鄭倩雯，陳 霞，王 敏，陳萬銀，欒曉瑾，顏一丹，方 杰，胡 興，于 駿

0 引 言

生殖干細(xì)胞(drosophilatestis，GSCs)因其具有自我更新與分化的能力在性腺發(fā)育、配子形成及胚胎發(fā)育等生命活動中具有重要作用[1-2]。因此，GSCs生命調(diào)控的機(jī)制研究將為人類不孕不育、生殖器腫瘤等疾病提供更多的診治依據(jù)。果蠅睪丸是GSCs生命調(diào)控研究的經(jīng)典模型[3-4]。研究表明，生殖干細(xì)胞微環(huán)境位于果蠅睪丸頂端，由一組致密的中心細(xì)胞和圍繞在其周圍的GSCs、體細(xì)胞干細(xì)胞(Somatic Stem cells,SSCs)構(gòu)成，其中每個GSC又被2個SSCs所包裹。生殖干細(xì)胞微環(huán)境在GSCs的自我更新和分化過程中發(fā)揮了重要作用[5]。在生殖干細(xì)胞微環(huán)境的嚴(yán)格調(diào)控下，GSCs經(jīng)過不對稱分裂，生成2個子代細(xì)胞，其中一個子代細(xì)胞繼續(xù)與中心細(xì)胞保持接觸而維持干細(xì)胞的自我更新能力，另一個子代細(xì)胞因脫離了生殖干細(xì)胞微環(huán)境的信號調(diào)控而進(jìn)入分化程序，形成性原細(xì)胞(Gonialblast，GB)并經(jīng)過4次有絲分裂后進(jìn)入減數(shù)分裂過程，最終通過長形精子個體化過程形成了成熟精子[6-8]。隨著生殖細(xì)胞逐步分化，生殖融合體也逐漸由最初的點(diǎn)狀轉(zhuǎn)變?yōu)榉植鏍頪9]。

大量研究證實(shí)，GSCs的自我更新與分化過程受到多種信號因子調(diào)控，杰納斯激酶-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子(Janus Kinase-Signal Transducer and Activator of Transcription ,JAK-STAT)信號通路作為GSCs維持的內(nèi)源性信號，在調(diào)控GSCs自我更新的過程中具有重大意義[10-16]。過度活化JAK-STAT 信號通路會導(dǎo)致GSCs過度增殖，而JAK-STAT 信號受阻則會引起GSCs的丟失[10]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)信號通路則被發(fā)現(xiàn)能夠抑制GSCs中分化因子Bam的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮抑制GSCs分化的作用[11-13]。此外，Hedgehog(Hh)信號通路能夠通過SSCs間接調(diào)控GSCs的生命活動[14-16]。即便如此，GSCs命運(yùn)調(diào)控的過程中所涉及的大量調(diào)控因子及其機(jī)制仍有待進(jìn)一步明確。

為了探究影響GSCs生命的潛在調(diào)控因子，本研究前期在果蠅睪丸中開展了大規(guī)模的RNA干擾(RNA interference,RNAi)篩選，并且鑒定CG6015基因?yàn)檎{(diào)控果蠅睪丸GSCs的自我更新與分化過程的重要因子[17]。果蠅CG6015基因作為一個蛋白質(zhì)編碼基因，目前尚缺乏針對性研究，僅被預(yù)測具有RNA結(jié)合活性，并能夠通過剪接體參與mRNA剪接過程。而CG6015基因在人類中的同源基因?yàn)閏ell division cycle 40(CDC40)，該基因作為一個能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的剪接因子，所編碼的蛋白質(zhì)對于mRNA前剪接過程中的催化步驟II是必不可少的[18]。CG6015基因在酵母中的同源基因Prp17同樣被認(rèn)為是重要的RNA剪接因子，能夠協(xié)同U2,U5及U6小核糖蛋白參與前信使RNA的剪接過程[19]。RNA剪接體的亞基在果蠅睪丸中已被證實(shí)參與了GSCs生命維持和生精過程[20-21]。因此，CG6015基因在果蠅睪丸GSCs生命調(diào)控中的功能以及其中涉及的調(diào)控機(jī)制亟需進(jìn)一步探討。本研究旨在探究CG6015基因?qū)壊G丸GSCs生命維持的影響，探討CG6015基因在調(diào)控GSCs生命中的潛在機(jī)制，為男性不育癥的致病機(jī)制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 果蠅品系UAS-CG6015 RNAi 轉(zhuǎn)基因果蠅購于清華果蠅中心(Tsinghua Fly Center,THFC)，該品系來源于TRiPRNAi轉(zhuǎn)基因果蠅庫(Transgenic RNAi Project)。Nos-Gal4轉(zhuǎn)基因果蠅品系信息為：#4937，BDSC。W1118品系果蠅(野生型果蠅)來源于THFC果蠅庫。本研究中所有果蠅均在溫度25°C、相對濕度60%的條件下培育。

