張 飄，賀欣薇，楊 霞，曾茂芹，劉妍罕，張揚(yáng)子，楊 穎，3，溫貴蘭，3，程振濤，3，文 明，3，*

(1.貴州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州省畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.貴州省動(dòng)物生物制品工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550025)

核因子κB(nuclear factor-kappa B ，NF-κB)是在1986年由Ranjan Sen等人在鼠B淋巴細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)并將其命名[1]，隨著對(duì)該因子的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)NF-κB家族由5種NF-κB/Rel蛋白組成，分別為NF-κB1(p50)、NF-κB2(p52)、RelA(p65)、RelB和c-Rel，幾乎所有細(xì)胞中均有表達(dá)[2]。NF-κB信號(hào)通路是已知的炎癥發(fā)展的主要通路[3]。NF-κB是免疫細(xì)胞的激活、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞分化增殖凋亡中的重要轉(zhuǎn)錄因子[4]，同時(shí)也是Toll樣受體家族(Toll-like receptors，TLRs)信號(hào)通路的下游信號(hào)分子，在調(diào)控炎癥因子轉(zhuǎn)錄中占有主要地位[5]，最新的研究表明，其還與海馬神經(jīng)元損傷[6]及癲癇[7]有關(guān)。當(dāng)細(xì)胞處于健康或未受到外界刺激時(shí)，NF-κB的p65亞基與κB抑制蛋白-α(IκB-α)會(huì)結(jié)合在一起，從而覆蓋NF-κB1核蛋白定位信號(hào)，使NF-κB1以失活狀態(tài)存在于胞質(zhì)中，但當(dāng)細(xì)胞受到外界中某些細(xì)胞因子、細(xì)菌、病毒感染及內(nèi)毒素等刺激時(shí)[8-10]，就會(huì)使IκB-α磷酸化后被降解，從而暴露出NF-κB1核蛋白定位信號(hào)[11]，NF-κB1與IκB-α解離后會(huì)迅速轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，并與核內(nèi)DNA特定靶部位結(jié)合，啟動(dòng)相關(guān)靶基因轉(zhuǎn)錄[12]，從而引起一系列生理病理過(guò)程。以往對(duì)NF-κB1基因檢測(cè)的多為蛋白水平，缺少轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)方法，而本實(shí)驗(yàn)室基于前期在DEV增殖和NF-κB信號(hào)通路方面的探索，建立了可為進(jìn)一步研究 NF-κB 信號(hào)通路中NF-κB1基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)的熒光定量PCR方法，并對(duì)鴨胚成纖維細(xì)胞(duck embryo fibroblasts，DEF)在感染鴨腸炎病毒(DEV)后NF-κB1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量的時(shí)間變化情況進(jìn)行了檢測(cè)，以此來(lái)闡明NF-κB信號(hào)通路與DEV增殖的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與毒株

受精鴨蛋，購(gòu)自貴州省三穗縣三穗鴨保種場(chǎng)，經(jīng)DEV核酸檢測(cè)為陰性；鴨腸炎病毒DEV-GZ株，由貴州省動(dòng)物生物制品工程技術(shù)研究中心提供。

1.1.2 主要試劑

胎牛血清，購(gòu)自杭州四季清公司；胰蛋白酶，購(gòu)自Hyclone公司；RNA試劑盒，購(gòu)自天根生化科技有限公司；質(zhì)粒中量抽提試劑盒，購(gòu)自杭州愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)有限公司；PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)、SYBR Premix Ex TaqⅡ(Tli RNaseH Plus)、TRIzol RNA分離試劑、pMDTM19-T載體等，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；DNA凝膠回收試劑盒，購(gòu)自美國(guó)OMEGA公司；E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 目的基因引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank上NF-κB1基因序列(登錄號(hào)：NM-205134)，利用軟件Primer 5.0，設(shè)計(jì)并合成一對(duì)特異性引物，引物預(yù)擴(kuò)增片段為156 bp。引物序列為NF-κB1-F：5′-GATACAACCCAGGACTC-3′；NF-κB1-R：5′-ACATAAGACGCACCAC-3′，送生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2 DEF的制備與cDNA的合成

