劉 如，董暢茹，張祎雯，屈銘慧，張 偉，灑海洋，陳海燕，葉文玲，樊 霆

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，農(nóng)田生態(tài)保育與污染防控安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230036)

鎘(Cd)是毒性極大的重金屬，具有生物蓄積性強(qiáng)、毒性持久、難去除、易遷移轉(zhuǎn)化等特點(diǎn)[1]。據(jù)2014年《全國土壤污染狀況調(diào)查公報》，我國耕地土壤污染點(diǎn)位超標(biāo)率達(dá)19.4%，其中Cd超標(biāo)點(diǎn)位數(shù)占全部超標(biāo)點(diǎn)位數(shù)的7.0%[2]。Cd污染農(nóng)田對食品安全、人體健康和生態(tài)環(huán)境都構(gòu)成了嚴(yán)重威脅，制約區(qū)域土地的可持續(xù)開發(fā)利用[3-4]。植物和微生物修復(fù)與傳統(tǒng)的物理化學(xué)修復(fù)方法相比，具有成本低、效果良好和環(huán)境友好等特點(diǎn)，其機(jī)理研究與應(yīng)用前景備受關(guān)注[5-7]。但是，目前國內(nèi)外發(fā)現(xiàn)的Cd超富集植物種類較少，且自然生長環(huán)境條件下具有生物量小、生長緩慢和環(huán)境抵抗能力弱等缺陷，制約了植物修復(fù)在實(shí)際工程中的大規(guī)模應(yīng)用[8]。黑麥草(LoliummultiflorumL.)為一年生或多年生草本植物。一年生黑麥草具有較高的生物乙醇轉(zhuǎn)化率，已被應(yīng)用到發(fā)酵等工業(yè)領(lǐng)域[9]。同時，黑麥草對Cd、Zn、Pb、As、Cu等具有較強(qiáng)的抗性和富集作用，分蘗力強(qiáng)，生長速度快，且季節(jié)適應(yīng)性較強(qiáng)，可用于重金屬修復(fù)[10]。

研究發(fā)現(xiàn)，植物促生菌可促進(jìn)植物在重金屬脅迫環(huán)境下吸收營養(yǎng)，促進(jìn)植物根際對重金屬的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和積累，增強(qiáng)植物抗逆性，提高修復(fù)效率[11-13]。如接種熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)，除可提高紫茉莉(Mirabilisjalapa)在重金屬污染土壤中的種子萌發(fā)率、增加其生物量外，還能顯著促進(jìn)Cd、Cu、Zn、Cr 在紫茉莉根部的積累[14]；內(nèi)生菌摩西管柄囊霉(Funneliformismosseae)BGC XJ02能促進(jìn)Cd超富集植物龍葵(SolanumnigrumL.)在不同Cd濃度條件下的生長和對P的吸收[15]。在Cd污染土壤上接種叢枝菌根真菌(Glomusmosseae)可促進(jìn)黑麥草生長，增強(qiáng)其耐Cd性[16]；黑麥草和叢枝菌根真菌單一或聯(lián)合應(yīng)用均有利于緩解Cd對番茄生長的抑制[17]；抗Cd棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)可通過提升土壤pH值，降低土壤Cd生物有效性，分泌吲哚乙酸(IAA)、1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)脫氨酶，增強(qiáng)黑麥草對Cd的抗性[18]。

用黑麥草修復(fù)Cd污染時，緩解Cd對種子萌發(fā)的毒害作用，提高其種子萌發(fā)期對Cd的耐性，對于保證或提升后期的修復(fù)效果比較關(guān)鍵。為此，本文以耐Cd真菌黑曲霉(Aspergillusniger)TL-F2菌株為研究對象，研究不同Cd濃度脅迫對TL-F2菌株分泌IAA、溶磷和產(chǎn)鐵載體能力的影響，并用不同濃度的孢子液浸泡Cd脅迫條件下的黑麥草種子，研究其對黑麥草種子萌發(fā)和幼苗積累Cd的影響，旨在為利用該菌株強(qiáng)化黑麥草修復(fù)Cd污染提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株和植物

供試菌株系本實(shí)驗(yàn)室從礦區(qū)多種重金屬污染土壤中篩選到的黑曲霉(Aspergillusniger)TL-F2菌株，由廣州市微生物研究所鑒定[19]。采用PDA培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)5 d后于4 ℃保藏備用。

