朱 敏，崔德軍，葉麗敏，李 宇，袁 芳

0 引 言

胃癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，居全世界癌癥死因的第2位，大多數(shù)患者確診時(shí)已處于進(jìn)展期，預(yù)后較差[1]。腫瘤指標(biāo)癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)是臨床上常用于篩查腫瘤的指標(biāo)。有研究報(bào)道，CEA單獨(dú)診斷胃癌的靈敏度和特異度分別為66.7%和61.4%[2]。因此，具有高靈敏度和高特異性的腫瘤標(biāo)志物對(duì)胃癌的診斷及治療有重要的意義。微小RNA(miRNA)是一種廣泛存在于真核生物細(xì)胞中的小分子RNA，可參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，并與腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)。miRNAs可穩(wěn)定存在于血漿或血清中。miRNAs可能有助于闡明腫瘤生長(zhǎng)的機(jī)制及發(fā)現(xiàn)早期檢測(cè)胃癌的有效標(biāo)志物[3-4]。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-182在胃癌組織中的表達(dá)增高且其高表達(dá)提示了病情進(jìn)展及不良預(yù)后[5]；然而Kong等[6]研究發(fā)現(xiàn)miRNA-182在人胃腺癌組織中表達(dá)水平明顯下調(diào)，并可靶向編碼cAMP響應(yīng)元件結(jié)合蛋白1(cAMP Responsive Element Binding Protein，CREB1)基因抑制胃腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)。目前關(guān)于血清miRNA-182的表達(dá)水平及其對(duì)胃癌的診斷效能的研究報(bào)道較少。本研究通過(guò)檢測(cè)血清miRNA-182表達(dá)水平，分析其與胃癌患者臨床病理指標(biāo)之前的關(guān)系，并研究其聯(lián)合CEA對(duì)胃癌的診斷效能及臨床意義，為臨床早期診斷胃癌提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2017年6月-2018年6月在我院消化內(nèi)科就診經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)，且均未進(jìn)行治療的胃癌患者68例(胃癌組)，行胃鏡病理檢查確診的胃炎患者65例(胃炎組)及健康體檢人群65例(對(duì)照組)。68例胃癌患者中，男36例、女32例，年齡27～70歲，平均(46.13±12.57)歲；根據(jù)胃癌TNM分期第八版，分為Ⅰ～Ⅳ期[7]。其中Ⅰ期9例、Ⅱ期17例、Ⅲ期24例、Ⅳ期18例。胃炎患者未進(jìn)行治療，且無(wú)腫瘤病史，其中男35例、女30例，年齡28～68歲，平均(46.48±10.58)歲。健康體檢人群均無(wú)全身性疾病及腫瘤，其中男38例、女27例，年齡27～67歲，平均(46.63±9.64)歲。3組間年齡、性別比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究通過(guò)貴州省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審批(倫理編號(hào)：[2017]122)。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2實(shí)驗(yàn)主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑原位雜交檢測(cè)試劑盒、DAB顯色試劑盒(均購(gòu)自武漢博士德公司)、地高辛標(biāo)記的miRNA-182原位雜交探針(美國(guó)Exiqon公司)、TRIzol Reagent、miRNA-182、U6引物(均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司)、SYBR Green PCR Master Mix(TaKaRa)、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific)。

1.2.2主要儀器熒光顯微鏡(日本Nikon公司)、全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(日本日立公司)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司)、Allegra X-15R高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)貝克曼公司)。

1.3方法

1.3.1 原位雜交檢測(cè)胃癌組織及癌旁組織中miRNA-182表達(dá)將石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，經(jīng)4%多聚甲醛室溫固定，胃蛋白酶消化15 min，預(yù)雜交液(20 μL/片)55℃孵育2 h，加入miRNA-182雜交探針液(0.5 μg/μL)55℃孵育過(guò)夜；次日，SSC緩沖液梯度充分洗滌切片，室溫封閉30 min，生物素化鼠抗地高辛孵育2 h，鏡下進(jìn)行DAB顯色；蘇木素復(fù)染，充分水洗，中性樹膠封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.3.2血清標(biāo)本的收集所有研究對(duì)象均抽取外周靜脈血6 mL，用普通采血管采集，1600 r/min離心(離心半徑9.8 cm)10 min，吸取上層液體到干凈的EP管；再15 000 r/min離心(離心半徑9.8 cm)10 min，吸取上層血清于干凈的離心管中，置-80℃凍存。

