朱栗瓊 覃冬梅 招禮軍* 鄧斌勝 劉晟源 蔣昌杰

（1. 廣西大學(xué)林學(xué)院，廣西森林生態(tài)與保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530004；2. 崇左市林業(yè)科學(xué)研究所/崇左市園林科學(xué)技術(shù)研究所，崇左 532200；3. 廣西弄崗國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局，龍州 532400；4. 南寧市金花茶公園，南寧 530022）

金花茶組（Sect.Chrysantha）為山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia）常綠灌木或小喬木植物，主要分布于我國(guó)廣西、云南及越南交界處較窄范圍，常生長(zhǎng)在陰涼、潮濕、陽(yáng)光不能直射的山林中，伴生于熱帶性樹(shù)種林下［1］，是我國(guó)珍稀瀕危植物。金花茶組植物因花色金黃，具有“茶族皇后”的美譽(yù)，是培育黃色系山茶花的優(yōu)良遺傳基因資源，同時(shí)其體內(nèi)含有黃酮、茶多酚、多種氨基酸、維生素以及微量元素等，具有較高的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值。因此，引發(fā)了研究者的興趣，在金花茶資源調(diào)查［2～3］、形態(tài)［4］、分類［5～7］、遺傳［8～9］、繁育［10～11］、化學(xué)成分［12］等方面均有研究報(bào)道。在形態(tài)解剖學(xué)方面，主要從葉片橫切面及表皮特征出發(fā)，尋找金花茶種間差異，以此作為分類依據(jù)，如鄒琦麗［13］對(duì)9 種金花茶葉解剖發(fā)現(xiàn)葉表皮細(xì)胞有多角形和不規(guī)則形兩種類型；王任翔等［14～15］用掃描電鏡觀察了20種金花茶葉表皮微形態(tài)特征，在氣孔外拱蓋表面和內(nèi)緣、角質(zhì)膜等發(fā)現(xiàn)了具有分類意義的性狀；李鳳英等［16］在金花茶25個(gè)分類群葉下表皮中發(fā)現(xiàn)角質(zhì)膜、細(xì)胞垂周壁式樣及氣孔形狀等特征有一定分類學(xué)意義。植物葉表皮的微形態(tài)特征被認(rèn)為在同一地理分布區(qū)域內(nèi)表現(xiàn)出較強(qiáng)的一致性，可作為屬種間的分類依據(jù)［17～18］。葉的形態(tài)結(jié)構(gòu)受環(huán)境影響較明顯，因此用原產(chǎn)地的野生種來(lái)研究葉表皮的微形態(tài)特征保守性和可靠性更強(qiáng)。本研究以金花茶原生地廣西弄崗國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)的6 種野生金花茶的成熟葉片為對(duì)象，從葉表皮微形態(tài)的觀察和數(shù)量特征統(tǒng)計(jì)出發(fā)，比較6種野生金花茶種類之間的差異性，并探索各種間的親緣關(guān)系，為金花茶的分類學(xué)基礎(chǔ)研究提供理論依據(jù)，同時(shí)探討了該6種金花茶葉片微形態(tài)特征對(duì)當(dāng)?shù)靥厥猸h(huán)境的響應(yīng)策略，為制定野生金花茶的保育措施提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣地基本情況

實(shí)驗(yàn)材料采自廣西西南部崇左市的弄崗國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)，地理位置106°42′28″～107°4′54″E，22°13′56″～22°39′9″N，屬于裸露型喀斯特區(qū)域，主要由“峰叢—洼地”鑲嵌而成，石山峰海拔400～500 m，隸屬于北熱帶季風(fēng)氣候，年均溫22℃，極端最高溫40.5℃，極端最低溫-3℃，≥10℃的年積溫7 834℃，年均降雨量1 150～1 550 mm，干濕季明顯，其中5～9月為雨季，土壤以棕色和黑色石灰土為主。