供試植物為四倍體特高一年生黑麥草(冬牧70)，購自北京開元種業(yè)有限公司。

1.1.2 主要培養(yǎng)基和溶液

PDA培養(yǎng)基、黑曲霉液體培養(yǎng)基、無機(jī)磷培養(yǎng)基、亞利桑那菌瓊脂(SA)培養(yǎng)基、鉻天青S(CAS)檢測液、Salkowski試劑、鉬銻抗試劑等的配制參照文獻(xiàn)[19-21]。所用試劑均為國產(chǎn)優(yōu)級純。培養(yǎng)基均在121 ℃條件下高壓蒸汽滅菌30 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 孢子液配制

將TL-F2菌株在PDA培養(yǎng)基平板上28 ℃培養(yǎng)5 d，然后用20 mL無菌0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaCl溶液洗脫黑曲霉孢子，用血球計數(shù)板計數(shù)，分別調(diào)節(jié)孢子濃度至1×108mL-1和1×106mL-1。將制備好的孢子液置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 Cd脅迫下TL-F2菌株的促生特性試驗(yàn)

將濃度為1×108mL-1的TL-F2孢子液接種在含不同濃度(0、5、20、50 mg·L-1)Cd的培養(yǎng)基，28 ℃、150 r·min-1振蕩培養(yǎng)7 d，檢測其分泌IAA、溶磷和產(chǎn)鐵載體的能力。

1.2.3 TL-F2菌株對Cd脅迫下黑麥草種子萌發(fā)的影響試驗(yàn)

設(shè)置不同Cd濃度(0、5、20、50 mg·L-1)和TL-F2孢子液濃度(0、1×106、1×108mL-1)，相互配合，共形成12個處理，每個處理設(shè)置3個平行樣。選取顆粒飽滿、大小均勻的黑麥草種子，用10%(體積分?jǐn)?shù))H2O2浸泡10 min后用無菌水徹底沖洗3～5次。然后，將黑麥草種子浸泡在不同濃度TL-F2孢子液中24 h。選取處理過的種子各50粒隨機(jī)放入裝有2層濾紙的培養(yǎng)皿(直徑為12 cm)中，每皿加20 mL含不同濃度Cd的無菌水，28 ℃生化培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)期間，自第3天起每日觀察、記錄種子的發(fā)芽情況，并基于稱重法用無菌水補(bǔ)充蒸發(fā)的水分。幼苗收獲后，分別測定根系、幼芽的長度和鮮重，及其Cd含量。

1.3 測定方法

1.3.1 促生特征測定

TL-F2菌株分泌IAA、溶磷和產(chǎn)鐵載體的能力均采用分光光度法(UV 752型紫外-可見分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司)測定。

TL-F2菌株分泌IAA的能力采用Salkowski比色法[22]測定。取0.5 mL孢子液接入含不同濃度Cd和0.05%L-色氨酸的黑曲霉液體培養(yǎng)基，于28 ℃、150 r·min-1恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)7 d。取發(fā)酵液至離心管，在4 ℃、6 000 ×g離心10 min。取2 mL上清液加入4 mL Salkowski試劑，搖勻后在25 ℃暗處放置30 min，測定D530值。

TL-F2菌株溶磷能力的測定采用鉬銻抗顯色法[23]。取0.5 mL孢子液接入含不同濃度Cd的無機(jī)磷液體培養(yǎng)基，于28 ℃、150 r·min-1恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)7 d，同時設(shè)不接菌的處理作參比調(diào)0。將其在4 ℃、10 000 ×g離心15 min，然后取1 mL上層液體于50 mL容量瓶中，加入2，4-二硝基苯酚指示劑1～2滴，用10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氫氧化鈉溶液或10%(體積分?jǐn)?shù))硫酸溶液調(diào)節(jié)至溶液剛呈微黃色，加入5 mL鉬銻抗試劑，搖勻，加水定容，室溫放置30 min，測定D720值。

TL-F2菌株產(chǎn)鐵載體能力的測定采用CAS檢驗(yàn)法[24]。吸取0.5 mL孢子液接入含不同濃度Cd的SA液體培養(yǎng)基，于28 ℃、150 r·min-1恒溫?fù)u床上振蕩培養(yǎng)7 d，4 ℃、10 000×g離心15 min，把上層清液和CAS檢測液以1∶1的體積比混勻，放置1 h后，測D630(A)，以SA液體培養(yǎng)基的D630為參比值(Ar)，計算TL-F2菌株產(chǎn)鐵載體的能力(S，%)，其計算公式為S=[(Ar-A)/Ar]×100。