鴨胚成纖維細(xì)胞(DEF)制備：將受精三穗鴨蛋置于37 ℃恒溫孵化箱中，待其孵化到10 d后取出胚體，并去掉胚體頭部、四肢、內(nèi)臟及紅細(xì)胞，余下部分加入胚體10倍體積0.25%胰蛋白酶溶液，消化一段時(shí)間后，離心后取底部沉淀并加入胎牛血清混勻終止消化，過(guò)濾后溶液中即含有鴨胚成纖維細(xì)胞，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)備用。使用RNA試劑盒提取DEF總RNA，并用NanoDrop-2000測(cè)定儀(重復(fù)3次)確定RNA的純度及未發(fā)生降解后，使用反轉(zhuǎn)錄試劑Prime ScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反轉(zhuǎn)錄條件為：37 ℃反轉(zhuǎn)錄15 min，85 ℃作用5 s。

1.2.3 NF-κB1基因PCR擴(kuò)增、克隆及質(zhì)粒的提取

以1.2.2節(jié)中cDNA為模板，使用50 μL體系對(duì)NF-κB1進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：2×TaqPCR Master Mix 25.0 μL、F/R引物各2.0 μL、cDNA樣本4.0 μL和無(wú)菌無(wú)酶ddH2O 17.0 μL，總體積50.0 μL。將得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，將預(yù)期條帶使用OMEGA膠回收純化試劑盒對(duì)目的基因進(jìn)行純化回收，將回收產(chǎn)物與19-T載體16 ℃連接12 h，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞2 h后，接種到100 mmol·L-1Amp LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，挑取培養(yǎng)基中單個(gè)白色菌落于液體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，將得到的重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR驗(yàn)證，并送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。比對(duì)測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確即為陽(yáng)性質(zhì)粒，測(cè)定濃度，計(jì)算其拷貝數(shù)后[5]，用無(wú)菌雙重蒸水10倍系列稀釋成標(biāo)準(zhǔn)品，4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 NF-κB1基因熒光定量PCR反應(yīng)體系的建立及條件優(yōu)化

以1.2.3中構(gòu)建好的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒(pMD-19T-NF-κB1)為模板，用熒光定量引物在熒光PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增及分析。熒光定量PCR體系為：SYBR premix ExTaqⅡ(Tli RNase H Plus)染料5.0 μL、F/R引物各0.5 μL、cDNA樣本1.0 μL和無(wú)菌無(wú)酶ddH2O 3.0 μL，總體積10.0 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s、退火50～64 ℃ 30 s，共進(jìn)行39個(gè)循環(huán)。以出現(xiàn)熒光的Ct值最小、熒光閾值最高且熔解曲線為單峰，即沒(méi)有非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物作為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)退火溫度及引物進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.5 NF-κB1基因熒光定量PCR方法標(biāo)準(zhǔn)曲線建立及檢驗(yàn)

取1.2.3節(jié)中標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，并設(shè)置陰性對(duì)照(將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒換成同體積無(wú)菌無(wú)酶去離子水)，每個(gè)稀釋濃度做3個(gè)平行重復(fù)，以Ct值為縱坐標(biāo)、底物拷貝數(shù)對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。檢測(cè)NF-κB1基因的熔解曲線，確定熔解峰單峰，以無(wú)菌無(wú)酶的去離子水作陰性對(duì)照，同時(shí)選取本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建好的幾種質(zhì)粒(pMD-19T-ADF、pMD-19T-JAK2、pMD-19T-STAT3、pMD-19T-SOCS1、pMD-19T-IL-1β、pMD-19T-JAK2)，以標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照，進(jìn)行特異性驗(yàn)證。以1.2.3節(jié)中標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，10倍稀釋，共稀釋10個(gè)濃度梯度，然后進(jìn)行qPCR和普通PCR反應(yīng)，檢測(cè)2種方法能檢測(cè)到的最低拷貝數(shù)，進(jìn)而比較其靈敏性。選取3個(gè)濃度梯度(1.0×107～1.0×109copies·mL-1)的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒，將不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，計(jì)算批間和批內(nèi)變異系數(shù)，分析方法的重復(fù)性。

