楊 宇，敖 翔，李偉強，郭 韡，譚 燕，敖羅權(quán)，何 敏，王證程，徐 祥，郭建新

0 引 言

卵巢癌是發(fā)病率和死亡率最高的婦科腫瘤之一，目前以手術(shù)為主、輔以鉑類和紫杉醇聯(lián)合化療的標(biāo)準(zhǔn)治療方案并不能明顯改善患者預(yù)后，卵巢癌患者的5年生存率仍不足30%[1-3]。因此，急需尋找新的卵巢癌治療策略。

嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor,CAR)結(jié)構(gòu)通常包含識別腫瘤相關(guān)抗原的單鏈抗體(single chain fragment variable,scFv)和共刺激分子(costimulatory molecule,CM),通常為CD28、CD134或CD137，以及細胞內(nèi)信號域免疫受體酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs,ITAM)，通常為CD3或FcRI[4]。基于這種特殊的結(jié)構(gòu)，表達CAR的免疫效應(yīng)細胞能不依賴于MHC限制性和抗原提呈而特異性識別并殺傷靶細胞[5-6]。目前已有多項臨床試驗證實，CAR修飾的免疫細胞對白血病、淋巴瘤等多種惡性腫瘤治療有效[5,7-8]。CAR技術(shù)的關(guān)鍵在于尋找腫瘤特異性或相關(guān)性的抗原[9]。αFR是一種糖基磷脂酰肌醇耦聯(lián)蛋白，在正常組織中不表達或限制性低表達，但在90%的上皮性卵巢癌中高表達，并且其表達水平不受化療藥物的影響，故被認為是靶向治療卵巢癌的理想抗原[10]。近期的研究認為，自然殺傷細胞本身就具有直接識別殺傷腫瘤細胞等特性，或許是更好的CAR負載細胞[11]。但目前，靶向αFR的CAR修飾NK-92細胞報道較少。

綜上所述，本研究利用抗αFR的人源化抗體C4設(shè)計了靶向αFR的CAR(abti-αFR chimeric antigen receptor,αFR-CAR)，將該αFR-CAR基因構(gòu)建到pLenti-EF1α-MCS-T2A-Puro慢病毒表達載體上，包裝慢病毒感染NK-92細胞，制備NK-92-αFR-CAR細胞，鑒定CAR分子在NK-92細胞上的表達，并在細胞水平上進行功能實驗，為下一步進行NK-92-αFR-CAR細胞的臨床前和臨床研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑人自然殺傷細胞系NK-92由美國俄亥俄州立大學(xué)余建華教授贈予，用含12.5%胎牛血清、12.5%馬血清的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。293FT細胞株由本實驗室保存，人卵巢腺癌細胞系SK-OV-3和人皮膚鱗癌細胞系A(chǔ)-431由中國科學(xué)院干細胞庫提供，人卵巢癌細胞A2780細胞購買于Sigma-Aldrich公司，用含10%胎牛血清的DMEM-HG培養(yǎng)基培養(yǎng)。大腸埃希菌E.coliTOP10菌株由本實驗室保存。

寡核苷酸引物和第3代αFR-CAR分子的合成由金斯瑞公司完成，酶切后獲得的基因片段由華大基因科技服務(wù)有限公司完成DNA測序。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、限制性內(nèi)切酶、DNA純化回收試劑盒和SYBR?Premix Ex TaqTMII均購于Takara公司。馬血清和α-MEM培養(yǎng)基均購于Gibco公司，胎牛血清和DMEM-HG培養(yǎng)基購于BI公司。PE耦聯(lián)的小鼠抗人FOLR1抗體購自R&D SYSTEMS公司，F(xiàn)ITC耦聯(lián)的山羊抗人IgG Fc抗體購自Jackson ImmunoResearch公司，兔CD3ζ多克隆抗體購于Abcam公司，PolyJetTM試劑購于SignaGen公司，Polybrene試劑購于Santa Cruz Biotech公司，BCA蛋白提取試劑盒購于碧云天公司。慢病毒表達載體pLenti-EF1α-MCS-T2A-Puro質(zhì)粒及其相應(yīng)的輔助質(zhì)粒均購于上海和元公司。Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST試劑盒購于同仁公司，IFN-γ ELISA試劑盒和TNF-α ELISA試劑盒購于博士德公司。