本研究以保護(hù)區(qū)自然生長(zhǎng)的6 種野生金花茶為材料，分別是凹脈金花茶（Camellia impressinerv‐is，IM）、薄葉脈金花茶（C. chrysanthoides，CH）、毛籽金花茶（C.ptilosperma，PT）、檸檬黃金花茶（C.li‐menia，LI）、弄崗金花茶（C. longgangensis，LO）、四季金花茶（C.perpetua，PE）。每個(gè)種類各選擇5 株長(zhǎng)勢(shì)中等的樣樹(shù)，在東南西北四個(gè)方向選取中部枝條，分別剪取頂芽下5～7節(jié)的成熟健康葉片，用FAA液固定。

1.2 制片方法

表皮離析片的制作：剪取葉片近中部葉脈兩側(cè)部分約0.5 cm×0.5 cm 小塊樣品，將其浸泡于等量的30%過(guò)氧化氫溶液和醋酸溶液中，置于60℃水浴鍋中3 h，蒸餾水漂洗后再用次氯酸鈉溶液離析至透明，再次漂洗干凈，撕取表皮，裝片，于NikonE200光學(xué)顯微鏡下觀察、拍片及測(cè)量。測(cè)量和計(jì)算指標(biāo)有：氣孔長(zhǎng)度、氣孔、氣孔、指數(shù)［氣孔數(shù)/（氣孔數(shù)+表皮細(xì)胞數(shù)）］和上、下表皮細(xì)胞密度。

掃描電鏡制片：剪取固定好的葉片近中部葉脈兩側(cè)約0.5 cm×0.5 cm 的小方塊，蒸餾水漂洗后，每隔15 min 用磷酸緩沖液沖洗1 次，重復(fù)3 次。再每隔10 min 進(jìn)行1 次乙醇脫水，乙醇梯度變化為：50%—70%—80%—90%—100%，脫水自然干燥后取出，粘臺(tái)，噴金，于Phenom Pro 800-07334 掃描電子顯微鏡下觀察和拍照。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析以及制圖均用SPSS 20.0軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉表皮顯微形態(tài)特征

光學(xué)顯微鏡下，發(fā)現(xiàn)6種金花茶的葉片氣孔均分布在遠(yuǎn)軸面（下表皮），近軸面上未見(jiàn)氣孔的出現(xiàn)，上、下表皮細(xì)胞均為不規(guī)則狀，垂周壁都出現(xiàn)淺波至深波不等的起伏，每種上表皮細(xì)胞形狀及大小較均勻，下表皮細(xì)胞組成大小不一；所有種類的氣孔器均由3 個(gè)大小不等的副衛(wèi)細(xì)胞及2 個(gè)腎形的保衛(wèi)細(xì)胞而成，屬環(huán)列型氣孔，氣孔器呈寬橢圓形，而張開(kāi)的氣孔為橢圓形，但氣孔長(zhǎng)軸與短軸比例種間有所不同，另外在種間上還存在保衛(wèi)細(xì)胞兩級(jí)的T 型加厚具明顯和不明顯兩種類型（見(jiàn)圖1）。6 種金花茶葉的表皮細(xì)胞及氣孔器的形態(tài)特征見(jiàn)表1。

表1 6種金花茶葉表皮細(xì)胞及氣孔器顯微形態(tài)特征Table 1 The features of leaf epidermal cells and stomatal apparatus of six golden camellia species

2.2 葉片表皮超微形態(tài)特征

掃描電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，6 種金花茶上、下表皮細(xì)胞形狀不規(guī)則，大小不等，凹凸也不一致，氣孔隨機(jī)分布，除四季金花茶的上、下表皮細(xì)胞的輪廓不清楚外，其余五種表皮細(xì)胞輪廓均清晰可見(jiàn)（見(jiàn)圖2～3）。表皮細(xì)胞平周壁除四季金花茶的上表皮與細(xì)胞持平，檸檬黃金花茶下表皮向上突起外，其余的均呈下陷狀；下表皮角質(zhì)層紋飾分為兩類，一種是輻射狀，包括毛籽金花茶和弄崗金花茶，其余的皆為線狀。所有種類表皮細(xì)胞外蠟質(zhì)層均有不同程度的絲狀飾紋，有的還分布有鏈狀、絮狀或顆粒狀飾紋，比較特殊的是四季金花茶上表皮蠟質(zhì)層還有乳突、下表皮蠟質(zhì)層還有痂狀飾紋。6 種金花茶葉表皮超微形態(tài)特征見(jiàn)表2。