1.1.2試劑與儀器免疫熒光大鼠Vasa一抗(1∶20，DSHB公司，美國)，免疫熒光小鼠1B1一抗(1∶50，DSHB公司，美國)，免疫熒光大鼠鋅指結(jié)構(gòu)域蛋白(Zfh1)一抗(1∶1000，浙江大學(xué)佟超實(shí)驗(yàn)組贈予)，免疫熒光小鼠眼缺陷蛋白(Eya)一抗(1∶20，DSHB公司，美國)，免疫熒光小鼠Arm蛋白一抗(1∶20，DSHB公司，美國)，免疫熒光大鼠DE-cad蛋白一抗(1∶15，DSHB公司，美國)。免疫熒光cy3-小鼠二抗，488-小鼠二抗，647-大鼠二抗(1∶400，Molecular Probes and Jackson Immunologicals公司，美國)，核染料Hoechst33342(1∶100，Invitrogen公司，美國)，BSA(生工公司，中國)，PBS(生工公司，中國)，抗熒光淬滅封片液(碧云天公司，上海)，果蠅S2胚胎細(xì)胞系，果蠅培養(yǎng)基(DMEM)及Opti-MemR培養(yǎng)液(Gibco公司，美國)，胎牛血清(Bioind公司，以色列)，LipofectamineR 2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen公司，美國)，CG6015siRNA質(zhì)粒及NC siRNA質(zhì)粒(吉瑪基因公司，中國)，總RNA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBRGreen染料(Takara公司，日本)，qRT-PCR引物(生工生物公司，中國)，Real-timePCR儀：QuantStudio?5(Thermo公司，美國)，激光共聚焦顯微鏡：LSM800(蔡司公司，德國)。

1.2方法

1.2.1 果蠅雜交策略挑選Nos-Gal4雄性果蠅與UAS-CG6015RNAi處女蠅進(jìn)行雜交。在F1代中挑選出基因型為Nos>CG6015RNAi的雄蠅，作為實(shí)驗(yàn)組，W1118雄蠅為對照組。即在早期生殖細(xì)胞中敲減CG6015基因的果蠅，然后進(jìn)行下一步功能性分析[24-25]。

1.2.2果蠅解剖及形態(tài)分析挑選F1代出生2～3 d，基因型為Nos>CG6015 RNAi的雄蠅，將果蠅浸于1XPBS溶液中，在顯微鏡下解剖、分離性腺組織，觀察睪丸形態(tài)[25]。

1.2.3免疫熒光染色將解剖分離出的果蠅睪丸用含4%多聚甲醛的PBS固定30 min。固定完成后，用含0.3%TritonX-100的PBS(0.3%PBST)通透3次，每次10 min。通透完成后，用含5%牛血清白蛋白(BSA)的0.3%PBST封閉30 min，以降低抗體與抗原的非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，用封閉液配制出合適濃度的一抗工作液并于4°C孵育睪丸組織過夜。第2天，用0.3%PBST將一抗孵育后的睪丸組織清洗3次，每次10 min，以去除多余的一抗。接著使用封閉液將二抗稀釋至合適的工作濃度后，在室溫下避光孵育1 h。二抗孵育完成后，用0.3%PBST清洗3次，每次5 min，最后加入終濃度為1.0 mg/mL的Hoechst33342染料染核5 min，完成染色。最后將睪丸組織放置在載玻片上，加入10 μL防粹滅甘油并用蓋玻片封片。制備好的睪丸樣本將在激光共聚焦顯微鏡下采集熒光圖片，最后利用Adobe Photoshop CC 2018軟件處理圖片。