1.2.6 NF-κB1基因熒光定量PCR方法在DEV感染DEF中的初步運(yùn)用

將1.2.2節(jié)中制成的細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液，培養(yǎng)箱中放置4 h，觀察細(xì)胞貼壁后分為兩個(gè)組，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組中每孔接種1 000 LD50的DEV-GZ株0.2 mL DEV病毒液，對(duì)照組加入0.2 mL細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液，每一組設(shè)置5個(gè)重復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)12、24、36、48、60、72、84、96、108和120 h后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，具體步驟同1.2.2節(jié)，利用建立的NF-κB1基因熒光定量PCR方法檢測(cè)在感染DEV前后DEF細(xì)胞中NF-κB1基因轉(zhuǎn)錄變化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 NF-κB1基因PCR結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒

以DEF細(xì)胞中提取并反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到預(yù)期156 bp大小的條帶(圖1)。將重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，并測(cè)序比對(duì)，結(jié)果顯示，PCR鑒定與測(cè)序均與預(yù)期相符，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖2)。在NanoDrop-2000濃度測(cè)定儀上測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度，計(jì)算出其拷貝數(shù)為1.79×1011copies·mL-1，用無(wú)菌無(wú)酶去離子水10倍系列稀釋成1.79×100～1.79×1011copies·mL-1。

2.2 NF-κB1標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

采用矩陣法優(yōu)化退火溫度，結(jié)果顯示，退火溫度為60 ℃時(shí)效果最佳。用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒10倍系列稀釋為模板進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，繪制的曲線呈現(xiàn)典型的S型，各稀釋濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品曲線之間呈現(xiàn)平行，Ct值相差均勻，各稀釋濃度標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值與拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增曲線。擴(kuò)增效率為109.2%，以Ct值為縱坐標(biāo)、底物拷貝數(shù)對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，取連續(xù)的5個(gè)點(diǎn)(1.79×107～1.79×1011copies·mL-1)獲得熒光定量PCR方法標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，模板Ct值(y)與起始拷貝數(shù)(x)關(guān)系式為y=-3.12x+44.086(相關(guān)系數(shù)R2=1)(圖3)，滿足R2>0.99。

2.3 特異性、敏感性和重復(fù)性檢驗(yàn)

特異性、敏感性和重復(fù)性檢驗(yàn)結(jié)果顯示：NF-κB1基因熒光定量PCR的熔解曲線沒(méi)有出現(xiàn)非特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物以及二聚體，呈現(xiàn)單峰，陰性對(duì)照與其他質(zhì)粒均無(wú)擴(kuò)增曲線，陽(yáng)性對(duì)照呈現(xiàn)典型的S型曲線，表示針對(duì)該基因的引物具有良好的特異性(圖4-A、B)。以1.79×100～1.79×109copies·mL-1標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒作為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，均能檢測(cè)到擴(kuò)增信號(hào)，說(shuō)明該方法可檢測(cè)到的拷貝數(shù)為1.79 copies·mL-1，而普通PCR能檢測(cè)到的最低拷貝數(shù)為1.79×102copies·mL-1，因此，建立的NF-κB1基因熒光定量PCR方法比普通PCR高出100倍，說(shuō)明該方法具有良好的靈敏性(圖4-C、D)。選取1.79×107～1.79×109copies·mL-1標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒，分別進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)，批內(nèi)重復(fù)變異系數(shù)分別是0.06%、0.20%、0.04%、0.15%、0.28%、0.07%、0.19%、0.14%和0.15%，批間重復(fù)變異系數(shù)分別是0.17%、0.10%和0.16%，均小于0.3%，說(shuō)明本研究建立的方法重復(fù)性好，具有較高的穩(wěn)定性(表1)。

表1 重復(fù)性檢驗(yàn)Table 1 Repeatability test

2.4 NF-κB1基因熒光定量PCR方法在DEV感染DEF中的初步運(yùn)用

通過(guò)NF-κB1基因熒光定量PCR方法檢測(cè)，DEF在感染DEV前或后，NF-κB1基因在DEF細(xì)胞中隨時(shí)間的改變其轉(zhuǎn)錄水平均無(wú)線性規(guī)律，但DEF細(xì)胞感染DEV后整體轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平高于未感染時(shí)正常細(xì)胞，差異顯著(P<0.05)，其中36～84 hNF-κB1基因的轉(zhuǎn)錄水平與正常細(xì)胞中差異極顯著(P<0.01)(表2、圖5)。