1.3.2 黑麥草種子萌發(fā)指標(biāo)測定

分別以種子萌發(fā)3 d和7 d的發(fā)芽數(shù)占供試種子數(shù)的比例測算發(fā)芽勢(GV)和發(fā)芽率(GR)。在每個培養(yǎng)皿中選擇10株生長良好的黑麥草，用尺子人工測量其根長、芽長。去離子水沖洗干凈后，濾紙吸干，稱鮮重。然后，在105 ℃殺青10 min，65 ℃烘至恒重，稱干重，剪碎備用。計算黑麥草種子的發(fā)芽指數(shù)(GI)、活力指數(shù)(VI)[25]、耐性系數(shù)(TI)[25]和脅迫指數(shù)(SI)[26]。

1.3.3 黑麥草根部和芽部Cd含量測定

精確稱取1.3.2節(jié)中剪碎的植物樣0.050 0 g，放入石墨消解管，加1 mL HClO4和9 mL濃HNO3，放置過夜(10～12 h)。在石墨消解儀中150 ℃持續(xù)消解至溶液澄清，將溶液轉(zhuǎn)移、定容至50 mL，用0.22 μm濾頭過濾，取濾液，用ZEEnit700P型原子吸收分光光度計(德國耶拿)測定Cd含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2016、SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析與做圖，對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，對有顯著差異(P<0.05)的，采用Duncan法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎘脅迫對TL-F2菌株促生特性的影響

2.1.1 產(chǎn)IAA的能力

由圖1可知，過高濃度(20、50 mg·L-1)的Cd脅迫會顯著(P<0.05)抑制TL-F2分泌IAA，比對照組分別下降55.76%和65.69%；但低濃度的Cd對TL-F2菌株產(chǎn)IAA的能力無顯著影響。

2.1.2 溶磷能力

由圖2可知，過高濃度(20、50 mg·L-1)的Cd脅迫會顯著(P<0.05)抑制TL-F2的溶磷能力，比對照組分別下降50.07%和78.19%；但低濃度的Cd對TL-F2菌株的溶磷能力無顯著影響。

2.1.3 產(chǎn)鐵載體的能力

由圖3可知，Cd會顯著(P<0.05)抑制TL-F2菌株產(chǎn)鐵載體的能力，且抑制程度隨Cd濃度的增大而呈上升趨勢。當(dāng)Cd濃度為5、20、50 mg·L-1時，其S值較CK分別減少48.18%、69.71%和80.08%。

2.2 TL-F2菌株對鎘脅迫下黑麥草種子萌發(fā)的影響

不同Cd濃度下，TL-F2菌株對黑麥草種子萌發(fā)的影響如表1所示。整體來看，隨Cd濃度增大，黑麥草種子的GV、GR、GI、VI和TI均呈下降趨勢，但SI卻呈上升趨勢。當(dāng)Cd濃度分別為0、5、20 mg·L-1時，接種低濃度(1×106mL-1)或高濃度(1×108mL-1)TL-F2菌株的黑麥草的GV、GR、GI較不接菌的處理無顯著變化；但接種高濃度TL-F2菌株的黑麥草的VI較不接菌的處理顯著(P<0.05)增加，且當(dāng)Cd濃度為5、20 mg·L-1時，接種高濃度TL-F2菌株的黑麥草的TI亦較不接菌的處理顯著(P<0.05)增加。當(dāng)Cd濃度為5 mg·L-1時，接種高濃度TL-F2菌株的黑麥草的SI較不接菌的處理顯著(P<0.05)降低。當(dāng)Cd濃度為50 mg·L-1時，接種低濃度或高濃度TL-F2菌株的黑麥草的GR、GI、VI、TI和SI較不接菌的處理無顯著變化，但接種高濃度TL-F2菌株的黑麥草的GV較不接菌的處理顯著(P<0.05)增加。以上結(jié)果說明，在一定程度的Cd脅迫條件下，接種適當(dāng)濃度的TL-F2菌株有助于促進(jìn)黑麥草種子的萌發(fā)。

表1 不同濃度Cd脅迫下接種TL-F2菌株對黑麥草種子萌發(fā)的影響Table 1 Effects of different concentrations of Cd on ryegrass seed germination with inoculation of A.niger TL-F2

