谷文露，袁海濤，張烜烽，劉德慧，王靈霞，蔡燁偉，嚴(yán)玉蘭

0 引 言

目前肺癌已成為全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，其中肺腺癌為最常見的類型，對人類的健康構(gòu)成了巨大的威脅[1-2]。盡管目前有多種診斷和治療肺癌的方法，但是肺癌的5年總生存率仍不足20%[3]。因此，急需尋找一種新的分子靶向治療方法來改善肺癌的治療效果。

環(huán)狀RNA(circRNA)的結(jié)構(gòu)呈閉合環(huán)狀，是一類具有穩(wěn)定性和保守性的新型非編碼RNA[4]。大量研究表明，許多疾病的發(fā)生發(fā)展都與circRNA相關(guān)，特別是腫瘤[5-9]。然而，circRNA在肺腺癌發(fā)展中的作用機制尚不明確。本研究通過高通量測序技術(shù)，篩選出在肺腺癌組織與癌旁組織中差異低表達(dá)最明顯的hsa_circ_0008234,探討其在肺腺癌組織、細(xì)胞中的表達(dá)水平，以及對肺腺癌細(xì)胞增殖與遷移的影響，擬為肺腺癌的診斷、治療提供新的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象選取2018年11月至2019年12月江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院胸外科就診的75例肺腺癌患者的肺腺癌組織及癌旁組織標(biāo)本。所有肺腺癌患者病理類型均由術(shù)中及術(shù)后組織病理確診，術(shù)前均未接受任何放、化療，且不伴有高血壓、糖尿病等其他任何基礎(chǔ)性疾病。術(shù)中收集肺腺癌及距離腫瘤邊緣≥3cm的癌旁組織標(biāo)本，離體后立刻置于含有RNA固定劑的無酶EP管中，然后迅速放于-80 ℃冰箱中保存以備用。其中5例組織標(biāo)本用于高通量測序，另外70例組織標(biāo)本用于進(jìn)一步明確circ_0008234在肺腺癌組織中的表達(dá)情況。另收集60例肺腺癌患者未接受治療前，及60例門診正常體檢者的外周血5 mL于抗凝管內(nèi)，1200 r/min離心20 min后吸取上層血漿置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩１狙芯揩@得江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號：K-20180043-Y)，患者均簽署知情同意書。

1.2細(xì)胞株和主要試劑人肺腺癌細(xì)胞株A549、PC9、H1975和H1299以及人永生化正常支氣管黏膜上皮細(xì)胞株BEAS-2B 購買于中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞中心，胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)液及胰蛋白酶購自美國Gibco公司，小干擾RNA(siRNA)由廣州銳博生物技術(shù)有限公司設(shè)計合成，過表達(dá)質(zhì)粒由上海吉凱基因科技有限公司設(shè)計合成，PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑、Trizol及Trizol LS 試劑購自美國Thermo Fisher Scientific公司，RNase R購自美國Epicenter Technologies公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實時熒光定量 PCR 試劑盒購于日本TaKaRa公司，CCK-8試劑購自南京厚載生物科技公司，Transwell小室購自美國康寧公司，兔抗BTG3抗體、兔抗β-Actin抗體及羊抗兔二抗均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.3方法

1.3.1 高通量測序采用Trizol法提取5對肺腺癌組織及癌旁組織的總RNA，并用RNase R處理總RNA以去除線性RNA。使用Agilent 2100系統(tǒng) (美國Agilent Technologies公司) 對構(gòu)建好的RNA文庫進(jìn)行質(zhì)檢，使用Illumina HiSeq 2000測序儀進(jìn)行測序，并用limma軟件 (R version 3.3.1) 對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。測序程序和分析由上海歐易生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司進(jìn)行。