表2 NF-κB1基因在感染DEV前后在DEF細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄水平Table 2 Repeated field value NF-κB1 gene transcription level in DEF cells before and after infection with DEV

3 討論

核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)是一種蛋白質(zhì)復(fù)合體，包括5個(gè)相關(guān)的蛋白質(zhì)，在幾乎所有細(xì)胞中均存在，參與細(xì)胞對(duì)外界刺激的響應(yīng)，包括病原微生物感染、輻射、熱應(yīng)激、重金屬污染等。在大多數(shù)細(xì)胞中，NF-κB是以無(wú)活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激如病原感染、氧化應(yīng)激、促炎細(xì)胞因子刺激等，均能激活NF-κB信號(hào)通路[13]。當(dāng)NF-κB信號(hào)通路被激活后，不需要蛋白質(zhì)合成，在短時(shí)間內(nèi)即可有效影響宿主細(xì)胞的多種生命活動(dòng)。因此，NF-κB信號(hào)通路成為病毒入侵細(xì)胞的重要作用靶點(diǎn)。但一直以來(lái)針對(duì)NF-κB信號(hào)通路的大部分研究都是利用ELISA試劑盒對(duì)關(guān)鍵因子進(jìn)行檢測(cè)[14]，即從蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)，來(lái)分析該通路的變化情況，或者直接對(duì)NF-κB1( p50)蛋白質(zhì)進(jìn)行原核表達(dá)來(lái)分析該通路的變化情況[15]，但免疫學(xué)方法存在一定的誤差，分子生物學(xué)方法可以做到更為精確的檢測(cè)[16]。而且前者只能說(shuō)明蛋白水平的變化情況，沒(méi)有轉(zhuǎn)錄水平的變化情況。目前，檢測(cè)基因mRNA的主要方法有普通PCR、熒光定量PCR、Northern blot、基因芯片和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，而熒光定量PCR作為其中的經(jīng)典方法，從而被廣泛應(yīng)用[17]。本研究為闡明當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí)NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵因子的mRNA變化情況，建立了針對(duì)NF-κB1基因既可靠又精確的熒光定量PCR方法。

本研究采用SYBR Green染料法建立了鴨NF-κB1基因熒光定量PCR方法，該方法熔解曲線沒(méi)有出現(xiàn)非特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物以及二聚體，呈現(xiàn)單峰，特異性檢測(cè)中陰性對(duì)照與其他質(zhì)粒均無(wú)擴(kuò)增曲線，陽(yáng)性對(duì)照呈現(xiàn)典型的S型曲線；靈敏度檢測(cè)表明，該方法最小檢出量為1.79 copies·mL-1，而普通PCR方法最小檢出量為1.79×102copies·mL-1，熒光定量PCR方法是普通PCR最小檢出量的100倍；重復(fù)性檢測(cè)表明，批內(nèi)和批間重復(fù)變異系數(shù)均小于0.3%，綜上所述，本研究建立的NF-κB1基因熒光定量PCR方法具有良好的特異性、靈敏性、重復(fù)性以及具有較高的穩(wěn)定性。

本研究以建立的NF-κB1基因熒光定量PCR方法，首次檢測(cè)并分析感染或不感染DEV對(duì)DEF細(xì)胞中NF-κB1基因整體轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平影響，從而初步探究DEV對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響。DEF細(xì)胞感染DEV后整體轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平高于未感染時(shí)正常細(xì)胞，差異顯著(P<0.05)，其中36～84 hNF-κB1基因的轉(zhuǎn)錄水平與正常細(xì)胞中差異極顯著(P<0.01)，在這過(guò)程中NF-κB可能誘導(dǎo)了大量炎性基因的轉(zhuǎn)錄引發(fā)炎癥反應(yīng)，從而提升病毒致病力。

本研究成功建立了鴨NF-κB1基因熒光定量PCR檢測(cè)方法，并通過(guò)該方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)DEF細(xì)胞感染DEV后NF-κB1基因整體轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平高于未感染時(shí)正常細(xì)胞，在個(gè)別時(shí)段差異極顯著(P<0.01)，且DEV可以激活NF-κB信號(hào)通路。