表2 6種金花茶葉表皮細(xì)胞輪廓和飾紋超微形態(tài)特征Table 2 The ultra-structure of leaf epidermal cells and ornamentation of six golden camellia species

掃描電鏡下觀察氣孔器及其外拱蓋特征見(jiàn)表3。從圖2～3 中可看出，金花茶氣孔器呈近圓形或橢圓形，氣孔器鑲嵌于下表皮細(xì)胞位置有兩種狀態(tài)，其中凹脈金花茶、薄葉金花茶、毛籽金花茶和弄崗金花茶氣孔器與表皮細(xì)胞位置相持平，而檸檬金花茶和四季金花茶氣孔器則呈下陷狀。6 種金花茶氣孔器外圍角質(zhì)層均有飾紋，但飾紋類型不同，凹脈金花茶為單層不完全環(huán)形，薄葉金花茶為多層不明顯環(huán)形，毛籽金花茶、檸檬黃金花茶、弄崗金花茶呈環(huán)形，四季金花茶的飾紋有兩層，外層左右各一條呈括弧狀，與氣孔長(zhǎng)軸方向一致，內(nèi)層呈環(huán)形；氣孔外拱蓋表面除四季金花茶的為粗糙型外，其余的皆為近平滑型，而氣孔外拱蓋內(nèi)緣形狀，除凹脈金花茶為較平直外，其余的皆為淺波狀。

表3 6種金花茶氣孔器及氣孔外拱蓋超微形態(tài)特征Table 3 The ultra-structure of stomatal apparatus and outer stomata ledge of six golden camellia species

2.3 6種金花茶葉表皮特征數(shù)值比較

葉片表皮包括表皮細(xì)胞和氣孔兩部分，本研究所測(cè)6 種金花茶葉表皮細(xì)胞及氣孔的相關(guān)數(shù)量特征及統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 6種金花茶葉表皮細(xì)胞及氣孔數(shù)量特征Table 4 The quantitative features of leaf epidermal cells and stomata of six golden camellia species

氣孔長(zhǎng)度變化范圍是12.28±0.34～15.57±0.16 μm，除四季金花茶顯著小于（P＜0.05，下同）其它五種外，其它五種間差異不顯著（P＞0.05，下同）；氣孔寬度在8.14±0.25～9.85±0.18 μm，薄葉金花茶、毛籽金花茶、檸檬黃金花茶和弄崗金花茶的氣孔寬度相對(duì)較大，四個(gè)種之間差異不顯著；凹脈金花茶和四季金花茶，這兩種都顯著小于其它四種，且兩者間差異亦顯著；氣孔密度的變化范圍是149.64±5.00～246.57±4.47 個(gè)·mm-2，密度最高的是薄葉金花茶，除該種與凹脈金花茶兩者之間差異不顯著，其余各種之間差異均顯著。氣孔指數(shù)在12.98%～20.93%之間變化，四季金花茶最大，弄崗金花茶最小。

6 種金花茶葉表皮細(xì)胞密度都是上表皮大于下表皮，說(shuō)明上表皮細(xì)胞普遍比下表皮細(xì)胞小，其中上表皮細(xì)胞密度變化范圍是2 002.77±31.68～3 266.90±48.09 個(gè)·mm-2，密度最高的是薄葉脈金花茶，最小的是弄崗金花茶，弄崗金花茶與檸檬黃金花茶間的上表皮細(xì)胞密度差異不顯著，其它種類之間差異顯著；下表皮細(xì)胞密度的變化范圍在802.64±21.73～1 550.87±28.27 個(gè)·mm-2，薄葉金花茶密度最大，而且與其余五種存在顯著差異，密度最小的是檸檬黃金花茶，除與四季金花茶間的差異不顯著外，與其它種類的差異顯著，凹脈金花茶、毛籽金花茶、弄崗金花茶，三者之間差異不顯著。