1.2.4細(xì)胞培養(yǎng)果蠅S2細(xì)胞在含10%胎牛血清的果蠅培養(yǎng)基(DMEM)，溫度為28 ℃且不含CO2的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞具體生長速度及生長狀態(tài)，適時進(jìn)行細(xì)胞換液，按照1∶2～1∶3比例進(jìn)行細(xì)胞傳代并及時進(jìn)行細(xì)胞保種。

1.2.5CG6015基因沉默處理將細(xì)胞按1.5×105細(xì)胞/mL接種于6孔板，取2個孔分別作為NC組(添加陰性對照的S2細(xì)胞)與CG6015 siRNA組(添加CG6015 siRNA的S2細(xì)胞)，待細(xì)胞生長密度達(dá)70%～90%后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染步驟按LipofectamineR 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行。使用Opti-MEM培養(yǎng)液分別稀釋siRNA片段和轉(zhuǎn)染試劑，充分混勻以使siRNA的終濃度至150 nmol/L，最后將轉(zhuǎn)染混合液加入細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染6 h后更換培養(yǎng)液并繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞提取總RNA、逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，行qRT-PCR檢測干涉效率。siRNA信息如下：NC組，上游：5′- UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，下游：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′；CG6015 siRNA組上游：5′-GGGCCGCUCUUAUUUGCAUTT-3′,下游：5′-AUGCAAAUAAGAGCGGCCCTT-3′。

1.2.6qRT-PCR檢測CG6015及RNA剪接體亞基的mRNA表達(dá)水平收集轉(zhuǎn)染48h后的果蠅S2細(xì)胞，利用RNAiso Plus提取總RNA，并使用紫外分光光度計(jì)檢測RNA濃度。提取出的總RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。將SYBR Green熒光染料、cDNA、引物及DEPC水充分混勻后配制成qRT-PCR反應(yīng)體系。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性20 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，共40個循環(huán)。Ct值以2-ΔΔCt表示，通過標(biāo)準(zhǔn)化處理內(nèi)參(GAPDH)的mRNA表達(dá)量來獲取每個基因的mRNA相對表達(dá)量。每個樣本設(shè)置3個副孔，并重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。引物序列如下：GAPDH，上游：5′-GTGGTGAACGGCCAGAAGAT-3′，下游：5′-GCCTTGTCAATGGTGGTGAA-3′；CG6015,上游：5′-GCCTGCCAGTCGTTAGACAA-3′，下游：5′-GCGTAGCCAGAGACCATGTG-3′；Prp8,上游：5′-GCAGGAGAGGCAGCACAACTAC-3′，下游：5′-AGCGACGTGATTCCAGCCAATG-3′；SmG,上游：5′-AGCGACGTGATTCCAGCCAATG-3′,下游：5′-CGTAGCATGGCATCGAGTCCTTG-3′；U2A,上游：5′-TCCATCATTCTCACCGGCAACAAC-3′,下游：5′-CTGCTTGATCTTCCTGAAGTCGAGTAG-3′。

2 結(jié) 果

2.1CG6015基因能夠維持果蠅睪丸正常形態(tài)對照組睪丸形態(tài)卷曲飽滿，而實(shí)驗(yàn)組睪丸體積明顯縮小，形態(tài)異常，呈現(xiàn)小睪丸表型。與對照組睪丸中出現(xiàn)小睪丸表型的比例(0)比較，實(shí)驗(yàn)組中(100%)明顯升高(P<0.001),見圖1。

2.2CG6015基因在果蠅睪丸早期生殖細(xì)胞中參與維持GSCs的生命免疫熒光結(jié)果顯示：在對照組睪丸中，Vasa陽性信號均勻分布于生殖細(xì)胞胞質(zhì)中，1B1信號由點(diǎn)狀逐漸轉(zhuǎn)化為分叉狀。而在早期生殖細(xì)胞中敲減CG6015基因后，實(shí)驗(yàn)組Vasa陽性細(xì)胞和1B1信號均完全缺失。與對照組睪丸中的生殖融合體數(shù)量比較，實(shí)驗(yàn)組明顯減少[(19.67±0.88)個vs(0.00±0.00)個，P<0.001]。見圖2。

