鄭 興 ，吝思琪 ，楊守國(guó) ，張興志，VASQUEZ Herbert Ely，顧志峰，王愛民

（1.海南大學(xué)海洋學(xué)院，海南 ?？?570228；2.海南大學(xué)/南海海洋資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?570228；3.海南省海洋與漁業(yè)科學(xué)院，海南 ?？?571126；4.廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院，廣西 南寧 530021）

微藻是地球上最早利用太陽(yáng)能進(jìn)行光合作用的生命體之一，是微觀的、低等單細(xì)胞水生生物，具有太陽(yáng)能利用效率高、適應(yīng)環(huán)境能力強(qiáng)等特點(diǎn)[1]。微藻含蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、維生素、不飽和脂肪酸和色素等多種高附加值的生物物質(zhì)[2-3]。其種類繁多，目前已知兩萬(wàn)多種。人類利用微藻已有幾百年歷史，主要集中在食用、活性物質(zhì)提取利用、生物能源提取利用、環(huán)境治理等方面[4-7]，微藻在海水養(yǎng)殖中一般用作水產(chǎn)動(dòng)物的開口餌料。熱帶普通小球藻 (Chlorella vulgaris) 屬于綠藻門、綠藻綱、綠球藻目、卵囊藻科、小球藻屬，是一類普生性的單細(xì)胞綠藻，含有蛋白質(zhì)、多糖、細(xì)胞色素、不飽和脂肪酸和生物生長(zhǎng)因子等多種豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，開發(fā)應(yīng)用前景十分廣闊[8-9]。小球藻在1950 年首次成功被人工培養(yǎng)后，一直是研究者和生產(chǎn)者關(guān)注的焦點(diǎn)，其形態(tài)、營(yíng)養(yǎng)特性、生產(chǎn)培養(yǎng)方式、加工及應(yīng)用等方面被廣泛研究[10]。

微藻的生長(zhǎng)過(guò)程可簡(jiǎn)單分為接種期、快速生長(zhǎng)期 (指數(shù)生長(zhǎng)期)、穩(wěn)定期和衰亡期。在水產(chǎn)養(yǎng)殖相關(guān)生產(chǎn)過(guò)程中一般使用快速生長(zhǎng)期階段的微藻作為餌料或加工原材料，從而保證其數(shù)量和質(zhì)量。微藻生長(zhǎng)過(guò)程的監(jiān)測(cè)一般使用血球計(jì)數(shù)板技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞數(shù)，但這對(duì)生產(chǎn)者有一定的技術(shù)要求，如需掌握血球計(jì)數(shù)板、顯微鏡等操作方法，因此在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中大部分養(yǎng)殖戶僅通過(guò)肉眼觀察藻液顏色變化來(lái)初步判斷微藻的生長(zhǎng)情況，但用人體感官判斷顏色變化會(huì)受到操作者主觀性的影響，存在隨意性，不同評(píng)判者由于個(gè)體視覺(jué)差異對(duì)同一顏色的特征區(qū)分會(huì)存在一定偏差，無(wú)法滿足現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)對(duì)精準(zhǔn)化的要求。因此有必要在利用顏色體系對(duì)微藻的生長(zhǎng)情況進(jìn)行定性描述的同時(shí)開展定量研究，尤其是量化顏色參數(shù)。