1.2αFR-CAR分子的設(shè)計選擇CD8α信號肽，人源化單克隆抗體C4的scFv、IgG1 Fc段、CD8α鉸鏈區(qū)，CD28跨膜域以及共刺激分子CD28、CD137和CD3ζ鏈的細胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域為基礎(chǔ)，通過相應(yīng)的連接鏈將這些結(jié)構(gòu)串聯(lián)，獲得αFR-CAR分子。

1.3慢病毒表達載體構(gòu)建及基因片段測序分析通過人工合成獲得αFR-CAR基因并利用基因重組將其插入到pLenti-EF1α-MCS-T2A-Puro表達載體上，獲得pLenti-αFR-CAR慢病毒表達載體。利用XbaⅠ和BamH Ⅰ限制性內(nèi)切酶雙酶切pLenti-αFR-CAR質(zhì)粒，將酶切產(chǎn)物進行凝膠電泳，利用DNA純化回收試劑盒回收酶切DNA片段并進行測序分析，驗證pLenti-αFR-CAR載體上αFR-CAR基因的正確性。

1.4攜帶αFR-CAR基因的慢病毒的包裝及濃縮293FT細胞提前用10 cm皿鋪板，當(dāng)細胞匯合度達70%時進行換液，加入已用PolyJet進行預(yù)處理的慢病毒pLenti-αFR-CAR質(zhì)粒及其相應(yīng)的輔助質(zhì)粒，輕柔顛倒混勻，室溫靜置20 min。然后將此復(fù)合物加入到293FT細胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h后棄掉上清液，加入DMEM-HG完全培養(yǎng)基。72 h后收集上清液，0.45 μm濾器過濾，再補加DMEM-HG完全培養(yǎng)基10 mL，隔天再收集一次上清液。兩次收集的病毒上清按4∶1加入相應(yīng)的PEG8000溶液，離心后用 DMEM-HG培養(yǎng)基重懸病毒沉淀，每20微升進行分裝，-80 °C備用。

1.5慢病毒滴度的測定將293FT細胞接種于96孔板中，10 000個細胞/孔，共10孔，培養(yǎng)過夜。利用DMEM-HG完全培養(yǎng)基10倍梯度稀釋收集到的病毒濃縮液，共10個稀釋梯度。將96孔板的舊培養(yǎng)基吸棄，加入稀釋的病毒液，做好標(biāo)記，培養(yǎng)48 h。熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，選取能進行計數(shù)的孔并計數(shù)熒光克隆數(shù)，并根據(jù)稀釋倍數(shù)進行計算，公式如下：

病毒滴度(TU/mL)=熒光克隆數(shù)×該孔對應(yīng)的稀釋倍數(shù)

1.6αFR-CAR慢病毒感染NK-92細胞NK-92細胞計數(shù)，按105個細胞/孔將其接種至6孔板，共3個孔，然后置于細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h。按照感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為10的比例加入空載慢病毒顆粒(empty vector,EV)和αFR-CAR慢病毒顆粒，再向每孔加入8 μg/mL的Polybrene，并進行標(biāo)注。96 h后向培養(yǎng)液中加入終濃度為5 mg/mL的嘌呤霉素。

1.7細胞總蛋白的提取及Western blot檢測分別收集NK-92、NK-92-EV、NK-92-αFR-CAR細胞沉淀，加入RIPA，置于冰上裂解細胞10 min后取上清，用BCA法檢測蛋白濃度，按照上樣量50 μg計算所需上清體積，加入適量的RIPA和5×Loading Buffer，煮沸5 min，80 °C保存。配制聚丙烯酰胺凝膠，上樣，蛋白樣品經(jīng)蛋白凝膠電泳分離后進行電轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，封固，洗膜，加入兔抗人CD3ζ抗體，4 °C輕搖過夜。洗膜后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體。ECL顯色液顯色后利用Bio-Rad ChemiDocTM成像系統(tǒng)采集圖像。