圖2 在早期生殖細(xì)胞中敲減CG6015基因后GSC細(xì)胞維持障礙Figure 2 Knockdown of CG6015 in early germ cells results in defects of germline maintenance (Scale bar:20 μm)

2.3CG6015基因在早期生殖細(xì)胞中介導(dǎo)包囊細(xì)胞正常分化免疫熒光結(jié)果顯示：對照組睪丸中，Zfh1陽性細(xì)胞在睪丸頂端圍繞中心細(xì)胞分布，而Eya陽性細(xì)胞散在地分布于睪丸體部。實(shí)驗(yàn)組睪丸中，Zfh1陽性細(xì)胞呈現(xiàn)散在分布的狀態(tài)，而Eya陽性細(xì)胞出現(xiàn)明顯的積累，呈現(xiàn)過度分化狀態(tài)。見圖3。與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組睪丸中Zfh1陽性細(xì)胞數(shù)量無明顯改變[(9.67±0.33)個vs(9.67±0.88)個，P>0.05]，Eya陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增加[(9.67 ± 0.67)個vs(25.67±5.21)個，P<0.05]。

圖3 在早期生殖細(xì)胞中敲減CG6015基因后導(dǎo)致包囊細(xì)胞積累Figure 3 Knockdown of CG6015 in early germ cellsleads to accumulation of somatic cyst cells (Scale bar:20 μm)

2.4CG6015基因在早期生殖細(xì)胞中的細(xì)胞黏附效應(yīng)免疫熒光結(jié)果顯示，對照組和實(shí)驗(yàn)組睪丸中，Arm信號與DE-cad信號均呈現(xiàn)共定位現(xiàn)象。但是，實(shí)驗(yàn)組睪丸中Arm信號和DE-cad信號較對照組出現(xiàn)明顯堆積。見圖4。實(shí)驗(yàn)組睪丸中Arm蛋白與DE-cad蛋白表達(dá)水平[(9.87±0.94)、(10.88±0.94)]與對照組[(10.45±0.17)、(10.06±0.91)]比較未發(fā)生明顯改變(P>0.05)。

圖4 在早期生殖細(xì)胞中敲減CG6015基因后細(xì)胞鈣黏蛋白表達(dá)情況Figure 4 Expression of Arm or DE-cad protein when knockdown of CG6015 in early germ cells (Scale bar:20 μm)

2.5CG6015基因在果蠅S2細(xì)胞中調(diào)節(jié)RNA剪接體亞基的mRNA轉(zhuǎn)錄水平與NC組Prp8、SmG、U2A基因的mRNA相對表達(dá)水平(1.00±0.00)比較，CG6015 siRNA組Prp8基因(0.39±0.03)明顯下調(diào)，SmG基因(1.60±0.07)明顯上調(diào)(P<0.05)，而U2A基因改變差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

GSCs的生命維持是調(diào)控干細(xì)胞在自我更新和分化過程間穩(wěn)態(tài)平衡的必要條件，而維持GSCs生命的調(diào)控因子仍然有待發(fā)掘。本研究報(bào)道了CG6015基因在果蠅睪丸中調(diào)控GSCs生命的作用及可能的調(diào)控機(jī)制。為系統(tǒng)探究CG6015基因在果蠅睪丸GSCs命運(yùn)調(diào)控中的功能，本研究利用GAL4/UAS二元表達(dá)系統(tǒng)(Nos-Gal4)來驅(qū)動CG6015 RNAi的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CG6015基因具有調(diào)控GSCs命運(yùn)的功能，而這一功能可能是通過介導(dǎo)剪接體影響前mRNA剪接而實(shí)現(xiàn)的。