1.3.3總RNA的提取取200 μL血清加入1 mL TRIZOL進(jìn)行處理，混勻后冰上靜置5 min；加入200 μL氯仿充分震蕩后冰上靜置5 min，4 ℃，12 000 r/min離心(離心半徑9.8 cm)15 min，輕取上層液體加入500 μL異丙醇，冰上靜置10 min，12000 r/min離心(離心半徑9.8 cm)10 min，棄去上清液留RNA沉淀，加入1 mL 75%乙醇充分混勻，7500 r/min(離心半徑9.8 cm)離心5 min，棄去上清液干燥10 min，干燥后加入20 μL DEPC水溶解RNA，并測(cè)定RNA的純度及濃度。

1.3.4實(shí)時(shí)定量qRT-PCR檢測(cè)將提取得到的RNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。miRNA-182以U6作為內(nèi)參，采用SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)各組血清miRNA-182的相對(duì)表達(dá)量。引物設(shè)計(jì)如下：miRNA-182上游5′-TGCGGTTTGGCAATGGTAGAAC-3′，下游5′-CCAGTG- CAGGGTCCGAGGT-3′；U6上游5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游5′-CGCT- TCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。配25 μL的qPCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。miRNA-182基因的相對(duì)表達(dá)量按公式(2-ΔΔCt法)計(jì)算。

1.3.5組織及血清miRNA-182表達(dá)水平結(jié)果判定及CEA陽(yáng)性值界定組織中miRNA-182陽(yáng)性判斷：miRNA-182陽(yáng)性時(shí)鏡下顯示黃色或棕黃色顆粒樣物質(zhì)；血清中miRNA-182高表達(dá)量判斷：根據(jù)miRNA-182的相對(duì)表達(dá)量均值為標(biāo)準(zhǔn)，其相對(duì)表達(dá)量高于均值則為高表達(dá)，反之則為低表達(dá)；血清中CEA陽(yáng)性率判斷：依據(jù)《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》(4版)參考范圍(CEA:0～4.7 ng/mL)，CEA>4.7 ng/mL作為判斷陽(yáng)性率的標(biāo)準(zhǔn)[8]。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS22.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料以n(%)表示，組間比較采用2檢驗(yàn)；miRNA-182相對(duì)表達(dá)量用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，CEA呈非正態(tài)分布，故用M(P25，P75)表示。各組間miRNA-182表達(dá)水平的比較采用單因素方差分析，CEA表達(dá)水平的比較采用H檢驗(yàn)。采用ROC曲線分析miRNA-182和CEA在胃癌中的診斷價(jià)值。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miRNA-182在胃癌組織中的表達(dá)情況原位雜交結(jié)果顯示，miRNA-182在胃癌組織中陽(yáng)性表達(dá)52例，陽(yáng)性率為76.47%；而miRNA-182在癌旁組織中陽(yáng)性表達(dá)15例，陽(yáng)性表達(dá)率為22.06%，兩者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=40.273，P<0.05)，見圖1。Ⅰ+Ⅱ期胃癌組織中miRNA-182陽(yáng)性表達(dá)12例，陽(yáng)性率為46.15%；Ⅲ期+Ⅳ期胃癌組織中miRNA-182陽(yáng)性表達(dá)40例，陽(yáng)性率為95.24%，胃癌分期越晚，患者組織中miRNA-182陽(yáng)性表達(dá)率越高(2=21.503，P<0.05)，見圖2。

a：miRNA-182陰性表達(dá)；b：miRNA-182陽(yáng)性表達(dá)圖1 原位雜交檢測(cè)miRNA-182在胃癌組織的表達(dá)Figure 1 The black frame indicates the site to be mutatedExpression of miRNA-182 in gastric cancer tissues detected by in situ hybridization

a：Ⅰ+Ⅱ期胃癌組織；b：Ⅲ期+Ⅳ期胃癌組織圖2 原位雜交檢測(cè)不同TNM分期胃癌組織中miRNA-182的表達(dá)Figure 2 Expression of miRNA-182 in gastric cancer tissues with different TNM stages