2.4 6種金花茶葉表皮數(shù)量特征聚類分析

聚類分析可根據(jù)遺傳距離的長(zhǎng)短來(lái)分析各性狀指標(biāo)之間的相關(guān)性，親緣關(guān)系較近的種類常聚為一類［19］，可用于優(yōu)良性狀的選育工作。本研究采用上述6 個(gè)葉表皮數(shù)量特征進(jìn)行Euclidean 距離聚類分析，從聚類樹(shù)狀圖可以看出弄崗金花茶和毛籽金花茶距離最小，表明兩者的親緣關(guān)系最近，四季金花茶與其它種的遺傳距離最大，表明其與它們的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，其余種間的親緣關(guān)系位于之間。以類別最小相關(guān)系數(shù)為分類標(biāo)準(zhǔn)，6種野生金花茶可分為五類，其中弄崗金花茶（LO）和毛籽花茶（PT）聚為一類，距離系數(shù)為2.407，兩者在氣孔長(zhǎng)、寬及下表皮細(xì)胞密度差異不顯著，同時(shí)兩者表皮細(xì)胞的蠟質(zhì)紋飾、角質(zhì)層紋飾及氣孔外蓋特征具有高度相似性，特別是下表皮角質(zhì)層紋飾，兩者輻射狀粗條紋與其它種類的線狀紋飾具明顯區(qū)別，其余四種金花茶在各測(cè)量和觀察特征規(guī)律性不明顯，所以可自成一類（見(jiàn)圖4）。

3 討論

3.1 葉表皮微形態(tài)特征在植物分類中的應(yīng)用

大量研究表明，葉表皮微形態(tài)特征是植物系統(tǒng)分類及演化趨勢(shì)分析的重要指標(biāo)，無(wú)論是在種間、屬間，甚至是科級(jí)水平的分類上應(yīng)用均有相關(guān)報(bào)道［17--24］，報(bào)道中涉及的常用指標(biāo)主要有：表皮角質(zhì)膜、蠟質(zhì)飾紋、表皮細(xì)胞大小和形態(tài)、垂周壁式

樣、氣孔器類型、氣孔大小、密度、指數(shù)及氣孔蓋特征等。本研究用上述指標(biāo)對(duì)6 種金花茶的研究結(jié)論與王任翔等人［14～16］的研究相比較，相同之處有：表皮細(xì)胞形狀不規(guī)則，垂周壁彎曲；氣孔僅分布于下表皮，氣孔器近圓形，具有3 個(gè)大小不一的副衛(wèi)細(xì)胞，屬環(huán)列型氣孔。相同的結(jié)果一方面說(shuō)明這些特征是金花茶組植物的共性，另一方面說(shuō)明這些特征比較保守，受環(huán)境影響較小，可以考慮作為種以上水平的分類依據(jù)。研究結(jié)果差異較大的有：氣孔密度、氣孔外拱蓋角質(zhì)膜和蠟質(zhì)飾紋等特征。李鳳英等人［14～16］在研究金花茶組時(shí)這幾個(gè)指標(biāo)也具有差異性。實(shí)際上除金花茶組植物外，其它植物類群中也有類似報(bào)道［22，25］，說(shuō)明葉表皮這些屬性受環(huán)境影響較大，具有一定可塑性，在利用它們作為分類依據(jù)時(shí)要注意結(jié)合樣地環(huán)境因子綜合考慮。

除上述共性之處，本研究利用掃描電鏡觀察到6種金花茶葉表皮微形態(tài)還有各自的特征，對(duì)該六種金花茶分類有一定參考意義。如：凹脈金花茶葉下表皮蠟質(zhì)紋飾有較長(zhǎng)的鏈狀和絮狀紋飾；薄葉金花茶葉的氣孔外拱蓋角質(zhì)層有多層，使得外拱蓋角質(zhì)層平面呈淺波浪狀；檸檬黃金花茶葉下表皮蠟質(zhì)飾紋的絲狀體最短；毛籽金花茶和弄崗金花茶上表皮的蠟質(zhì)紋飾為長(zhǎng)絲狀，并附有較多絮狀體或顆粒狀紋飾，但兩者在下表皮細(xì)胞的垂周壁式樣及氣孔密度上有一定差異；四季金花茶的氣孔外拱蓋角質(zhì)層獨(dú)有兩層，蠟質(zhì)紋飾除絲狀體外，上表皮的還有乳突結(jié)構(gòu)，下表皮還有痂狀體結(jié)構(gòu)。

