劉 偉，朱季軍，王 艷，劉云云，王玉欣，王曉松，王曉燕

江蘇省宿遷市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科，宿遷 223800

胃癌(gastric cancer，GC)是全世界最為常見的惡性腫瘤之一，居癌癥相關(guān)死亡率的第2位，其5年生存率總體不到30%[1-2]。近年來，隨著飲食習(xí)慣的逐步改善和醫(yī)療技術(shù)的穩(wěn)步提高，我國的胃癌發(fā)病率已有所減少，但其晚期預(yù)后不良的現(xiàn)象并未得到顯著改善。因此，亟須找到用于早期診斷和治療GC的靶點[3]。E74樣受體4(E74-like factor 4，ELF4)是轉(zhuǎn)錄因子ETS(E23 transformation specific)家族的成員之一，可參與到免疫反應(yīng)、成骨、成脂、以及癌癥發(fā)生的過程，然而目前對于ELF4在胃癌發(fā)展中的相關(guān)作用及分子機制仍然不明確[4-5]。本文旨在探討ELF4對人胃癌細胞的增殖和侵襲能力的影響，以揭示ELF4在胃癌發(fā)展中可能的調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人正常胃黏膜上皮細胞GES-1，人胃癌細胞NCI-N87、BGC823、MKN45、AGS細胞系購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)。DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清(FBS)購自美國Invitrogen公司，Lipofectamine-3000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Thermo Fisher公司。ELF4沉默表達質(zhì)粒shELF4、空白對照質(zhì)粒shNC由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。Western blot檢測相關(guān)試劑購自上海碧云天公司，ELF4、Cyclin D1、MMP7、β-catenin抗體均購自美國BD公司。

1.2 實驗分組

在濕潤狀態(tài)下37℃和5% CO2，將MKN45細胞置于含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM完全培養(yǎng)液進行常規(guī)培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)液微黃或變黃時將其重新消化、離心，并更換細胞培養(yǎng)液。本實驗分為4組：shNC，shELF4，shELF4+PBS以及shELF4+LiCl。收集處于活性狀態(tài)的細胞，將其消化、離心后接種于6孔板中，置于細胞孵育箱接著培養(yǎng)，達到70%～80%的細胞密度后用Lipofectamine-3000轉(zhuǎn)染試劑進行細胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染shELF4質(zhì)粒和空質(zhì)粒shNC，每孔5 μg質(zhì)粒，shELF4質(zhì)粒組加入終濃度為20 mmol/L且溶于去離子水的Wnt通路激動劑LiCl(shELF4+LiCl)或等體積溶劑PBS(shELF4+PBS)。培養(yǎng)2 d后，再收集細胞進行后續(xù)實驗。

1.3 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測

根據(jù)使用手冊說明，采用TransZol RNA試劑盒提取各細胞系的總RNA。先將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再運用qRT-PCR技術(shù)檢測所研究的基因表達。ELF4上游引物5′-CCTGATCTTTGA-GTTCGCAAGC-3′和下游引物5′-AGTCCCGAGTACAGATGCAGT-3′；β-catenin上游引物5′-A-AAGCGGCTGTTAGTCACTGG-3′和下游引物5′-CGAGTCATTGCATACTGTCCAT-3′；Cyclin D1上游引物5′-GCTGCGAAGTGGAAACCATC-3′和下游引物5′-CCTCCTTCTGCACACATTTGAA-3′；MMP7上游引物5′-GAGTGAGCTACAGTGGGAACA-3′和下游引物5′-CTATGACGCGGGAGTTTAACAT-3′。反應(yīng)條件為：95℃下預(yù)變性5 min，95℃下變性30 s，60℃反應(yīng)20 s，72℃反應(yīng)30 s；總計40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參分析實時熒光的相對表達進而比較PCR擴增的程度。

1.4 細胞增殖能力檢測

CCK-8實驗用于檢測細胞增殖，將每組細胞按每孔200 μL的體積上樣，以2×103個/孔的標準種植，培養(yǎng)0、24、48、72 h后，將20 μL CCK-8加至每個孔中，用酶標儀(Bio-Rad，USA)于450 nm波長下測定實驗組與對照組的吸光度(A)值，繪制細胞增殖曲線，縱坐標為吸光度，橫坐標為時間。