2.2miRNA-182和CEA在胃癌組、胃炎組及對(duì)照組血清中的表達(dá)情況胃癌患者血清miRNA-182相對(duì)表達(dá)量及CEA的表達(dá)水平均高于胃炎患者和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而胃炎患者與對(duì)照組相比，miRNA-182相對(duì)表達(dá)量與CEA的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組血清中miRNA-182相對(duì)表達(dá)量比較Table 1 relative expression of miRNA-182 in serum of each group

2.3不同分期胃癌患者血清中miRNA-182和CEA表達(dá)水平Ⅰ+Ⅱ期胃癌患者血清miRNA-182相對(duì)表達(dá)量及CEA的表達(dá)水平均低于Ⅲ期患者和Ⅳ期患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而Ⅲ期患者與Ⅳ期患者相比，miRNA-182相對(duì)表達(dá)量與CEA的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 不同分期胃癌患者血清中miRNA-182相對(duì)表達(dá)量及CEA表達(dá)水平的比較Table 2 Comparison of miRNA-182 relative expression and CEA expression in serum of patients with different stages of gastric cancer

2.4miRNA-182的表達(dá)水平與胃癌臨床指標(biāo)的關(guān)系miRNA-182高表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤大小等因素?zé)o關(guān)，而與腫瘤TNM分期、分化程度、轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。分化程度低、TNM分期為Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者血清miRNA-182高表達(dá)率較分化程度中+高、臨床分期為Ⅰ+Ⅱ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者血清miRNA-182高表達(dá)率更高(P<0.05)。見表3。

表3 miRNA-182的表達(dá)水平與胃癌患者臨床指標(biāo)的關(guān)系[n(%)]Table 3 Relationship between miRNA-182 expression level and clinical indicators in patients with gastric cancer n(%)

2.5血清中miRNA-182及CEA的表達(dá)對(duì)胃癌的診斷效能miRNA-182診斷胃癌的ROC曲線下面積為0.850(95%CI 0.786～0.914)，其相應(yīng)的靈敏性和特異度分別為73.5%和84.6%。CEA診斷胃癌的ROC曲線下面積為0.947(95% CI 0.913～0.980)，其相應(yīng)的靈敏性和特異度分別為83.8%和73.4%。兩指標(biāo)聯(lián)合診斷胃癌的ROC曲線下面積為0.967(95%CI 0.943～0.991)，其相應(yīng)的靈敏性和特異度分別為94.1%和86.2%，且兩指標(biāo)聯(lián)合診斷胃癌的準(zhǔn)確性為90.2%，均優(yōu)于單個(gè)指標(biāo)(78.9%、79.7%)。見圖3。

圖3 miRNA-182+CEA聯(lián)合診斷胃癌的ROC曲線Figure 3 ROC curve of miRNA-182 + CEA in the diagnosis of gastric cancer

3 討 論

胃癌是世界第四大常見腫瘤，也是第二大癌癥相關(guān)死亡原因。我國(guó)胃癌發(fā)病率和病死率均居惡性腫瘤首位[9]。目前，胃鏡下病理組織活檢是胃癌診斷和評(píng)估TNM分期的“金標(biāo)準(zhǔn)”；但該方法屬于有創(chuàng)檢查，患者依從性較差，導(dǎo)致部分患者確診時(shí)多已處于胃癌晚期而失去了最佳的治療時(shí)機(jī)[10]。因此，早期診斷并治療是胃癌患者成功生存的關(guān)鍵。