1.8RNA的抽提、逆轉(zhuǎn)錄和qPCR分別收集NK-92、NK-92-EV、NK-92-αFR-CAR細胞沉淀，加入Trizol裂解液進行裂解，按照RNA抽提試劑盒說明書依此加入氯仿、異丙醇和75%乙醇，RNA沉淀干燥10 min后加入無RNA酶的水，使其完全溶解后進行濃度測定。按照試劑盒說明書，利用PrimeScriptTMreagent Kit with gDNA Eraser對抽提的3種細胞的總RNA進行基因組DNA去除反應(yīng)。隨后將獲得的反應(yīng)液按說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到cDNA溶液。按照試劑盒說明書，利用獲得的cDNA溶液、SYBR?Premix Ex TaqTMII和GAPDH以及αFR-CAR的引物(GAPDH：正向引物5＇- GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3＇，反向引物5＇-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3＇；αFR-CAR：正向引物5＇- GAAGAAGAGGAGGGCGGCTGC-3＇，反向引物5＇- GGCCCAGGTTCAGCTCGTTGTA-3＇)配置qPCR反應(yīng)液，qPCR反應(yīng)程序：95 °C×30 s→95 °C×5 s→60 °C×40 s，40 個循環(huán)。根據(jù)目的基因以及內(nèi)參基因的Cq值比較分析mRNA的相對表達水平。

1.9流式細胞術(shù)檢測收集SK-OV-3、A2780和A-431 3種腫瘤細胞各105于1.5mL EP管中，離心半徑8 cm、1000 r/min 離心5 min，棄上清，50 μL PBS重懸，加入3 μL αFR的流式抗體或同型對照，混勻，避光室溫孵育30 min，PBS洗滌后流式細胞檢測儀檢測3種腫瘤細胞靶抗原的表達情況。分別收集NK-92、NK-92-EV、NK-92-αFR-CAR細胞，1.5 mL離心管，離心半徑8 cm、1000 r/min離心5 min，棄上清，用PBS洗滌1次，再用100 μL PBS重懸細胞并加入FITC耦聯(lián)的山羊抗人IgG Fc抗體，室溫孵育30 min后流式細胞儀檢測NK-92細胞膜表面抗體標(biāo)記情況，F(xiàn)ITC檢測陽性即為αFR-CAR分子表達陽性。

1.10LDH釋放實驗檢測細胞殺傷效應(yīng)按照試劑盒說明書，在96孔板中設(shè)置效應(yīng)細胞加靶細胞LDH釋放孔(effector release,ER)、效應(yīng)細胞自發(fā)LDH釋放孔(effector spontaneous release,ESR)、靶細胞自發(fā)LDH釋放孔(target spontaneous release,TSR)、靶細胞最大LDH釋放孔(target maximum release,TMR)、空白培養(yǎng)基孔(control medium bufferCMB)和體積校正孔(volume correction controlVCC)，每類設(shè)置3個復(fù)孔。向相應(yīng)孔中接種靶細胞(腫瘤細胞)，3000個細胞/孔，并加入50 μL無血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。次日，按不同效靶比制備NK-92、NK-92-EV、NK-92-αFR-CAR細胞懸液，加入相應(yīng)孔中。效靶細胞共培養(yǎng)18 h后，向TMR孔和VCC孔中加入Lysis Buffer裂解細胞30 min，再向所有孔中加入Working Solution，室溫避光5 min后加入Stop Solution，利用酶標(biāo)儀測量各孔溶液在490 nm波長處的A值。公式如下：

殺傷效率=(ER-ESR-TSR+CMB)/(TMR-VCC-TSR+CMB)×100%

1.11ELISA檢測效應(yīng)細胞IFN-γ和TNF-α的分泌水平在24孔板中接種靶細胞，2×104個細胞/孔，過夜培養(yǎng)后，向孔中加入4×105個效應(yīng)細胞(NK-92、NK-92-EV或NK-92-αFR-CAR細胞)。效靶細胞共培養(yǎng)24 h后，收集各孔中的培養(yǎng)基上清，然后按ELISA試劑盒說明書操作，檢測各孔培養(yǎng)基上清中IFN-γ和TNF-α的濃度。

