張 健 ，王佚兮，馮慧敏，王陳星，唐 議

（1.上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院，上海 201306；2.上海海洋大學(xué)大洋漁業(yè)資源可持續(xù)開發(fā)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/上海海洋大學(xué)國家遠(yuǎn)洋漁業(yè)工程技術(shù)研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部大洋漁業(yè)開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306；3.上海海洋大學(xué)海洋文化與法律學(xué)院，上海 201306）

海蜇 (Rhopilema esculentum) 隸屬于腔腸動(dòng)物門、缽水母綱、根口水母目、根口水母科、海蜇屬[1]，是近岸營浮游生活的暖水性大型水母，主要由水和蛋白質(zhì)組成，具有很高的食用價(jià)值[2]、醫(yī)藥價(jià)值[3]和美容價(jià)值[4]。我國海蜇野生資源豐富，是重要的海洋捕撈產(chǎn)品之一，為了滿足國內(nèi)外市場需求，漁民長期過度捕撈使得其野生資源急劇減少，而海蜇養(yǎng)殖業(yè)成為彌補(bǔ)其自然產(chǎn)量的一種必然手段。海蜇生長速度快、養(yǎng)殖周期短、成本低，能夠帶來很高的商業(yè)利益，因此，海蜇人工養(yǎng)殖技術(shù)逐漸成為水產(chǎn)養(yǎng)殖的新興產(chǎn)業(yè)[5]。在海蜇養(yǎng)成階段主要以通過施肥培養(yǎng)的浮游生物作為餌料[6-7]，但隨著海蜇的生長，池塘內(nèi)的浮游生物越來越難以滿足其對(duì)餌料的需求。缺乏適合海蜇生長的人工餌料已成為制約其養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的一個(gè)重要因素。因此，研究養(yǎng)殖海蜇的食性特征對(duì)研制人工餌料有重要意義；此外，在可控水域條件下研究海蜇食性，對(duì)今后開展我國近海海蜇資源及種群的生態(tài)研究具有參考價(jià)值。

傳統(tǒng)的食性研究方法如胃含物分析法，只能獲得近期攝入的食物信息，無法得知被吸收的食物類型[8-9]。20 世紀(jì)70 年代以來，生物化學(xué)示蹤技術(shù)被廣泛應(yīng)用于營養(yǎng)生態(tài)學(xué)研究。生物對(duì)脂肪酸的合成及改造能力具有差異性，特定的脂肪酸只能被特定的生物合成，且脂肪酸在食物網(wǎng)的傳遞過程中具有保守性，因此脂肪酸標(biāo)記法可以用來指示消費(fèi)者的食物來源并判定生物間的攝食關(guān)系[10]。在生態(tài)系統(tǒng)中，碳、氮同位素可通過食物鏈在生物體內(nèi)穩(wěn)定富集，通過生物體內(nèi)的穩(wěn)定同位素比值和與其食物相應(yīng)同位素比值的對(duì)比可以有效地揭示較長時(shí)間尺度上消費(fèi)者的食物來源及組成[11]。目前對(duì)人工養(yǎng)殖海蜇的研究大多集中在生態(tài)養(yǎng)殖技術(shù)[6,12-13]、生長發(fā)育[14-15]、人工育苗[16-17]等方面，對(duì)其食性方面的研究甚少，因此，本研究運(yùn)用脂肪酸生物標(biāo)記法和穩(wěn)定同位素技術(shù)探究養(yǎng)殖成體海蜇的食性，分析其主要攝食來源，為人工飼料的研制提供參考，并為改善養(yǎng)殖海蜇種質(zhì)退化的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與前處理

養(yǎng)殖海蜇于2018 年10 月24 日隨機(jī)取自江蘇通州灣養(yǎng)殖水域，共取樣32 只，均為成熟海蜇(無人工餌料喂養(yǎng))。海蜇捕獲后，置于過濾海水(用0.45 μm 濾膜過濾的表層海水) 中暫養(yǎng)2 h，排空消化道[18]，測定其傘徑 (mm) 和體質(zhì)量 (g) 等基礎(chǔ)生物學(xué)信息，經(jīng)超離子水潤洗后用干冰冷藏迅速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，?80 ℃保存。將冰凍狀態(tài)的樣本放入冷凍干燥機(jī) (Christ Alpha 1-4) ?54 ℃干燥48 h，用混合磨球儀磨成粉末，裝入干燥離心管保存于干燥箱中以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 脂肪酸測定