1.3.2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染將細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。間隔1至2 d換液，當(dāng)細(xì)胞貼壁生長到80%～90%時進(jìn)行細(xì)胞傳代。將PC9及A549細(xì)胞分別接種于2個6孔板中，PC9板設(shè)置過表達(dá)組(轉(zhuǎn)染過表達(dá)circ_0008234的質(zhì)粒)及對照組(轉(zhuǎn)染陰性對照的質(zhì)粒),A549板設(shè)置小干擾組(轉(zhuǎn)染敲減circ_0008234的小干擾RNA)及陰性對照組(轉(zhuǎn)染陰性對照的小干擾RNA)。當(dāng)細(xì)胞覆蓋率達(dá)60%～70%時，用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑按照說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.3.3實時熒光定量PCR(qRT-PCR)采用Trizol法提取組織及細(xì)胞中的總RNA,用Trizol LS法提取血漿中的總RNA。然后利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將所提取的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄為cNDA。用實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司的CFX96)來擴增cNDA以檢測hsa_circ_0008234在組織、血漿及細(xì)胞中的相對表達(dá)量。該擴增以GAPDH作為內(nèi)參，擴增體系為：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性5 s，56℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，一共40個循環(huán)。用2-△△CT法計算hsa_circ_0008234的相對表達(dá)量。每個實驗獨立重復(fù)進(jìn)行3次，每個樣品均設(shè)置3個復(fù)孔。GAPDH上游引物5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′，下游引物序列為5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′;hsa_circ_0008234的上游引物序列是5′- TCATCATAGCCACTGACACG-3′,下游引物序列為5′-AGAAACCACAGGCAACA ATC-3′。

1.3.4CCK-8實驗將轉(zhuǎn)染24 h后的肺腺癌PC9和A549細(xì)胞按2000個/孔的密度接種于96孔板中培養(yǎng)，每組設(shè)置3個復(fù)孔。對培養(yǎng)24、48、72、96 h的時間點的細(xì)胞進(jìn)行換液，并每孔加入10 μL的CCK-8試劑，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～4 h后，用酶標(biāo)儀測量450 nm處的吸光度值。

1.3.5平板克隆形成實驗將轉(zhuǎn)染后的肺腺癌PC9和A549細(xì)胞接種于6孔板中(500個/孔)，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。每隔3天換液一次，10～14 d肉眼可見克隆團時終止培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)液，PBS輕輕沖洗3遍，每孔加入1 mL 4%的多聚甲醛并置于4 ℃冰箱固定30 min，再用PBS清洗3遍，每孔加入1 mL 0.1%的結(jié)晶紫染液4 ℃冰箱染色0.5 h，最后用雙蒸水清洗至背景干凈，計數(shù)克隆形成數(shù)，每組實驗均重復(fù)進(jìn)行3次?？寺⌒纬陕视嬎愎饺缦拢?/p>

克隆形成率(%)=(克隆數(shù)/接種細(xì)胞總數(shù))×100%

1.3.6細(xì)胞劃痕實驗將肺腺癌PC9和A549細(xì)胞分別接種于6孔板中，PC9板3個孔設(shè)置為過表達(dá)組，另外3個孔設(shè)置為對照組；A549板3個孔設(shè)置為小干擾組，剩下3個孔設(shè)置為陰性對照組。當(dāng)細(xì)胞在6孔板中單層生長至70%～80%時，用10 μL的無菌移液槍頭垂直于6孔板底部劃線，用PBS沖洗3遍，并更換為無血清的培養(yǎng)基，同時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，拍照并記錄為0 h,然后置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，并在48h時再次拍照記錄寬度。

1.3.7Transwell 遷移實驗將干預(yù)后的肺腺癌PC9和A549細(xì)胞消化后，用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以每室100 μL分別接種于Transwell小室上層中，在下層小室每孔加600 μL含有10%FBS的培養(yǎng)基，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中。孵育24 h后取出，棄去小室中的培養(yǎng)液，用棉簽輕輕擦拭小室上層內(nèi)側(cè)未遷移的細(xì)胞，用PBS清洗3次，再用4%的多聚甲醛固定30 min,PBS再次清洗3次，0.1%的結(jié)晶紫染液染色30 min,PBS漂洗干凈后倒扣晾干，顯微鏡下拍照，實驗重復(fù)3次。

1.3.8蛋白質(zhì)印跡法將干預(yù)48 h后的肺腺癌PC9和A549細(xì)胞用RIPA裂解液冰上裂解提取蛋白。再進(jìn)行10%的SDS-PAGE凝膠電泳，恒流350 mA、120 min進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，然后用5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h,4 ℃冰箱一抗(兔抗β-Actin 1∶500，兔抗BTG3 1∶500)孵育過夜，TBST清洗3次，每次10 min，予以羊抗兔二抗(1∶5000)室溫孵育2 h，再次TBST清洗3次，每次10 min，最后予以化學(xué)發(fā)光顯影。使用Image J軟件對條帶進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié) 果