1.5 細胞侵襲能力測定

Transwell小室用于侵襲實驗，其上室中無血清DMEM與基質(zhì)膠(購于美國Becton Dickinson公司)以1∶5的比例加入并混勻。待基質(zhì)膠凝固，分別收集好實驗組和對照組細胞，接著進行消化、離心和計數(shù)操作。將細胞(3 × 104細胞/孔)接種于上室，下室加入15% DMEM培養(yǎng)液，然后置于孵育箱中培養(yǎng)。24 h后，小室取出，采用0.2%結(jié)晶紫溶液染色，200倍顯微鏡下計算穿膜細胞數(shù)，重復(fù)3次取平均值，計數(shù)并評估細胞的侵襲率。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測

轉(zhuǎn)染24 h后，從細胞中提取全部蛋白質(zhì)，其蛋白濃度經(jīng)BCA試劑盒定量檢測。將蛋白樣品上樣，經(jīng)十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，再轉(zhuǎn)至PVDF膜上。在室溫下用5%的脫脂奶粉將其封閉2 h，再分別加入抗體，孵育1～2 h；顯色劑顯色后對蛋白條帶進行吸光度檢測。以GAPDH為內(nèi)參測定蛋白相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 ELF4在多種人胃癌細胞系中高表達

實時熒光定量PCR結(jié)果(圖1A)表明，人胃癌細胞株NCI-N87、BGC823、AGS和MKN45中ELF4 mRNA水平均顯著高于人正常胃黏膜上皮細胞GES-1；Western blot檢測結(jié)果(圖1B)表明，與GES-1細胞相比，上述4種胃癌細胞中ELF4蛋白表達水平均較高。

上述結(jié)果表明，ELF4在4種人胃癌細胞中的表達水平顯著提高，尤其是在MKN45細胞中。因此，后續(xù)實驗選取MKN45細胞進行研究。

A：ELF4 mRNA水平；B：ELF4蛋白水平;1：GES-1,2：NCI-N87,3：BGC823,4：AGS,5：MKN45;與GES-1比較，**P<0.01圖1 人正常胃黏膜上皮細胞和胃癌細胞系中ELF4表達Fig.1 ELF4 expression in normal human gastric mucosa epithelial cells and in gastric carcinoma cell lines

2.2 ELF4基因敲降能夠抑制MKN45細胞增殖

為進一步驗證ELF4基因能否作為功能性癌基因參與胃癌的進程，本研究進一步對MKN45細胞中的ELF4基因進行敲降。轉(zhuǎn)染48 h后，shELF4組的ELF4 mRNA及蛋白相對表達量顯著低于對照組shNC(P<0.01，圖2A、2B)，提示轉(zhuǎn)染成功，可行后續(xù)實驗。

A：ELF4 mRNA水平；B：ELF4蛋白水平；與shNC組比較，**P<0.01圖2 ELF4的敲降效率驗證Fig.2 Verification of ELF4 knockdown efficiency

2.3 ELF4基因敲降能夠抑制MKN45細胞侵襲

CCK-8檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后0 h，shELF4組和shNC組細胞增殖活力無明顯差異；但轉(zhuǎn)染24、48及72 h后，shELF4組細胞增殖活力則顯著低于shNC組，見圖3A。因此，ELF4基因的敲降能夠抑制MKN45細胞增殖。

Transwell實驗顯示，200倍視野下shELF4組侵襲細胞數(shù)顯著少于shNC組侵襲細胞數(shù)。定量分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，shELF4組侵襲細胞數(shù)量顯著低于shNC組侵襲細胞數(shù)量(圖3B)。因此，ELF4沉默能夠抑制MKN45細胞侵襲。

A：細胞增殖曲線；B：細胞侵襲圖及定量；與shNC組比較，**P<0.01圖3 ELF4敲降對MKN45細胞增殖和侵襲的影響Fig.3 Effect of ELF knockdown on proliferation and invasion of MKN45 cells

2.4 ELF4基因敲降抑制胃癌細胞增殖和侵襲的機制

運用實時熒光定量PCR以及蛋白質(zhì)印跡法檢測實驗組和對照組細胞中的β-catenin、Cyclin D1、MMP7的mRNA及蛋白表達水平。圖4A～4C顯示，ELF4基因敲降后，β-catenin、Cyclin D1、MMP7的mRNA及蛋白表達顯著低于對照組shNC。接著，蛋白質(zhì)印跡法檢測不同組別細胞核和細胞質(zhì)中的β-catenin表達變化。圖4D顯示，ELF4基因敲降后，β-catenin的核異位減少。因此，ELF4可能通過調(diào)控Wnt通路影響胃癌細胞的生物功能。

