCNC1807-6攻菌組小鼠的病變較ZZCSF1807-9攻菌組相對(duì)嚴(yán)重。但2組小鼠的組織病變均較輕微，可能是由于小鼠是在短時(shí)間內(nèi)發(fā)生急性死亡的，各器官還未發(fā)生明顯病變。同時(shí)，細(xì)菌定殖情況和載菌量分析顯示，皮特不動(dòng)桿菌不僅可感染肝、心、脾、肺、腎等多種內(nèi)臟實(shí)質(zhì)器官，還可透過(guò)血腦屏障感染腦部，引起腦膜炎等疾病，導(dǎo)致小鼠死亡。

綜上，分離于BRDC發(fā)病牛鼻拭子的皮特不動(dòng)桿菌對(duì)小鼠具有較強(qiáng)的致病性，表明該菌可能為肉牛呼吸道感染的主要致病菌或繼發(fā)感染病原菌。不同菌株毒力強(qiáng)弱具有差異性，可能與不同地區(qū)的菌株感染來(lái)源有關(guān)。本試驗(yàn)的研究結(jié)果豐富了皮特不動(dòng)桿菌對(duì)動(dòng)物的致病性研究資料，也為深入研究該菌的致病機(jī)理奠定了試驗(yàn)基礎(chǔ)。