國(guó)內(nèi)外顏色的量化分析研究在眾多行業(yè)早已得到廣泛應(yīng)用，主要利用色差計(jì)開展。色差計(jì)是利用儀器內(nèi)部的標(biāo)準(zhǔn)光源照明被測(cè)物體，測(cè)定其CIEL*a*b*值。CIE1976 中L*、a*、b*推薦的表色系具有均勻的顏色空間，與人的視覺(jué)相一致，其中顏色指標(biāo)L*代表明度值；a*(?A～+A) 代表紅度值，表示從綠到紅的變化，其正值越大，綠色越淡，紅色愈濃；b*(?B～+B) 代表黃度值，表示從藍(lán)到黃的變化，其正值越大，黃色越濃[11-13]。目前尚未見顏色的量化分析在微藻養(yǎng)殖上的應(yīng)用，因此，本研究以色度學(xué)理論為前提，利用色差儀對(duì)熱帶普通小球藻生長(zhǎng)過(guò)程中的顏色動(dòng)態(tài)分析進(jìn)行色度學(xué)指標(biāo)量化測(cè)定，分析顏色參數(shù)與色素質(zhì)量濃度間的關(guān)系，以期為建立小球藻生長(zhǎng)狀況快速檢測(cè)技術(shù)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藻種及培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)所用熱帶普通小球藻取自海南大學(xué)海洋學(xué)院保種室。實(shí)驗(yàn)前將藻種進(jìn)行純化擴(kuò)培，取快速生長(zhǎng)期的藻液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)溫度維持在 (25±1) ℃，光照強(qiáng)度控制在5 000 lx，光周期為24 h 全光照。使用過(guò)濾并滅菌的自然海水及“寧波3#微藻培養(yǎng)液”在5 L 三角錐形瓶中進(jìn)行5 L 體積藻液的培養(yǎng)，用帶有2 μm 孔徑空氣過(guò)濾器的充氧泵進(jìn)行連續(xù)充氣，充氣量為20 L·min?1。藻細(xì)胞培養(yǎng)接種量為5×104個(gè)·mL?1。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)置5 個(gè)平行培養(yǎng)組，以接入藻種與培養(yǎng)介質(zhì)充分混合后為時(shí)間起點(diǎn)，每隔24 h 進(jìn)行取樣，取樣前將培養(yǎng)瓶中的藻液搖勻，取一定量樣品檢測(cè)藻類細(xì)胞數(shù)目、干質(zhì)量、色素質(zhì)量濃度、顏色，操作重復(fù)3 次。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 藻細(xì)胞數(shù)目的測(cè)定 采用血球計(jì)數(shù)板法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2 光合色素質(zhì)量濃度及比值測(cè)定 在弱光條件下用丙酮萃取法萃取樣品色素后，用三波長(zhǎng)比色法[14]在分光光度計(jì)島津UV-1 700 上進(jìn)行提取液的光吸收值檢測(cè)，計(jì)算葉綠素a(Chl-a)、葉綠素b(Chl-b)、總?cè)~綠素 (Chl) 和類胡蘿卜素 (Caro) 的質(zhì)量濃度，并計(jì)算類葉比 (Caro/Chl)。

1.3.3 顏色參數(shù)測(cè)定 采用CM-5 型號(hào)的全自動(dòng)分光測(cè)色儀 (Konica Minolta,日本) 測(cè)定藻液樣品的顏色參數(shù)，測(cè)定的色度學(xué)指標(biāo)主要包括L*、a*、b*、相角 (H°)、飽和度 (C) 和色差值 (ΔE)。以相同的無(wú)藻培養(yǎng)水體作為對(duì)照值，分別測(cè)得L*、a*和b*，并計(jì)算H°、C和ΔE。計(jì)算公式為H°=arctan (b*/a*)；C=(a*2+b*2)1/2；ΔE=(ΔL*2+Δa*2+b*2)1/2。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 熱帶普通小球藻的生長(zhǎng)過(guò)程及階段劃分

熱帶普通小球藻在養(yǎng)殖周期10 d 內(nèi)，細(xì)胞數(shù)整體趨勢(shì)為先緩慢增長(zhǎng)后快速增長(zhǎng)，隨后呈穩(wěn)定狀態(tài)，最后開始降低，可分為接種期、快速生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期和衰亡期 (圖1)。接種密度為 (6.13±1.01)×104個(gè)·mL?1，在養(yǎng)殖第1 天后進(jìn)入快速生長(zhǎng)期[(32.20±4.15)×104個(gè)·mL?1]，并在第4 天達(dá)到最高[(732.12±39.44)×104個(gè)·mL?1]，隨后進(jìn)入穩(wěn)定期 [第5 至第9 天，平均密度為 (664.12±18.73)×104個(gè)·mL?1]，在第10 天藻細(xì)胞數(shù)目出現(xiàn)顯著性下降，進(jìn)入衰亡期，呈快速降低趨勢(shì) (細(xì)胞數(shù)<600×104個(gè)·mL?1，P<0.05)。