角質(zhì)層紋飾在不同類群間差異較大，常被研究者用來(lái)作為植物分類的重要指標(biāo)［20，23，26］，本研究發(fā)現(xiàn)6 種金花茶葉表皮細(xì)胞上覆蓋的蠟質(zhì)紋飾普遍具有長(zhǎng)短不一的圓柱狀或鏈狀絲狀體，這是前期研究者沒(méi)有報(bào)道過(guò)的特征，可考慮作為野生種與栽培種金花茶組區(qū)分的依據(jù)。

3.2 6種金花茶的親緣關(guān)系

6 種金花茶葉表皮細(xì)胞及氣孔密度、大小等6個(gè)數(shù)量指標(biāo)均存在不同程度的差異，差異顯著（P＜0.05）者在種間對(duì)比中可以作為分類的依據(jù)；用該6 個(gè)指標(biāo)對(duì)6 種金花茶進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明：毛籽金花茶和弄崗金花茶聚為一類，其余的4種各為1 類。相同或相近的特征意味著物種間具有較密切的親緣關(guān)系，不同特征的差異性表示種間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近和進(jìn)化的程度。毛籽金花茶和弄崗金花茶的葉表皮形態(tài)指標(biāo)大部分較相似，特別是下表皮角質(zhì)層輻射狀粗條紋紋飾明顯不同于其它四種，因此本研究支持將毛籽金花茶和弄崗金花茶歸并為一種的觀點(diǎn)［16，27］，施蘇華等［8］采用RAPD分子標(biāo)記方法的研究也表明毛籽金花茶和弄崗金花茶的親緣關(guān)系較近，從遺傳學(xué)角度支持將兩者歸并。與這兩個(gè)種親緣關(guān)系較近的是凹脈金花茶，但就表皮細(xì)胞形狀來(lái)看，具有深波狀垂周壁的凹脈金花茶其進(jìn)化程度要高于前兩者。四季金花茶因聚類距離系數(shù)的差距最大及其具有較多獨(dú)特的微形態(tài)特征，表明與其它五種間具有明顯的分化和較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系。其它兩種金花茶的親緣關(guān)系居于凹脈金花茶和四季金花茶之間。

3.3 金花茶葉表皮微形態(tài)特征與其環(huán)境適應(yīng)性

葉片形態(tài)在某種程度上反映了植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性及環(huán)境對(duì)植物形態(tài)發(fā)育的調(diào)控結(jié)果。有研究已證實(shí)，葉片的微形態(tài)特征與植物的抗逆性有直接或間接關(guān)系［28～29］。本研究采樣地位于北回歸線以南，屬于典型的喀斯特地貌類型，土層淺薄、巖石裸露、表層儲(chǔ)水能力差，年平均溫度和年積溫較高，植物必須具有一定的保水能力才能在旱季生存和延續(xù)；從觀察中可以看到，6 種金花茶葉表皮均具有一些適應(yīng)干旱環(huán)境的特征，具體反映在如下幾個(gè)方面：氣孔僅分布于下表皮，避免了光線直接照射，降低了植物對(duì)水分的蒸騰作用，利于對(duì)水分保存；葉片上表皮具有較明顯的角質(zhì)層和蠟質(zhì)層覆蓋，此兩類物質(zhì)均為脂類化合物，既能減少葉片內(nèi)部水分過(guò)渡流失，又不影響光線進(jìn)入葉肉組織［30］，保障光合作用正常進(jìn)行；表皮細(xì)胞壁均較厚，既能增強(qiáng)葉片支持力和致密度，同時(shí)可以削弱水分的滲透散發(fā)，防止葉片因缺水而萎蔫；部分種類的下陷氣孔也是減弱外界高溫氣流直接進(jìn)入葉片內(nèi)部的一種抗旱適應(yīng)性特征。綜上所述，6種金花茶的葉片形態(tài)及結(jié)構(gòu)特征對(duì)當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境具有較好的適應(yīng)策略，同時(shí)反映了其結(jié)構(gòu)與功能的統(tǒng)一性。