任偉超 徐 姣 孫 偉 劉美琦 于欣欣 王思嘉 馬 偉*

（1. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，哈爾濱 150040；2. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院，佳木斯 154007；3. 中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700）

近年來，DNA 條形碼技術(shù)已被陸續(xù)應(yīng)用于木本植物及相應(yīng)木材的種質(zhì)鑒定，在目標(biāo)基因選擇、DNA 提取及生物信息學(xué)分析等方面均取得顯著進(jìn)展［1］。植物DNA 條形碼的研究主要集中于葉綠體基因組和核基因組。葉綠體片段（matK、rbcL 和psbA-trnH）和核基因片段（ITS）已廣泛應(yīng)用于高等植物DNA 條形碼研究中［2～10］。目前關(guān)于柳屬植物的DNA 條形碼技術(shù)分析的相關(guān)研究較少。劉明航［11］對垂柳、曲枝垂柳、龍爪柳的ITS 序列進(jìn)行擴(kuò)增及測序分析，結(jié)果表明曲枝垂柳、龍爪柳、垂柳、旱柳差異是種內(nèi)變異水平，應(yīng)為一個(gè)種。該結(jié)論與傳統(tǒng)柳屬的分類存在明顯的不同。王東超［12］對32 種柳屬進(jìn)行測序，結(jié)果支持將鉆天柳歸入柳屬當(dāng)中且與大白柳為一支。準(zhǔn)葛爾柳與本組另外兩種親緣關(guān)系遠(yuǎn)，可以單獨(dú)分支，建議四子柳和纖序柳合并為一個(gè)種，建議紫柳組分為兩個(gè)類群。

DNA 條形碼技術(shù)是以染色體組為基礎(chǔ)，用一段標(biāo)準(zhǔn)DNA 序列作為標(biāo)記實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確和自動(dòng)化的物種鑒定方法［13］，具有以下優(yōu)點(diǎn)［14～15］：①由于具有穩(wěn)定的遺傳信息，不受檢測樣本形態(tài)變化的影響。②對在形態(tài)學(xué)上相近的物種進(jìn)行物種鑒定。③建立數(shù)據(jù)庫完善遺傳信息，彌補(bǔ)傳統(tǒng)分類對物種形態(tài)描述的不足。該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物物種鑒定、中藥材混偽品鑒定、進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫、食品安全檢測等。林業(yè)方面利用DNA 條形碼技術(shù)對木材種類進(jìn)行監(jiān)管，同時(shí)還能規(guī)范木材貿(mào)易市場和保護(hù)珍貴瀕危樹種。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究選取黑龍江省分布的柳屬植物，樣本采自于伊春、哈爾濱、大慶、塔河，共計(jì)11 個(gè)物種40份樣本。所有憑證標(biāo)本保留在黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院。具體采集地、海拔及經(jīng)緯度信息見表1。本研究采用新鮮、成熟、健康的柳屬葉片作為提取DNA的實(shí)驗(yàn)材料。將樣本置于其中40℃中烘干24 h。本研究引用的序列Genbank 登陸號與其對應(yīng)的物種名見表2。

表2 研究引用GenBank中的序列Table 2 The GenBank sequences used in study

1.2 基因組DNA提取

取植物樣本約50 mg 加入液氮充分碾磨。向粉末中加入700 μL DNA裂解液，56℃水浴2 h。采用植物基因組DNA提取試劑盒提取總DNA。

1.3 PCR擴(kuò)增與測序

ITS2 通 用 引 物S2F：5'-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3' 和S3R：5'-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3'。反應(yīng)條件為94℃，5 min；（94℃，30 s；56℃，30 s；72℃，45 s）40 個(gè)循環(huán)；72℃，10 min。psbA-trnH 引 物PA：5'-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3' 和 TH： 5'-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3'。反應(yīng)條件為94℃，4 min；（94℃，50 s；58℃，50 s；72℃，50 s）40個(gè)循環(huán)；72℃，7 min。擴(kuò)增體系均為25 μL，DNA 模板2 μL，正反向引物各1 μL，MIX 8.5 μL，ddH2O 12.5 μL，擴(kuò)增產(chǎn)物置于4℃保存。在1.0%瓊脂凝膠中，每份DNA 樣本點(diǎn)樣5 μL，電源電壓設(shè)置為120 V，電泳時(shí)長30 min。將膠置于凝膠成像系統(tǒng)檢測，結(jié)果是ITS2 序列PCR 產(chǎn)物約在500 bp 處出現(xiàn)目的條帶，陰性對照無條帶。選取有條帶的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用CodonCode Aligner V 3.7.1 軟件，將正反兩個(gè)方向測序峰圖進(jìn)行校對拼接獲得完整序列。針對ITS2序列，需要去除引物區(qū)和低質(zhì)量區(qū)，對序列進(jìn)行注釋。去除5.8 S 和28 S 區(qū)段，獲得ITS2 間隔區(qū)序列；針對psbA-trnH 序列，校對拼接后去除引物區(qū)和低質(zhì)量區(qū)。然后將所有序列用MEGA7.0軟件進(jìn)行分析比對，以Kimura2-parameter（K2-P）為遺傳距離模型，計(jì)算并比較各序列種間、種內(nèi)遺傳距離，用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹，利用bootstrap（1 000次重復(fù)）檢驗(yàn)各個(gè)分支的支持率［16］。