圖1 熱帶普通小球藻生長(zhǎng)過(guò)程中細(xì)胞數(shù)變化及階段劃分不同小寫字母表示差異顯著 (P<0.05)；后圖同此Figure 1 Change of cell density and growth phase division of C.vulgaris in process of growthDifferent lowercase letters indicate significant difference (P<0.05).The same case in the following figures.

2.2 熱帶普通小球藻生長(zhǎng)過(guò)程中顏色特征值的動(dòng)態(tài)變化

2.2.1L*、a*、b*變化特征 熱帶普通小球藻在養(yǎng)殖周期10 d 內(nèi)，L*和a*隨生長(zhǎng)階段的推進(jìn)基本呈逐漸降低趨勢(shì)，而b*呈逐漸升高趨勢(shì) (圖2)。其中L*在養(yǎng)殖第3 天由103.04±0.01 顯著降至98.70±0.38 (P<0.05)，隨后逐步平緩下降；a*朝負(fù)值方向發(fā)展，在養(yǎng)殖第2 天由?0.51±0.01 顯著降至?2.08±0.06 (P<0.05)；b*在養(yǎng)殖第2 天由0.58±0.03 顯著升至7.40±0.21 (P<0.05)，隨后快速穩(wěn)定升高。

2.2.2H°、△E和C變化特征 熱帶普通小球藻在養(yǎng)殖周期10 d 內(nèi)，△E和C隨生長(zhǎng)階段的推進(jìn)基本呈穩(wěn)定上升趨勢(shì)，而H°則呈逐漸降低趨勢(shì)(圖3)。其中H°呈負(fù)值變化趨勢(shì)，在養(yǎng)殖第1 天由?0.84±0.02 顯著降至?1.23±0.02，隨后平穩(wěn)小幅度變化；△E在養(yǎng)殖第2 天由0.66±0.01 顯著升至7.14±0.22 (P<0.05)，然后隨著養(yǎng)殖時(shí)間而穩(wěn)健增長(zhǎng)；C的變化趨勢(shì)與△E相同，養(yǎng)殖第2 天由0.77±0.02 升至7.68±0.21 (P<0.05)，隨后穩(wěn)健增長(zhǎng)。

2.3 熱帶普通小球藻生長(zhǎng)過(guò)程中色素成分質(zhì)量濃度和Caro/Chl 的動(dòng)態(tài)變化

2.3.1 綠色素變化特征 在養(yǎng)殖周期10 d 內(nèi)，熱帶普通小球藻綠色素 (Chl-a、Chl-b和總?cè)~綠素) 質(zhì)量濃度變化整體呈先快速增長(zhǎng)后降低的趨勢(shì) (圖4)。養(yǎng)殖第1 天后綠色素質(zhì)量濃度開始快速增長(zhǎng)，養(yǎng)殖第5 天Chl-a、Chl-b和總?cè)~綠素質(zhì)量濃度分別顯著增加至 (0.57±0.05) mg·L?1、(0.24±0.04) mg·L?1和 (0.81±0.08) mg·L?1(P<0.05)；隨后緩慢增長(zhǎng)，并在養(yǎng)殖第9 天達(dá)最大值，Chl-a、Chl-b和總?cè)~綠素質(zhì)量濃度分別為 (1.03±0.12) mg·L?1、(0.36±0.07)mg·L?1和 (1.38±0.20) mg·L?1，隨后開始下降。