采用改進(jìn)的Folch 方法提取海蜇中的脂肪酸[19]。取0.2 g 樣品粉末于50 mL 離心管中，加入15 mL 三氯甲烷-甲醇溶液 (2∶1) 浸泡20 h 以上，離心后取上清液于帶塞試管中，加入10 mL 三氯甲烷-甲醇混合溶液沖洗試管內(nèi)的殘?jiān)?，再次離心取上清液，將兩次離心收集的上清液合并，加入4 mL 0.9%的氯化鈉溶液，靜置約2 h。吸取下層溶液置于圓底燒瓶中使用水浴進(jìn)行蒸餾，得到粗脂肪樣品[20]。繼續(xù)向圓底燒瓶中加入4 mL 氫氧化鉀-甲醇溶液 (0.5 mol·L?1)，混合后連接水浴回流裝置(100 ℃)，水浴加熱5～10 min，加入4 mL 三氟化硼-甲醇溶液煮沸25～30 min，最后加入4 mL 正己烷回流萃取2 min。待圓底燒瓶中溶液冷卻后加入10～15 mL 氯化鈉飽和溶液，搖晃均勻后將溶液倒入試管中靜置1～2 h 分層。使用注射器吸取一定量的正己烷層 (即上層) 溶液進(jìn)行測量。用美國Agilent 公司的5977A 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀[21]進(jìn)行色譜分析。氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀的條件控制為：色譜柱HP-88；初始溫度125 ℃維持0 min，以8 ℃·min?1的速度升至145 ℃，維持26 min，再以2 ℃·min?1的速度升至220 ℃，維持1 min，最后以1 ℃·min?1的速度升至227 ℃，維持1 min；分流比為10∶1。以37 種脂肪酸混標(biāo)及內(nèi)標(biāo)19 烷酸甲酯標(biāo)品作為標(biāo)準(zhǔn)[22]，通過比對(duì)保留時(shí)間對(duì)脂肪酸進(jìn)行定性分析，采用內(nèi)標(biāo)法對(duì)脂肪酸進(jìn)行定量分析。脂肪酸含量表示為單個(gè)脂肪酸占全部脂肪酸總量的百分比。

1.3 穩(wěn)定同位素測定

稱取2 mg 樣品粉末放入錫箔紙中包被，送入IsoPrime 100 穩(wěn)定同位素分析質(zhì)譜儀 (IsoPrime Corporation，英國) 和vario ISOTOPE cube 元素分析儀(Elementar Analysensysteme GmbH，德國) 進(jìn)行測定[23]。樣品的碳穩(wěn)定同位素 (δ13C) 組成和氮穩(wěn)定同位素 (δ15N) 組成表達(dá)：

其中X=δ13C 或δ15N，R=13C/12C 或15N/14N 的同位素比值。δ13C 標(biāo)準(zhǔn)為Vienna PDB (相當(dāng)于最初的PeeDee Belemnite 石灰?guī)r標(biāo)準(zhǔn))，δ15N 標(biāo)準(zhǔn)為大氣N2。

1.4 數(shù)據(jù)處理

脂肪酸與穩(wěn)定同位素?cái)?shù)據(jù)均重復(fù)測定3 次，以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 ()”表示，采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 基礎(chǔ)生物學(xué)

經(jīng)測定，樣本海蜇傘徑介于190～430 mm，平均傘徑為 (329±522) mm；體質(zhì)量介于620～5 500 g，平均體質(zhì)量為 (2 568±1 096) g。傘徑-體質(zhì)量關(guān)系采用冪函數(shù)表示為W=4.016×10?4×L2.6926(R2=0.95,n=32)。

2.2 海蜇脂肪酸組成

本研究共檢測出29 種脂肪酸 (表1)，起始碳鏈長度介于14 碳到24 碳。其中飽和脂肪酸 (Saturated fatty acid,SFA) 有10 種，總含量為 (232.05±13.23) %，主要為十六酸 (C16:0) 和十八酸 (C18:0)；單不飽和脂肪酸 (Monounsaturated fatty acids,MUFA) 共有8 種，總含量為 (42.33±4.49) %，主要為十八碳一烯酸 (C18:1 n-9c) 和二十四碳烯酸(C24:1 n-9)；多不飽和脂肪酸 (Polyunsaturated fatty acids,PUFA) 共有11 種，總含量為 (253.31±16.16) %，主要為二十碳五烯酸 (C20:5 n-3,Eicosapentanoic Acid,EPA)、二十二碳六烯酸 (C22:6 n-3,Docosahexaenoic,DHA) 和花生四烯酸 (C20:4 n-6)。n-3 系列脂肪酸含量明顯高于n-6 系列脂肪酸含量。ΣPUFA 和ΣSFA 顯著高于ΣMUFA 含量。