本研究利用Nos-Gal4在果蠅睪丸中敲減CG6015基因以實(shí)現(xiàn)下調(diào)該基因在生殖細(xì)胞中的表達(dá)水平，并且發(fā)現(xiàn)生殖細(xì)胞明顯消失，睪丸結(jié)構(gòu)完全坍塌，生殖細(xì)胞生命維持受到嚴(yán)重威脅，因而無法對這些睪丸進(jìn)行干涉效率驗(yàn)證。而本研究所用的UAS-CG6015 RNAi 轉(zhuǎn)基因果蠅品系來源于TRiPRNAi轉(zhuǎn)基因果蠅庫，目前很多重要的果蠅研究中大規(guī)模的RNAi篩選實(shí)驗(yàn)都是通過該果蠅庫開展的[17,26]，也有研究者利用該果蠅庫進(jìn)行果蠅睪丸生殖細(xì)胞生命維持的研究，發(fā)現(xiàn)了小核糖蛋白SmD3對GSCs生命維持的重要性[27]。因此，通過該果蠅庫開展的RNAi實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是十分可信的。

根據(jù)flybase數(shù)據(jù)庫(http://flybase.org)搜尋結(jié)果顯示，CG6015基因在果蠅睪丸中優(yōu)勢表達(dá)，并且經(jīng)過大規(guī)模篩選研究后被鑒定為GSCs自我更新與分化的調(diào)控因子之一[17]。而作為CG6015基因的同源基因，CDC40/Prp17經(jīng)研究證實(shí)為重要的RNA剪接因子，在生命維持調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[18-21]。目前，關(guān)于CG6015基因的研究報(bào)道仍然較少，其在果蠅體內(nèi)的生物學(xué)作用和調(diào)控機(jī)制尚不明確。本研究利用模式動物果蠅及果蠅S2細(xì)胞開展實(shí)驗(yàn)，探究目的基因CG6015在果蠅睪丸GSCs命運(yùn)調(diào)控中的具體功能和調(diào)控機(jī)制，具有創(chuàng)新性研究意義。

本研究結(jié)果提示，CG6015基因在果蠅睪丸GSCs的細(xì)胞維持中具有決定性作用，但是其中涉及的調(diào)節(jié)機(jī)制有待進(jìn)一步探討。研究顯示，細(xì)胞黏附在果蠅卵巢GSCs生命維持中具有重要作用，鈣黏蛋白(E-cadherin)介導(dǎo)的黏附效應(yīng)有助于GSCs在干細(xì)胞微環(huán)境中的細(xì)胞維持[28]。通過在果蠅睪丸內(nèi)的研究，我們發(fā)現(xiàn)CG6015基因并未依賴細(xì)胞黏附調(diào)控GSCs命運(yùn)。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)CG6015基因在果蠅S2細(xì)胞中影響RNA剪接體亞基Prp8和SmG的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，這提示我們CG6015基因很有可能通過介導(dǎo)剪接體而調(diào)控S2細(xì)胞生命活動。剪接體結(jié)構(gòu)復(fù)雜，包含了U1、U2、U4、U5和U6五種snRNP和150余種蛋白質(zhì)[29]。真核生物基因中mRNA的形成有賴于剪接體的加工處理。Prp8作為剪接體核心成分，是RAS、Notch等驅(qū)動的腫瘤的重要調(diào)節(jié)因子，其功能的喪失不僅會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增多，而且影響細(xì)胞分化與極性[30]。Smith蛋白G(SmG)也稱為小核核糖核蛋白多肽G，是剪接體U1、U2、U4和U5 snRNP生物發(fā)生中不可或缺的組分，是主要剪接體的前體[31]。因此CG6015基因?qū)rp8和SmG的mRNA表達(dá)水平的影響揭示了其在剪接體功能調(diào)控中的重要作用。但值得思考的是，CG6015對SmG的負(fù)調(diào)控作用是否提示兩者之間可能存在競爭關(guān)系，這需要我們開展深入的研究。

綜上，本研究揭示了CG6015基因在果蠅睪丸GSCs生命維持中的關(guān)鍵作用以及可能的調(diào)控機(jī)制，闡明了GSCs的穩(wěn)定對于果蠅睪丸正常精子發(fā)生的重要性，為男性不育的診斷與治療提供更多可能性。