2 結(jié)果與分析

2.1 上傳新型ITS2序列至NCBI數(shù)據(jù)庫

本研究中共向NCBI 數(shù)據(jù)庫中提交12 個(gè)物種共計(jì)40 條ITS2 序列，包括鉆天柳3 條；柳屬37 條，其中白皮柳（MT177150）、圓頭柳（MH924219，MT177162）、烏柳（MH924218）、筐柳（MT177181，MT177182）和 卷 邊 柳（MT177183，MT177184，MT177185，MT177186）共計(jì)10 條ITS2 序列為首次提交至NCBI 數(shù)據(jù)庫。具體40 條ITS2 序列信息見表3。

表3 上傳至GenBank的柳屬、鉆天柳ITS2序列注冊編號Table 3 The numbers of ITS2 sequences date of Salix，Chosenia arbutifolia uploaded to GenBank

2.2 柳屬與鉆天柳、山楊的種間遺傳距離分析

針對能夠準(zhǔn)確鑒定的5個(gè)物種進(jìn)行種間、種內(nèi)遺傳距離分析?？鹆N內(nèi)遺傳距離為0；與其它4種的種間遺傳距離最小為0.009 3，與其它4 種的種間遺傳距離最大為0.090 1。鉆天柳種內(nèi)遺傳距離為0；與其它4種的種間遺傳距離最小為0.009 3，與其它4 種的種間遺傳距離最大為0.084 4。粉枝柳種內(nèi)最大遺傳距離為0.004 6，其種內(nèi)平均遺傳距離為0.001 0；與其它4 種的種間遺傳距離最小為0.009 3，與其它4 種的種間遺傳距離最大為0.089 8。五蕊柳種內(nèi)遺傳距離為0；與其它4 種的種間遺傳距離最小為0.014 1，與其它4 種的種間遺傳距離最大為0.095 6。山楊種內(nèi)遺傳距離為0，與其它4 個(gè)種的種間遺傳距離最小為0.084 4，最大為0.095 6。由于以上5 個(gè)物種種內(nèi)最大遺傳距離數(shù)值小于與其他物種種間最小遺傳距離數(shù)值，故用ITS2 序列能夠?qū)鹆@天柳、粉枝柳、五蕊柳、山楊進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定（見表4）。

表4 柳屬、鉆天柳及山楊種內(nèi)及種間遺傳距離Table 4 The interspecific genetic distance and genetic distance between Salix，C.arbutifolia and P.davidiana

2.3 基于ITS2 序列的柳屬、鉆天柳和山楊NJ 樹鑒別

基于各物種ITS2 序列構(gòu)建Neighbor-Joining（NJ）樹（見圖1）：五蕊柳能聚為一支，支持率為67%；粉枝柳能聚為一支，支持率為63%；筐柳能聚為一支，支持率為66%；蒿柳能聚為一支，支持率為64%；以上4種柳屬可明顯的與其他物種互相區(qū)分開。而卷邊柳同屬蒿柳組，不能自聚為一支，僅能鑒定到蒿柳組級別，支持率為62%；旱柳、朝鮮柳、白皮柳、圓頭柳同屬柳組，同樣不能各自聚為一支，僅能鑒定到組級別，支持率為90%。另外鉆天柳能聚為一支，支持率在64%，與柳屬中五蕊柳、粉枝柳遺傳距離較近。因此基于ITS2 序列的DNA 條形碼鑒定方法能將五蕊柳、粉枝柳、筐柳、蒿柳與其他物種區(qū)分開，柳組物種僅可鑒定到組級別。