2.3.2 Caro 的動(dòng)態(tài)變化 在養(yǎng)殖周期10 d 內(nèi)，熱帶普通小球藻Caro 質(zhì)量濃度變化趨勢(shì)與綠色素相同，整體呈先快速增長(zhǎng)后降低的趨勢(shì) (圖5)。養(yǎng)殖第1 天后其質(zhì)量濃度開始快速增長(zhǎng)，在第5 天顯著增至 (0.52±0.05) mg·L?1(P<0.05)，并在第9 天達(dá)最大值(1.14±0.15) mg·L?1，隨后開始顯著快速降低 (P<0.05)。

圖2 熱帶普通小球藻生長(zhǎng)過(guò)程中明度值 (A)、紅度值 (B)和黃度值 (C) 的變化Figure 2 Change of lightness value (A),red value (B) and yellow value (C) of C.vulgaris in process of growth

圖3 熱帶普通小球藻生長(zhǎng)過(guò)程中相角 (A)、色差值 (B) 和飽和度 (C) 的變化Figure 3 Change of hue angle (A),color difference (B) and chroma (C) of C.vulgaris in process of growth

圖4 熱帶普通小球藻生長(zhǎng)過(guò)程中葉綠素a (A)、葉綠素b(B) 和總?cè)~綠素 (C) 質(zhì)量濃度的變化Figure 4 Change of Chl-a (A),Chl-b (B) and chlorophyll (C)mass concentrations of C.vulgaris in process of growth

圖5 熱帶普通小球藻生長(zhǎng)過(guò)程中類胡蘿卜素質(zhì)量濃度的變化Figure 5 Change of carotenoid mass concentration of C.vulgaris in process of growth

2.3.3 Caro/Chl 的動(dòng)態(tài)變化 在養(yǎng)殖周期10 d內(nèi)，隨生長(zhǎng)階段的推進(jìn)熱帶普通小球藻的Caro/Chl 呈不斷增大趨勢(shì) (圖6)。養(yǎng)殖第3 天顯著增至0.58±0.13 (P<0.05)，隨后基本穩(wěn)定在0.74～0.82，養(yǎng)殖第10 天升至1.10±0.14 (P<0.05)。

圖6 熱帶普通小球藻生長(zhǎng)過(guò)程中類葉比值的變化Figure 6 Change of ratio of carotenoid and chlorophyll of C.vulgaris in process of growth

2.4 熱帶普通小球藻生長(zhǎng)過(guò)程中細(xì)胞密度、色素參數(shù)與顏色特征值的相關(guān)分析

在養(yǎng)殖周期10 d 內(nèi)，熱帶普通小球藻的細(xì)胞密度、色素參數(shù)與L*、a*、H°均呈負(fù)相關(guān)，與b*、△E、C呈極顯著正相關(guān) (表1)。細(xì)胞密度與L*呈極顯著負(fù)相關(guān) (P<0.05)，與其他顏色參數(shù)特征值呈極顯著相關(guān) (P<0.01)；Caro/Chl 與H°呈極顯著負(fù)相關(guān) (P<0.01)，而其他色素成分 (Chl-a、Chlb、總?cè)~綠素、Caro) 質(zhì)量濃度與H°呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；色素成分質(zhì)量濃度均與L*和a*呈極顯著負(fù)相關(guān) (P<0.01)。熱帶普通小球藻生長(zhǎng)過(guò)程中，其色素成分質(zhì)量濃度和Caro/Chl與L*、a*、b*、△E、C的相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值介于0.91～0.98，而與H°的相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值介于0.64～0.77。L*、a*、b*、△E、C與色素成分質(zhì)量濃度、Caro/Chl 之間的相關(guān)性相對(duì)更高、更密切。

表1 熱帶普通小球藻生長(zhǎng)過(guò)程中顏色參數(shù)與細(xì)胞密度、色素參數(shù)質(zhì)量濃度的簡(jiǎn)單相關(guān)分析Table 1 Simple correlation analysis among color parameters and cell density,pigment contents of C.vulgaris in process of growth