2.3 TL-F2菌株對鎘脅迫下黑麥草幼苗生長的影響

不同濃度Cd脅迫下，A.nigerTL-F2對黑麥草幼苗生長的影響如表2所示。在種子萌發(fā)時期，種子生根易受Cd的抑制，當(dāng)Cd濃度提高到50 mg·L-1時，所有處理的黑麥草在第3天后根系均不再繼續(xù)生長，并慢慢退化，7 d后完全退化。整體來看，隨著Cd濃度增加，黑麥草幼苗的根長、芽長均呈現(xiàn)下降趨勢；但各處理下，黑麥草的根干重和芽干重并無顯著變化。當(dāng)Cd濃度為0時，接種低濃度或高濃度TL-F2菌株的黑麥草的根長、芽長較不接菌的處理無顯著差異。當(dāng)Cd濃度為5、20 mg·L-1時，接種高濃度TL-F2菌株的黑麥草的根長較不接菌的處理顯著(P<0.05)增加，接種低濃度TL-F2菌株的黑麥草的根長較不接菌的處理無顯著變化。當(dāng)Cd濃度為5、20、50 mg·L-1時，接種高濃度TL-F2菌株的黑麥草的芽長較不接菌的處理無顯著變化，但接種低濃度TL-F2菌株的黑麥草的芽長卻較不接菌的處理顯著(P<0.05)減小。

表2 不同濃度Cd脅迫下接種TL-F2菌株對黑麥草生長的影響Table 2 Effects of different concentrations of Cd on ryegrass seedling growth with inoculation of A.niger TL-F2

2.4 TL-F2菌株對鎘脅迫下黑麥草Cd含量的影響

TL-F2菌株對Cd脅迫下黑麥草地上部和根部Cd含量的影響如圖4所示。高濃度(50 mg·L-1)Cd脅迫造成黑麥草根部在生長過程中退化。當(dāng)Cd濃度為5、20 mg·L-1時，接種高濃度或低濃度的TL-F2菌株后，黑麥草地上部、根部的Cd含量較不接菌的處理無顯著變化。當(dāng)Cd濃度為50 mg·L-1時，接種高濃度TL-F2菌株的黑麥草地上部的Cd含量較其他處理顯著(P<0.05)增加，但接種低濃度TL-F2菌株的黑麥草地上部的Cd含量較不接菌的處理無顯著變化。

3 討論

植物促生菌可通過不同的機(jī)制促進(jìn)植物生長，并增強(qiáng)植物的抗逆性。大量研究證明，促生菌可分泌植物激素，如IAA和核黃素等，促進(jìn)植物發(fā)芽、分蘗，促進(jìn)根長等生物量的增加。促生菌還可產(chǎn)生植物調(diào)節(jié)物質(zhì)，如ACC脫氨酶等，通過降低乙烯的含量，增強(qiáng)植物的抗逆性[27]。據(jù)報道，內(nèi)生真菌A.nigerCSR3菌株在28 ℃、150 r·min-1的條件下恒溫培養(yǎng)7 d，最高可產(chǎn)生(0.873±0.029)μg·mL-1的IAA[28]。Mesa等[29]報道，在Cu脅迫下BacillusaryabhattaiSMT50分泌IAA的含量下降了40%，這與本研究結(jié)果相似。本研究中，A.nigerTL-F2在Cd脅迫下分泌IAA的能力同樣呈下降趨勢，但仍有IAA產(chǎn)生，表明A.nigerTL-F2在Cd脅迫下仍具有促進(jìn)植物生長的能力。Glick等[30]研究表明，促生菌可通過分泌IAA降低乙烯對植物的脅迫，從而在種子萌發(fā)期促進(jìn)植物生根。在Cd污染土壤或水體中，植物因受到Cd富集的影響，對營養(yǎng)元素Fe和P的吸收會受到抑制，導(dǎo)致植物發(fā)育遲緩。研究表明，促生菌通過產(chǎn)生鐵載體和溶磷可彌補(bǔ)由Cd在植物體內(nèi)富集而引起的缺鐵，促進(jìn)植物對Fe和P的吸收[27]。鐵載體不僅具有運(yùn)輸鐵離子的作用，還可與多種重金屬離子進(jìn)行絡(luò)合，形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，降低環(huán)境中重金屬離子的濃度。1952年，Johnston[31]首次研究了真菌的溶磷作用，發(fā)現(xiàn)A.niger的溶磷作用最強(qiáng)。A.nigerCSR3菌株具有產(chǎn)生鐵載體的能力，與CAS的反應(yīng)速率為3.8～5.6 mm·d-1[28]。非內(nèi)生真菌A.nigerJ4在不同培養(yǎng)基中的溶磷量為6.50～17.23 g·kg-1，溶磷率為 26.11%～68.31%[32]。研究發(fā)現(xiàn)，木霉(Trichodermavirens)PDR-28菌株[33]、黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)[34]和棘孢木霉(Trichodermaasperellum)[35]因具有產(chǎn)IAA、溶磷和產(chǎn)鐵載體的能力，可改善重金屬脅迫對植物的毒害作用，促進(jìn)植物生長。本研究中，Cd脅迫下A.nigerTL-F2仍具有溶磷能力和產(chǎn)鐵載體的能力，推測其也可促進(jìn)根部生長和植物對Fe和P的吸收，緩解重金屬脅迫。