2.4 基于psbA-trnH 序列的柳屬系統(tǒng)發(fā)育樹鑒別

對從40 份DNA 樣本進(jìn)行psbA-trnH 序列的擴(kuò)增，有35 份樣本擴(kuò)增成功，擴(kuò)增成功率為87.5%。采用MEGA7.0 軟件NJ 法，對擴(kuò)增成功的35 份樣本psbA-trnH 序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，得到系統(tǒng)聚類（見圖2），在以psbA-trnH 基因片段序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹中，不同物種不能各自獨(dú)立聚為一支。

3 討論

柳屬植物具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。廣泛應(yīng)用于園林綠化、制作手工藝品、防風(fēng)固沙等方面。在形態(tài)學(xué)上，由于柳屬植物雌雄異株、先花后葉、分布范圍廣、對環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)、不同種之間受人為或自然雜交因素的影響，都使得柳屬植物在物種鑒定上存在難度。因此，柳屬植物的形態(tài)學(xué)鑒定及分子鑒定一直是廣大科研工作者專注研究的課題。

本研究以柳屬和鉆天柳、山楊為研究對象。探索葉綠體基因（psbA序列）和核基因（ITS2序列）在柳屬植物鑒定方面的應(yīng)用。在擴(kuò)增效率方面，ITS2 的擴(kuò)增效率為100%，而psbA-trnH 的擴(kuò)增效率為87.5%。在物種鑒定方面，ITS2序列可將五蕊柳、粉枝柳、筐柳、蒿柳與其他物種區(qū)分開，柳組物種可鑒定到組級別。同時(shí)，由于信息位點(diǎn)少，兩大群內(nèi)部形成許多小的分支后驗(yàn)概率偏低，內(nèi)部的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系仍沒有得到解決。ITS2 序列系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，鉆天柳（鉆天柳屬）與柳屬植物的親緣關(guān)系極為接近，本研究結(jié)果可作為把鉆天柳歸為柳屬的分子學(xué)依據(jù)。在由psbA-trnH 序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹中，柳屬各物種的聚類較為混亂。這是由于柳屬不同組的各物種，它們擁有相同的葉綠體單倍型，此現(xiàn)象可能與柳屬的特殊種群進(jìn)化方式有關(guān)，例如雜交和選擇性捕獲［17］。該差異造成了核基因片段（ITS2）和葉綠體片段（psbA-trnH）對物種鑒定效果的差異。趙奉彬［18］利用核基因組片段在楊屬的區(qū)分上具有較好效果，而葉綠體片段并不能得到很好結(jié)果。本研究得到相似結(jié)論即核基因片段在柳屬的區(qū)分上比葉綠體片的分辨率好，而葉綠體片段的柳屬分辨率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于核基因組片段。psbA-trnH 序列對柳屬植物的分子鑒定效果不理想，與之相比較ITS2 序列在柳屬植物分類鑒定上具有一定的優(yōu)勢。

對ITS2可準(zhǔn)確鑒定的物種旱柳、朝鮮柳、圓頭柳、粉枝柳結(jié)合地理分布信息進(jìn)行分析。研究發(fā)現(xiàn)，旱柳、朝鮮柳、圓頭柳均采自于伊春、哈爾濱、大慶，這三地地理緯度接近，而粉枝柳采自伊春和塔河且兩地的地理緯度相差近5 個(gè)緯度；在ITS2系統(tǒng)發(fā)育樹中也有所體現(xiàn)，采自伊春的粉枝柳樣本聚為一支，采自塔河的樣本獨(dú)立于伊春樣本聚為另一支。結(jié)果表明不同地理居群在種內(nèi)進(jìn)化存在地域性，但由于樣本數(shù)較少影響了鑒定的準(zhǔn)確性，在后期研究中可擴(kuò)大取樣范圍和取樣數(shù)量。

通過對收集到的各物種樣本形態(tài)學(xué)觀察，同時(shí)結(jié)合ITS2序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹。柳組各物種葉片的形態(tài)基本一致，這與ITS2 序列僅能鑒定到柳組級別的結(jié)果相一致。其它可運(yùn)用ITS2準(zhǔn)確鑒定的物種，其葉片性狀與其他物種均存在差異。這表明，對葉片的形態(tài)學(xué)鑒定和運(yùn)用ITS2 序列鑒定結(jié)果基本一致。本研究證明基于ITS2 序列的DNA 條形碼技術(shù)對楊柳科的鑒定有效，建議楊柳科的分子學(xué)鑒定方法可采用以核基因組片段（ITS或ITS2）單獨(dú)或組合形式的DNA條形碼鑒定。