表1 海蜇的脂肪酸組成Table 1 Fatty acids compositions of R.esculentum

2.3 脂肪酸含量與傘徑的關(guān)系

用Pearson 檢驗(yàn)養(yǎng)殖海蜇脂肪酸含量與傘徑的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)29 種脂肪酸中僅二十一酸 (C21:0)與傘徑顯著相關(guān) (P<0.05,n=32)，脂肪酸含量隨著傘徑的增加呈逐漸下降趨勢。對(duì)于具有食性指示標(biāo)記的脂肪酸比值分析結(jié)果顯示，PUFA/SFA 和DHA/EPA 與海蜇傘徑之間均不存在相關(guān)性。

2.4 海蜇的碳、氮穩(wěn)定同位素組成

養(yǎng)殖海蜇不同傘徑的碳、氮穩(wěn)定同位素含量見表2，其中δ13C 的分布介于?23.54‰～?20.75‰，跨度為2.79‰，平均值為 (?22.26±0.66)‰；δ15N的分布介于8.39‰～9.85‰，跨度為1.46‰，平均值為 (9.02±0.29)‰；C/N 為3.37～3.94。

3 討論

海蜇生長極快，從碟狀幼體到傘徑400 mm 的成體水母僅需約3 個(gè)月[5]。李培軍等[24]對(duì)海蜇的生長研究表明，海蜇的生長呈一條S 型曲線，其生長到某一最大值后，曲線開始下降。本研究分析的養(yǎng)殖海蜇隨著傘徑的增長體質(zhì)量迅速增大，說明此階段的海蜇未到衰老期。對(duì)其脂肪酸和穩(wěn)定同位素進(jìn)行了以下討論。

3.1 脂肪酸組成

鄭斌[25]對(duì)不同發(fā)育階段的養(yǎng)殖海蜇 (營口市榮發(fā)參蜇有限公司) 脂肪酸組成進(jìn)行了分析，在成蜇(傘徑>15 cm) 中共檢測出28 種脂肪酸，含量較高的幾種脂肪酸分別是C16:0、C18:0、十八碳一烯酸 (C18:1)、花生三烯酸 (C20:3 n-3)、EPA、DHA。本研究海蜇含量較高的脂肪酸分別是C16:0、C18:0、EPA 和DHA，這與鄭斌[25]的研究結(jié)果較為接近。劉希光等[26]研究了黃海海域成熟海蜇不同部位 (海蜇皮、海蜇頭、海蜇生殖腺) 脂肪酸的組成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3 個(gè)部位的脂肪酸組成差別不大，且含量最高的脂肪酸均為DHA、C20:4 n-6、EPA，這與本研究結(jié)果稍有差異，推測可能是海蜇成長環(huán)境不同造成，本研究所用的是養(yǎng)殖海蜇，劉希光等[26]采用的是黃海海域自然成熟的海蜇。

3.2 特征脂肪酸分析

特征脂肪酸及其來源參照Alfaro[27]的研究結(jié)果。十八碳二烯酸和十八碳三烯酸 (C18:2 n-6+C18:3 n-3) 通常被看作陸地植物的標(biāo)志[28]，一般含量高于2.5%被認(rèn)為陸地植物貢獻(xiàn)顯著，本研究海蜇的C18:2 n-6+C18:3 n-3 含量為6.62%，表明陸地植物對(duì)其食物來源貢獻(xiàn)較大。EPA 可作為硅藻的特征脂肪酸[29-30]，本研究中養(yǎng)殖海蜇存在大量的EPA，說明硅藻是其重要的食物來源之一。十五酸和十七酸 (C15:0+C17:0) 可用來指示捕食者對(duì)浮游細(xì)菌的攝食[31-32]。在本研究中，C15:0+C17:0 的含量達(dá)到了2.91%，表明碎屑物質(zhì)是養(yǎng)殖海蜇的食物來源。這一結(jié)果與鄭斌[25]研究結(jié)果一致。二十碳一烯酸 (C20:1) 和二十二碳一烯酸 (C22:1)可以作為高營養(yǎng)級(jí)攝食植食性橈足類的標(biāo)志脂肪酸[33]。本研究C20:1+C22:1 的含量為5.75%，表明海蜇對(duì)植食性橈足類攝食較多[34-45]。C20:4 n-6 被看作底棲生物的標(biāo)志[36-39]，水母可通過對(duì)碎屑[28]及微型浮游動(dòng)物[40]的攝食在體內(nèi)累積。海蜇中C20:4 n-6 的含量為6.01%，表明底棲生物對(duì)其食物組成貢獻(xiàn)較大。PUFA/SFA 和DHA/EPA 可用來評(píng)估營養(yǎng)級(jí)的大小，比值越大營養(yǎng)級(jí)越高[41]。金鑫等[42]通過DHA/EPA 得出蝶水母 (Ocyropsis crystallina)、瓜水母 (Bero cucumis)、四葉小舌水母(Liriope tetraphylla) 和箭蟲 (Sagittaspp.) 在浮游食物網(wǎng)中的營養(yǎng)級(jí)高于中華哲水蚤 (Calanus sinicus)和磷蝦 (Euphausiaspp.)。本研究中PUFA/SFA 和DHA/EPA 與海蜇傘徑之間均不存在相關(guān)性，即養(yǎng)殖海蜇成熟后 (>200 mm)，其營養(yǎng)地位沒有發(fā)生明顯的變化。Fukuda 和Naganuma[43]認(rèn)為Σn-6/Σn-3可用來估算腐生食物鏈與捕食食物鏈對(duì)高營養(yǎng)級(jí)捕食者的貢獻(xiàn)比例。金鑫等[18]通過比較Σn-6/Σn-3 得出墨綠多管水母 (Aequorea coerulescens) 主要參與腐生食物鏈，本研究Σn-6/Σn-3 較低，說明腐生食物鏈對(duì)養(yǎng)殖海蜇?cái)z食貢獻(xiàn)較小。