種子萌發(fā)和幼苗生長是植物生命周期的開始，也是植物生命中最早接觸外界環(huán)境、對外界做出應(yīng)激反應(yīng)的重要階段，其中，發(fā)芽勢和發(fā)芽率是衡量種子發(fā)芽能力的重要指標(biāo)[36]。Cd污染可改變植物的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生化過程。長時間接觸Cd后，植物根系呈黏膠狀，腐爛，羽狀數(shù)減少，根系伸長量減少，且側(cè)根的形成會受到抑制[37]。張媛媛等[38]研究發(fā)現(xiàn)，隨Cd濃度增加(≥20.0 mg·L-1)，黑麥草種子的GV、GR和GI都急劇下降，根鮮重和芽鮮重均有不同程度的降低。在本研究中，隨Cd濃度增加，黑麥草的GV、GR、GI、VI、根長、芽長均表現(xiàn)出降低的趨勢。這與Cd脅迫對火炬樹種子萌發(fā)[39]和豇豆種子萌發(fā)[40]的影響一致。王濤等[41]發(fā)現(xiàn)，在不同濃度的Cd脅迫下，接種1×108mL-1聚多曲霉菌菌株能夠提高芥菜的種子活力，促進(jìn)種子萌發(fā)。本研究中，添加不同濃度的菌液對黑麥草種子萌發(fā)的影響不同，相對來說，高濃度(1×108mL-1)的A.nigerTL-F2菌液更有助于促進(jìn)黑麥草的種子萌發(fā)和幼苗生長。這可能是由于高濃度菌液產(chǎn)生IAA、溶磷和產(chǎn)鐵載體的能力更強(qiáng)，更有助于緩解Cd對黑麥草種子的抑制和毒害作用。種子生根極易受到Cd的抑制，當(dāng)Cd濃度為50 mg·L-1時，黑麥草根系幾乎不能持續(xù)生長，7 d完全退化。這可能是因?yàn)楦邼舛菴d脅迫已對黑麥草種子和初生幼苗造成了不可逆的損傷。受此影響，接種A.nigerTL-F2菌株對高濃度Cd脅迫下的黑麥草生長無明顯促生效果。這與陸仲煙等[42]的研究結(jié)果一致：在較低濃度Cd脅迫下，接種伯克氏菌D54顯著促進(jìn)了水稻根系的生長，提高了種子的活力指數(shù)，但當(dāng)鎘濃度提高到100 mg·L-1后，水稻根系幾乎沒有生長。研究表明，高濃度Cd使得種子中淀粉酶和蛋白酶的活性受到抑制，植物細(xì)胞中DNA和RNA的活性降低，核酸含量下降，有絲分裂過程受阻，進(jìn)而影響種子發(fā)芽和幼苗生長[25，43]。

Cd脅迫下，接種不同濃度菌液對黑麥草Cd含量的影響不同，當(dāng)Cd濃度為50 mg·L-1時，接種高濃度A.nigerTL-F2顯著提高了黑麥草地上部的Cd含量。這與史鼎鼎等[44]的結(jié)果一致：在不同濃度的重金屬處理條件下，接種RhodococcusbaikonurensisJ6可促進(jìn)黑麥草地上部Cd的積累，最高可達(dá)27%。接種銅綠假單胞菌、產(chǎn)堿桿菌和枯草芽孢桿菌的芥菜根和莖組織中重金屬含量也相應(yīng)增加[45]，但具體機(jī)理還不是很明確。這可能與促生菌分泌IAA、溶磷和產(chǎn)鐵載體，增加植物抗逆性和生長能力相關(guān)。接種低濃度A.nigerTL-F2對黑麥草地上部和根部的Cd含量無明顯影響。其原因可能是，低濃度Cd脅迫下黑麥草幼苗生長幾乎不受影響，因而其Cd含量無變化。高濃度A.nigerTL-F2對黑麥草根部Cd含量無顯著影響，可能是因?yàn)锳.nigerTL-F2對Cd進(jìn)行了吸附轉(zhuǎn)化或沉淀，從而降低了Cd濃度，緩解了Cd對黑麥草的毒害；也可能是因?yàn)锳.nigerTL-F2產(chǎn)生鐵載體絡(luò)合了部分Cd，降低了黑麥草根部對Cd的吸收。