與添加PBS相比，加入LiCl能夠顯著增加因ELF4基因敲降而受到抑制的β-catenin，Cyclin D1，MMP7 mRNA及蛋白表達，見圖5A和5B。當(dāng)在shELF4沉默細胞中引入Wnt通路激動劑LiCl處理后，與加入PBS的對照組相比，ELF4敲降抑制細胞增殖活力及侵襲的作用被逆轉(zhuǎn)(圖6A和6B)。

A：β-catenin、Cyclin D1、MMP7 mRNA水平；B：β-catenin、Cyclin D1、MMP7蛋白水平；與shNC組比較，**P<0.01；與shELF4+PBS組比較，##P<0.01圖5 LiCl對ELF4敲降抑制的MKN45細胞Wnt/β-catenin通路的影響Fig.5 Effect of LiCl on Wnt/β-catenin pathway inhibited by ELF4 knockdown in MKN45 cells

A：細胞增殖曲線；B：細胞侵襲圖及定量；與shNC組比較，**P<0.01；與shELF4+PBS組比較，##P<0.01圖6 LiCl處理對ELF4敲降抑制的MKN45細胞增殖和侵襲的影響Fig.6 Effect of LiC1 treatment on MKN45 cell proliferation and invasion inhibited by ELF4 knockdown

3 討論

胃癌是臨床中最為常見的消化系統(tǒng)腫瘤之一，其在全球范圍內(nèi)具有高發(fā)病率和高死亡率的特征，對人類健康威脅巨大[6-7]。然而，因地域、經(jīng)濟及醫(yī)療水平上的差異，大多數(shù)胃癌患者無法進行有效的早期診斷，其治療手段也有限[8]。因此，如何測定胃癌發(fā)展的標志因子，并研究其潛在的作用機制，對胃癌臨床治療和靶點研究極為重要。

轉(zhuǎn)錄因子ETS家族最早發(fā)現(xiàn)于鳥白血病病毒，其家族中的每一個成員大約含有85個氨基酸的DNA結(jié)合域，以此用來調(diào)控靶基因的表達，ETS基因能夠編碼各種轉(zhuǎn)錄因子，進而調(diào)控細胞的增殖、分化、穩(wěn)態(tài)及凋亡[9]。ELF4是由原癌基因v-ets編碼的ETS家族成員，能夠參與多種生物學(xué)過程，可以作為癌基因通過插入逆轉(zhuǎn)錄病毒，進而誘發(fā)癌癥[10]。研究表明ELF4是miR-124的靶標，并促進神經(jīng)母細胞瘤增殖和未分化狀態(tài)[11]。ELF4在多種癌癥中呈現(xiàn)高表達且起抑癌作用，然而ELF4在胃癌中的作用尚未完全明確[12]。在本研究中，ELF4在人胃癌細胞中的表達明顯高于人正常胃黏膜細胞，這與以往報道的ELF4在腫瘤組織中高表達的情況一致。本研究進一步發(fā)現(xiàn)，敲低ELF4基因表達，實驗組MKN45細胞增殖能力以及侵襲能力顯著低于對照組，因此，ELF4具有促進胃癌細胞增殖及侵襲的作用。

我們進一步驗證ELF4調(diào)控胃癌細胞系MKN45增殖和侵襲的分子機制。目前已知包括胃癌在內(nèi)的十幾種高發(fā)性惡性腫瘤與Wnt/β-catenin信號通路的轉(zhuǎn)錄活性失調(diào)密切相關(guān)[13-14]。作為一個多功能蛋白，β-catenin異?；罨罂纱龠M腫瘤發(fā)生[15]；Cyclin D1是調(diào)控細胞周期G1期的關(guān)鍵蛋白，其過度表達可致細胞增殖失控而惡性化[16]；活化的MMPs是惡性腫瘤細胞獲取侵襲和遷移能力的一個非常重要的標志[17]。在本研究中，抑制ELF4后，實驗組細胞β-catenin、Cyclin D1和MMP7的表達水平顯著降低，并且β-catenin的核異位也減少。加入LiCl處理胃癌細胞后，shELF4+LiCl組能夠顯著抵消沉默ELF4引起的β-catenin，Cyclin，D1，MMP7 mRNA及蛋白表達的降低。用Wnt通路激動劑LiCl處理胃癌細胞后，敲降ELF4基因?qū)毎鲋臣扒忠u的抑制作用被顯著逆轉(zhuǎn)。因此，上述結(jié)果表明，ELF4可能通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin通路，進而實現(xiàn)對胃癌細胞增殖和侵襲的正向調(diào)節(jié)作用。