腫瘤標(biāo)志物是指機(jī)體對(duì)新生物發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)入到體液、組織，或是癌細(xì)胞異常分泌或脫落的物質(zhì)，可提示腫瘤在宿主體內(nèi)的發(fā)生、發(fā)展或癌基因、抑癌基因的活化變異程度[11-12]。研究表明，實(shí)驗(yàn)室血清腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)對(duì)消化道系統(tǒng)腫瘤的診斷、預(yù)后具有積極意義[13]。CEA是一種酸性糖蛋白，屬于胚胎性致癌抗原，其在成人血清中含量極低，是一種廣譜腫瘤標(biāo)志物，在臨床上常與其他腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)用于消化道惡性腫瘤的診斷[14-15]。有研究發(fā)現(xiàn)，不同分期膽管癌患者膽汁CEA有顯著差異，其對(duì)膽管癌的診斷具有良好的臨床價(jià)值，可為膽管癌術(shù)前分期提供一定的參考價(jià)值[16]。賴曉東等[17]研究報(bào)道，CEA檢測(cè)結(jié)直腸癌 ROC曲線面積為0.784，敏感性73.2%、特異性82.5%，其聯(lián)合脂聯(lián)素及瘦素可顯著提高結(jié)直腸癌的檢出率。本研究檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胃癌患者CEA的表達(dá)水平顯著高于胃炎患者和對(duì)照組，Ⅲ期患者和Ⅳ期患者血清CEA的表達(dá)水平高于Ⅰ+Ⅱ期胃癌患者；血清CEA診斷胃癌的曲線下面積為0.947(95%CI 0.913～0.980)，其靈敏性和特異度分別為83.8%和73.4%，檢測(cè)準(zhǔn)確性79.7%，提示CEA檢測(cè)胃癌的靈敏度雖高但特異度不高。有研究也報(bào)道單一腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)存在特異度或敏感度較低等問(wèn)題，故臨床逐漸采用多種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)來(lái)診斷癌癥[18]。

miRNAs在人類疾病中的作用，特別是在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色，癌癥中miRNA通常具有促癌和抑癌作用，miRNA表達(dá)模式的改變對(duì)癌癥的診斷和預(yù)測(cè)患者的預(yù)后或?qū)χ委煹姆磻?yīng)具有重要作用[19]。miRNA-182可以作為癌基因或抑癌基因發(fā)揮作用，這取決于癌癥的類型、位置和階段[20]。Ou等[21]研究報(bào)道，miRNA-182通過(guò)抑制survivin的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，從而抑制了舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖，起到抑癌基因的作用。而Ling等[22]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-182在人胃腸道間質(zhì)瘤(Gastrointestinal Stromal Tumors,GIST)組織中的表達(dá)明顯高于鄰近正常組織，且miR-182的過(guò)表達(dá)促進(jìn)GIST-T1細(xì)胞的生長(zhǎng)，增加細(xì)胞增殖，減少細(xì)胞凋亡，miR-182的上調(diào)也促進(jìn)了GIST-T1細(xì)胞的集落形成和遷移。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胃癌患者胃癌組織中miRNA-182陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁組織，且Ⅲ期+Ⅳ期胃癌組織中miRNA-182陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于Ⅰ+Ⅱ期胃癌組織中miRNA-182陽(yáng)性表達(dá)率；胃癌患者血清miRNA-182相對(duì)表達(dá)量較胃炎患者和對(duì)照組均顯著上升，上述結(jié)果與儲(chǔ)懷祝等[5]在胃癌組織中的檢測(cè)結(jié)果一致；且不同胃癌TNM分期的miRNA-182相對(duì)表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。將患者的年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤分化程度、TNM分期及轉(zhuǎn)移等可能影響胃癌預(yù)后的因素進(jìn)行單因素分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miRNA-182高表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤大小等因素?zé)o關(guān)，而與腫瘤TNM分期、分化程度、轉(zhuǎn)移有關(guān)。提示miRNA-182在胃癌的進(jìn)程中起到癌基因的作用，可能促進(jìn)胃癌的發(fā)展。

ROC曲線分析miRNA-182對(duì)胃癌的診斷效能，結(jié)果顯示miRNA-182診斷胃癌的ROC曲線下面積為0.850(95%CI 0.786～0.914)，其相應(yīng)的靈敏性和特異度分別為73.5%和84.6%，其檢測(cè)的準(zhǔn)確性為78.9%。進(jìn)一步分析兩指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)對(duì)胃癌的診斷效能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩指標(biāo)聯(lián)合診斷胃癌的ROC曲線下面積為0.967(95% CI 0.943～0.991),其相應(yīng)的靈敏性和特異度分別為94.1%和86.2%，且兩指標(biāo)聯(lián)合診斷胃癌的準(zhǔn)確性為90.2%，均優(yōu)于單個(gè)指標(biāo)(78.9%、79.7%)。因此，兩者聯(lián)合檢測(cè)可為胃癌的診斷提供重要的參考信息。

綜上所述，血清miRNA-182聯(lián)合CEA檢測(cè)可提高胃癌診斷的靈敏性、特異度和準(zhǔn)確性，對(duì)胃癌早期發(fā)現(xiàn)及治療具有一定的臨床價(jià)值。