2.5 熱帶普通小球藻生長(zhǎng)過(guò)程中細(xì)胞密度、色素參數(shù)與顏色特征值的線性回歸分析

在養(yǎng)殖周期10 d 內(nèi)，熱帶普通小球藻L*、a*、b*、△E與細(xì)胞密度、綠色素、Caro、總色素質(zhì)量濃度均具有顯著線性相關(guān)關(guān)系 (P<0.05，表2)。其中Xa的回歸系數(shù)絕對(duì)值最大；不同變量中的決定系數(shù)均大于0.90 (R2>0.90)，代表回歸方程擬合度較高，其中Caro 最高 (R2=0.973 1)，其次為細(xì)胞密度值 (R2=0.971 6)，而Chl-a最小 (R2=0.914 0)。

表2 熱帶普通小球藻生長(zhǎng)過(guò)程中細(xì)胞密度、色素參數(shù)質(zhì)量濃度與顏色參數(shù)的回歸分析Table 2 Analysis of regression among cell density,pigment contents and color parameters of C.vulgaris in process of growth

3 討論

微藻的培養(yǎng)按規(guī)?？煞譃橐患?jí)保種培養(yǎng)、二級(jí)中等擴(kuò)培和三級(jí)大規(guī)模培養(yǎng)；按培養(yǎng)系統(tǒng)可分為開放式培養(yǎng)系統(tǒng) (開發(fā)最早、應(yīng)用最為普遍)、半封閉式培養(yǎng)系統(tǒng)、封閉式培養(yǎng)系統(tǒng) (較為現(xiàn)代化)。其中封閉式培養(yǎng)系統(tǒng)包含管道式生物反應(yīng)器、機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器、平板式光生物反應(yīng)器、鼓泡式光生物反應(yīng)器、氣升式光生物反應(yīng)器、浮式薄膜袋光生物反應(yīng)器等多種形式，具有能夠有效控制培養(yǎng)條件、控制污染、實(shí)現(xiàn)純種培養(yǎng)、營(yíng)養(yǎng)鹽損失小等特點(diǎn)[1]。本研究所采用的培養(yǎng)方式是建立在二級(jí)中等擴(kuò)培基礎(chǔ)上的鼓泡式，嚴(yán)格控制接種量、營(yíng)養(yǎng)鹽水平和光照強(qiáng)度，因此研究結(jié)果可為后期熱帶普通小球藻的規(guī)?；囵B(yǎng)提供可靠基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。微藻的培養(yǎng)生長(zhǎng)周期可簡(jiǎn)單概括為接種期、快速生長(zhǎng)期 (指數(shù)生長(zhǎng)期)、穩(wěn)定期和衰亡期，本研究條件下熱帶普通小球藻在養(yǎng)殖周期10 d 內(nèi)符合該生長(zhǎng)規(guī)律，在養(yǎng)殖第2 天便進(jìn)入快速生長(zhǎng)期，在第4 天接近最大生長(zhǎng)值，是連續(xù)培養(yǎng)中作為生物餌料使用時(shí)的最佳采收時(shí)期，這與丁麗歡等[8]、葸玉琴等[15]的研究結(jié)果較為一致。