2 結(jié) 果

2.1 αFR-CAR分子的結(jié)構(gòu)設(shè)計CAR的細胞外段由CD8α信號肽、來源于抗αFR的人源化單抗C4的scFv及人IgG1 Fc段組成，跨膜段為CD28分子的跨膜結(jié)構(gòu)域，細胞內(nèi)段包含CD28、CD137和CD3ζ細胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域。見圖1。

圖1 第3代αFR-CAR的結(jié)構(gòu)示意圖Figure 1 Structure diagram of the third generation αFR-CAR

2.2αFR-CAR慢病毒表達載體的構(gòu)建通過雙酶切鑒定實驗發(fā)現(xiàn)，酶切后有一條2000 bp左右的基因片段，而空載質(zhì)粒則不一樣，見圖2。同時，回收該基因片段并進行DNA測序，結(jié)果證實該基因片段的序列與設(shè)計的αFR-CAR分子的DNA序列一致，說明成功構(gòu)建pLenti-αFR-CAR慢病毒表達載體，見圖3。

1:Maker;2、3:BamH Ⅰ和XbaⅠ酶切后的產(chǎn)物；4：質(zhì)粒a：αFR-CAR慢病毒表達載體的構(gòu)建;b：慢病毒表達質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果圖2 αFR-CAR表達載體Figure 2 Construction of αFR-CAR lentiviral expression vector

圖3 αFR-CAR DNA片段測序結(jié)果Figure 3 Sequencing result of target gene

2.3αFR-CAR分子在NK-92細胞膜上的表達結(jié)果顯示，經(jīng)嘌呤霉素篩選后，NK-92-αFR-CAR上αFR-CAR分子的表達效率超過90%，而NK-92和NK-92-EV未見αFR-CAR分子的表達。見圖4。

a：NK-92;b：K-92-EV;c:NK-92-αFR-CAR圖4 流式細胞檢測NK-92細胞上αFR-CAR分子的陽性表達效率Figure 4 Expression rate of αFR-CAR in NK-92 cells by flow cytometry assay

2.4αFR-CAR分子在NK-92細胞內(nèi)的表達Western blot 結(jié)果顯示，αFR-CAR分子在NK-92-αFR-CAR細胞中高表達，而在NK-92細胞和NK-92-EV細胞中未見表達。q-PCA法結(jié)果顯示，NK-92細胞、NK-92-EV細胞和NK-92-αFR-CAR細胞中αFR-CAR分子表達分別為0±0.08、0.78±0.11、2 581.20±311.84。見圖5。

1：NK-92;2：K-92-EV;3:NK-92-αFR-CAR圖5 翻譯水平上αFR-CAR分子的表達Figure 5 The expression of αFR-CAR molecule

2.5NK-92-αFR-CAR細胞的腫瘤殺傷活性LDH釋放實驗結(jié)果顯示：相較于NK-92細胞和NK-92-EV細胞，NK-92-αFR-CAR細胞可明顯殺傷SK-OV-3細胞和A2780細胞(P<0.05)，且殺傷效應(yīng)隨著效靶比升高而增強；但NK-92細胞和NK-92-EV細胞的殺傷效應(yīng)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。對于A-431細胞，NK-92細胞、NK-92-EV細胞和NK-92-αFR-CAR細胞的殺傷效應(yīng)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖6。