2.1 Hsa_circ_0008234的篩選高通量測序結(jié)果顯示，共有162個差異表達(dá)的環(huán)狀RNA (均數(shù)變化>2.0，P<0.05) ,其中最具有差異性的是環(huán)狀RNA circ_0008234。

2.2Hsa_circ_0008234 在肺腺癌患者組織和血漿中的表達(dá)Hsa_circ_0008234在肺腺癌組織中的表達(dá)量明顯低于癌旁組織[(0.31±0.40)vs(1.20±0.68),P<0.01]；肺腺癌患者血漿的Hsa_circ_0008234表達(dá)水平明顯低于正常健康體檢者[(0.56±0.44)vs(1.18±0.67)，P<0.01]。

2.3Hsa_circ_0008234在肺腺癌細(xì)胞中的表達(dá)Hsa_circ_0008234在4株肺腺癌細(xì)胞PC9、A549、H1299、H1975的表達(dá)水平均明顯低于正常支氣管粘膜上皮細(xì)胞BEAS-2B(P<0.01)。PC9中的circ_0008234表達(dá)水平最低，故選擇PC9進(jìn)行circ_0008234的過表達(dá)；在A549中的表達(dá)水平相對較高，故選擇A549進(jìn)行circ_0008234的敲減,以進(jìn)一步探討circ_0008234對肺腺癌細(xì)胞的作用。見圖1。

與BEAS-2B比較，*P<0.01圖1 正常支氣管上皮細(xì)胞及肺腺癌細(xì)胞株中hsa_circ_0008234的表達(dá)水平Figure 1 The expression levels of hsa_circ_0008234 in normal bronchial epithelial cells and lungadenocarcinoma cell lines

2.4Hsa_circ_0008234在肺腺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平肺腺癌細(xì)胞PC9轉(zhuǎn)染circ_0008234過表達(dá)質(zhì)粒48 h后，PC9細(xì)胞的過表達(dá)組circ_0008234的表達(dá)水平(119.67±2.03)明顯高于對照組(1±0.03)。肺腺癌細(xì)胞A549轉(zhuǎn)染小干擾RNA 48h后，A549細(xì)胞的小干擾組circ_0008234的表達(dá)水平(0.38±0.18)明顯低于陰性對照組(1±0.02)。由此表明，細(xì)胞中的circ_0008234表達(dá)水平可被成功干預(yù)。

2.5Hsa_circ_0008234的表達(dá)水平對肺腺癌細(xì)胞的增殖有影響CCK-8結(jié)果顯示，當(dāng)人肺腺癌細(xì)胞PC9轉(zhuǎn)染circ_0008234過表達(dá)質(zhì)粒后，過表達(dá)組生長速度明顯較對照組慢；小干擾組生長速度明顯較陰性對照組快。見圖2。由此可見，上調(diào)circ_0008234可以抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖；下調(diào)circ_0008234可以促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的增殖。

與過表達(dá)組比較，*P<0.01；與陰性對照組比較，#P<0.05圖2 過表達(dá)hsa_circ_0008234抑制肺腺癌細(xì)胞的活力及敲減hsa_circ_0008234提高肺腺癌細(xì)胞的活力Figure 2 Over expression of hsa_circ_0008234 inhibits the vitality of lung adenocarcinoma cells,knockdown of hsa_circ_0008234 improves the vitality of lung adenocarcinoma cells

2.6Hsa_circ_0008234的表達(dá)水平對肺腺癌細(xì)胞的遷移有影響細(xì)胞劃痕實驗表明：肺腺癌細(xì)胞PC9中過表達(dá)組的遷移率[(20.90±3.42)%]明顯低于對照組[(41.98±2.21)%]；A549中小干擾組的遷移率[(41.92±3.27)%]明顯高于陰性對照組[(31.98±4.06)%]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。Transwell 實驗表明：肺腺癌細(xì)胞PC9中過表達(dá)組的遷移細(xì)胞數(shù)(31.33±2.61)明顯低于對照組(90.67±2.06)；A549中小干擾組的遷移細(xì)胞數(shù)(121.50±2.97)明顯高于陰性對照組(78.00±3.08)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖4。