表2 海蜇碳、氮穩(wěn)定同位素比值和碳、氮含量比值Table 2 Ratio of stable isotope and content of carbon and nitrogen in R.esculentum

3.3 碳氮穩(wěn)定同位素分析

在水生生態(tài)系統(tǒng)中，δ13C 適于判斷食物來源，而δ15N 用于確定生物體的營養(yǎng)級(jí)[44-45]。不同的初級(jí)生產(chǎn)者因生長代謝方式不同會(huì)導(dǎo)致碳氮穩(wěn)定同位素特征值有很大的差異，因此消費(fèi)者的碳氮穩(wěn)定同位素值可以反映其食物來源[46]。Boutton[47]認(rèn)為陸源C3 植物δ13C 介于?30‰～?23‰，δ15N 介于?5‰～18‰；陸源C4 植物δ13C 介于?17‰～?9‰，δ15N 介于3‰～6‰。河口區(qū)浮游植物δ13C 介于?30‰～?19‰，δ15N 介于6‰～9‰[48]。本研究海蜇δ13C 平均值為 (?22.26±0.66) ‰，介于陸源C3 植物和河口區(qū)浮游植物之間且更接近于陸源C3 植物，這可能是因?yàn)楹ｒ貙?duì)陸源C3 植物碎屑有較多的攝食。金鑫等[18]用δ15N 特征值判斷出蝶水母、瓜水母和四葉小舌水母在浮游食物網(wǎng)中處于較高營養(yǎng)級(jí)。本研究中δ15N 值差異不顯著，說明海蜇 (傘徑>200 mm) 食物來源基本趨于穩(wěn)定，這與孫明等[49]的研究結(jié)果一致。本研究海蜇δ13C 值、δ15N 值和C/N 與海蜇傘徑的相關(guān)性均不顯著 (P>0.05)，說明隨著海蜇個(gè)體的成長，其傘徑也逐漸增長，但海蜇在營養(yǎng)位置上并沒有明顯的變化。

4 結(jié)語

脂肪酸標(biāo)記法和穩(wěn)定同位素技術(shù)已廣泛應(yīng)用于海洋生物的食性研究，相比胃含物分析法更能反映出生物較長時(shí)間段內(nèi)的食性[50-51]。碳、氮穩(wěn)定同位素能夠指示有機(jī)物的來源，其結(jié)果反映的是捕食者在相當(dāng)長的一個(gè)生命階段中所攝取的食物，經(jīng)過新陳代謝消化吸收的結(jié)果。脂肪酸具有生物差異性、保守性和可保存性，可以被特定的生物合成，并通過攝食沿食物鏈向各級(jí)消費(fèi)者傳遞，保留在消費(fèi)者體內(nèi)，但值得注意的是，同一種特征脂肪酸可以指示幾個(gè)食物來源。因此將脂肪酸與穩(wěn)定同位素相結(jié)合，兩者相互補(bǔ)充，可以更準(zhǔn)確地反映生物的食性，后續(xù)也應(yīng)加入胃含物分析研究，3 種方法交叉驗(yàn)證，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加全面。此外，本研究只對(duì)養(yǎng)殖海蜇做了脂肪酸與同位素分析，未采集浮游生物樣本，后續(xù)應(yīng)對(duì)浮游生物樣本進(jìn)行同等分析，將研究結(jié)果與養(yǎng)殖海蜇進(jìn)行對(duì)比，以提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。