2.6NK-92-αFR-CAR細胞的IFN-γ和TNF-α分泌能力相較于NK-92細胞和NK-92-EV細胞，NK-92-αFR-CAR細胞與SK-OV-3細胞或A2780細胞共培養(yǎng)后，其IFN-γ和TNF-α分泌水平顯著更高(P<0.01)；但與A-431細胞共培養(yǎng),3種細胞中IFN-γ和TNF-α表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

a:SK-OV-3;b:A2780;c:A-431與NK-92細胞比較，*P<0.01；與NK-92-EV細胞比較，#P<0.01圖6 NK-92-αFR-CAR細胞對αFR陽性腫瘤細胞的特異殺傷能力比較Figure 6 Specific cytolytic effect of NK-92-αFR-CAR cells on the αFR-positive tumor cells detected

表1 ELISA技術(shù)檢測的NK-92-αFR-CAR細胞抗原依賴的IFN-γ和TNF-α細胞因子的分泌Table 1 The secretion of IFN-γ and TNF-α of NK-92-αFR-CAR cells on αFR-positive tumor cells detected by ELISA assay

3 討 論

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，也是女性中最常見的腫瘤性致死原因之一。盡管針對卵巢癌的手術(shù)治療、化療和放療在不斷改進，目前統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，卵巢癌患者的5年生存率并未得到顯著提升。相反，還出現(xiàn)了化療耐藥、高復(fù)發(fā)率等問題[12]。因此，迫切需要尋找更有效的治療方法。

隨著腫瘤免疫學(xué)理論和技術(shù)的發(fā)展，以CAR修飾免疫細胞為代表的過繼性細胞免疫治療在腫瘤治療中的作用日益凸顯。尤其是在血液系統(tǒng)腫瘤中，CAR修飾免疫細胞表現(xiàn)出了極為出色的臨床療效。2017年，美國食品藥品監(jiān)督管理局先后批準(zhǔn)了兩款CAR修飾T細胞產(chǎn)品，用于治療急性淋巴細胞白血病和淋巴瘤。此外，已有多項研究證實，CAR修飾免疫細胞對多種腫瘤如膠質(zhì)母細胞瘤、乳腺癌等具有良好療效[13]。這些研究結(jié)果表明，惡性腫瘤患者有望迎來更有效的“活細胞治療藥物”。

近年來，基于免疫細胞活化的信號通路機制，研究者將共刺激分子(如CD28、CD134、CD137等)引入CAR結(jié)構(gòu)中，發(fā)展出第二代CAR(含一個共刺激分子)和第三代CAR(含兩個共刺激分子)。研究發(fā)現(xiàn)，相比于第一代和第二代CAR，第三代CAR能賦予負載細胞更強的腫瘤殺傷活性和增殖能力，以及更長的存活時間[14]。然而，目前應(yīng)用于臨床研究的CAR多為第二代，第三代CAR的研究尚少。

在早期構(gòu)建靶向αFR的CAR時，使用的是來源于鼠源性抗體MOv18的scFv。雖然臨床試驗結(jié)果證明了基于該scFv構(gòu)建的CAR的安全性，但CAR修飾T細胞在患者體內(nèi)存在時間較短，無法產(chǎn)生有效的抗腫瘤活性[15]。究其原因，可能是患者體內(nèi)出現(xiàn)了人抗鼠抗體，導(dǎo)致了CAR修飾T細胞活性下降。此外，目前關(guān)于CAR修飾免疫細胞的研究大多關(guān)注于CAR修飾T細胞。但近期的研究發(fā)現(xiàn)，NK細胞本身表達多種活化性受體，可以直接識別并殺傷腫瘤細胞。而且，其在體內(nèi)循環(huán)周期有限，釋放的細胞因子譜副作用較小[11,16-17]。因此，NK細胞被認為是另一種較佳的CAR負載細胞。

綜上所述，本研究以卵巢癌中高表達的αFR為靶點，設(shè)計并構(gòu)建完全人源化的第三代CAR，包裝慢病毒并感染NK-92細胞，獲得NK-92-αFR-CAR細胞。經(jīng)體外細胞實驗證實，該NK-92-αFR-CAR細胞不僅能特異性殺傷αFR陽性的卵巢癌細胞，還能抗原特異性地分泌細胞因子。本研究獲得的結(jié)果，為進一步開展NK-92-αFR-CAR細胞的臨床前和臨床研究奠定了基礎(chǔ)。