圖3 過表達(dá)及敲減hsa_circ_0008234對肺腺癌細(xì)胞遷移的影響Figure 3 Over expression of hsa_circ_0008234 inhibits lung adenocarcinoma cell migration,knockdown of hsa_circ_0008234 promotes lung adenocarcinoma cell migration

a:對照組;b:過表達(dá)組;c:陰性對照組;d:小干擾組圖4 過表達(dá)或敲減hsa_circ_0008234后肺腺癌細(xì)胞的遷移能力Figure 4 Lung adenocarcinoma cell migration ability after overexpression or knockdown of hsa_circ_0008234

2.7Hsa_circ_0008234的表達(dá)水平對BTG3蛋白的影響通過starbase (http://starbase.sysu.edu.cn/) 預(yù)測了BTG3可能是circ_0008234的潛在作用靶點。蛋白質(zhì)印跡實驗顯示，肺腺癌細(xì)胞PC9中過表達(dá)組的BTG3蛋白表達(dá)明顯高于對照組(P<0.05)；A549中小干擾組的BTG3蛋白表達(dá)明顯低于陰性對照組(P<0.05)。見圖5。

圖5 Hsa_circ_0008234的表達(dá)水平影響B(tài)TG3蛋白的表達(dá)Figure 5 The expression level of Hsa_circ_0008234 affects the expression of BTG3 protein

3 討 論

肺腺癌是肺癌中最常見的類型，早期癥狀不明顯，不易診斷，且缺乏有效的治療手段，死亡率較高。因此急需進(jìn)一步探討肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展機制，為肺腺癌的診斷及治療提供敏感特異有效的指標(biāo)。

circRNA沒有3′端加尾和5′端加帽結(jié)構(gòu)，可抵抗外切核酸酶的降解作用，具有高度的保守性和穩(wěn)定性[10]。因此，circRNA可被用來作為多種疾病的分子診斷標(biāo)志物和治療靶點。大量的研究顯示，circRNA的失調(diào)與各種腫瘤有關(guān)。Wang等[11]研究表明，circ-UBE2D2在乳腺癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，沉默circ-UBE2D2顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，起著重要的致癌作用。Gao等[12]研究顯示，circ-PKD2在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，過表達(dá)circ-PKD2抑制了口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯，發(fā)揮顯著的抑癌作用，然而敲減circ-PKD2基因后，則出現(xiàn)相反的結(jié)果。本實驗通過高通量測序帥選出在肺癌組織中表達(dá)具有明顯差異的環(huán)狀RNA hsa_circ_0008234。本研究中，circ_0008234在肺腺癌患者組織和血漿中低表達(dá)，提示其可能在肺腺癌中發(fā)揮抑癌基因作用。隨后，檢測了hsa_circ_0008234在四株肺腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況，選擇表達(dá)量最低的PC9細(xì)胞進(jìn)行過表達(dá)，表達(dá)量相對較高的A549細(xì)胞進(jìn)行敲減。實驗發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)circ_0008234后可明顯抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖和遷移；敲減circ_0008234后則顯著促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的增殖和遷移。由此推測，circ_0008234可抑制抑制肺腺癌的發(fā)生和發(fā)展。

B細(xì)胞異位基因3(BTG3)是抗增殖BTG基因家族的成員，是抑癌基因P53下游的一個靶點，在人類癌癥中下調(diào)[13]。大量研究報道，BTG3可抑制腫瘤的進(jìn)展[14-17]。Peng等[18]研究發(fā)現(xiàn)BTG3對非小腺癌細(xì)胞的增殖與遷移有抑制作用。我們通過starbase (http://starbase.sysu.edu.cn/) 預(yù)測了BTG3可能是circ_0008234的潛在作用靶點，且通過蛋白質(zhì)印跡法，檢測了BTG3的蛋白表達(dá)水平，過表達(dá)circ_0008234后BTG3蛋白表達(dá)明顯增多；而敲減circ_0008234后BTG3蛋白表達(dá)減少。由此推測circ_0008234可能通過調(diào)節(jié)BTG3在肺腺癌細(xì)胞中發(fā)揮抑癌作用。

綜上所述，circ_0008234在肺腺癌組織、血漿和細(xì)胞中低表達(dá)，可能通過調(diào)控BTG3基因而抑制肺腺癌的增殖和遷移，從而發(fā)揮抑癌作用，為肺腺癌的預(yù)后和治療提供新的理論基礎(chǔ)。然而circ_0008234調(diào)控BTG3的具體機制仍不清楚，需要進(jìn)一步的探究。