感官技術(shù)是把人作為精密測(cè)量?jī)x器對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行感官檢驗(yàn)的科學(xué)方法，如將視覺(jué)、觸覺(jué)、嗅覺(jué)、味覺(jué)和聽覺(jué)用于產(chǎn)品的測(cè)量和分析[16]，但這種技術(shù)主觀隨意性大，會(huì)受到技術(shù)人員的認(rèn)識(shí)程度等諸多因素的影響，從而難以滿足精準(zhǔn)化生產(chǎn)操作的要求[12]。微藻養(yǎng)殖過(guò)程中顏色的變化是其生理變化的宏觀體現(xiàn)，也是確定采收及使用時(shí)間的主要外觀指標(biāo)之一。本研究在色度學(xué)理論基礎(chǔ)上，利用色差儀對(duì)熱帶普通小球藻生長(zhǎng)過(guò)程中的顏色變化進(jìn)行指標(biāo)量化測(cè)定，并分析了顏色變化與藻細(xì)胞濃度、色素質(zhì)量濃度的相關(guān)關(guān)系，可提高養(yǎng)殖監(jiān)測(cè)的科學(xué)性和準(zhǔn)確性。本研究表明，在熱帶普通小球藻生長(zhǎng)過(guò)程中，養(yǎng)殖水體顏色變化與藻類細(xì)胞密度和色素質(zhì)量濃度變化規(guī)律具有較強(qiáng)的相關(guān)性 (相關(guān)系數(shù)在0.95 以上)，具有規(guī)律性，因此可以通過(guò)測(cè)定顏色參數(shù)值來(lái)判定熱帶普通小球藻密度及色素質(zhì)量，具有快速、準(zhǔn)確、科學(xué)的特點(diǎn)。這與孟凡娟等[17]、Timothy 等[18]對(duì)番茄 (Solanum lycopersicum)、蔡鴻昌等[19]對(duì)黃瓜 (Cucumis sativusL.) 初花期葉片，以及于國(guó)鋒等[20]對(duì)煙葉顏色的研究結(jié)果相似，因此顏色變化可應(yīng)用于生物量與質(zhì)的快速評(píng)價(jià)。

植物的顏色是其最顯著的表觀性狀，取決于其所含色素種類、含量及相對(duì)含量，而色素的相對(duì)含量與種類、生長(zhǎng)狀態(tài)、生長(zhǎng)條件等密切相關(guān)。色素是植物光合作用的基礎(chǔ)，其濃度高低可反映植物功能的強(qiáng)弱[21-22]。熱帶普通小球藻生長(zhǎng)過(guò)程中，綠色素 (Chl-a、Chl-b、總?cè)~綠素) 和Caro 在快速生長(zhǎng)期呈線性增長(zhǎng)趨勢(shì)，這與b*和△E變化趨勢(shì)相似，因此可將b*和△E作為熱帶普通小球藻生長(zhǎng)進(jìn)程和色素質(zhì)量的判斷指標(biāo)。此外，本研究通過(guò)建立線性回歸方程，把熱帶普通小球藻生長(zhǎng)過(guò)程中細(xì)胞密度、色素總含量與顏色參數(shù)值聯(lián)系起來(lái)，從而通過(guò)無(wú)損失、無(wú)損傷的顏色參數(shù)值的變化來(lái)反映熱帶普通小球藻的生長(zhǎng)情況和質(zhì)量，達(dá)到了無(wú)接觸性判斷的目的，在一定程度上保障其不會(huì)因取樣、檢測(cè)等操作而被污染。在熱帶普通小球藻生長(zhǎng)過(guò)程中總?cè)~綠素、Caro、總色素質(zhì)量濃度和b*、△E和C均呈增加趨勢(shì)，而L*、a*、H°呈降低趨勢(shì)。L*、a*、b*、△E與細(xì)胞數(shù)及色素質(zhì)量濃度的線性回歸模型擬合度較高，均達(dá)極顯著水平，今后應(yīng)在不同條件下對(duì)模型進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證和修正，使其具有更廣泛的適用性和普遍的指導(dǎo)意義。

4 結(jié)論

綜上，顏色參數(shù)值b*和△E的變化可有效指示熱帶普通小球藻生長(zhǎng)過(guò)程中細(xì)胞密度及色素質(zhì)量濃度的變化，特別是在快速生長(zhǎng)期更為靈敏，可作為較佳的指示指標(biāo)。該法可在一定程度上對(duì)微藻養(yǎng)殖過(guò)程進(jìn)行非接觸性動(dòng)態(tài)變化監(jiān)測(cè)，并為實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的定量化提供理論依據(jù)，具有快速、準(zhǔn)確、科學(xué)的特點(diǎn)；然而，不同品種之間可能存在顯著差異，因此需對(duì)在不同品種上的應(yīng)用進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)和驗(yàn)證，從而提高該法應(yīng)用的廣泛性。