侯麗萍，耿建林，谷巍，劉晴晴

自身免疫性甲狀腺炎（autoimmune thyroiditis，AIT）是臨床常見的器官特異性自身免疫性疾病，表現(xiàn)為甲狀腺腫大、咽部不適、頸部壓痛、吞咽困難等癥狀，給患者工作和生活造成一定的影響［1］。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎（experimental autoimmune thyroidits，EAT）動(dòng)物模型與人類AIT 具有相同的病理基礎(chǔ)與臨床表現(xiàn)，是研究AIT 的重要工具［2］。硒是人體所必需的微量元素，硒缺乏可致機(jī)體免疫功能下降，補(bǔ)硒可降低AIT患者甲狀腺抗體水平，調(diào)節(jié)T細(xì)胞亞群平衡［3］。維生素D具有免疫調(diào)節(jié)作用，維生素D缺乏是多種自身免疫性疾病的重要影響因素之一［4］。硒和維生素D有利于改善AIT，兩者聯(lián)合應(yīng)用可以提高機(jī)體自身免疫力。既往研究表明，絲裂原活化蛋白激酶（motigen-activated protein kinase，MAPK）通路廣泛參與細(xì)胞凋亡、增殖和分化等活動(dòng)過程，與多種免疫性疾病有關(guān)［5］。本研究通過建立EAT 大鼠模型，評估硒酵母聯(lián)合維生素D 對EAT 相關(guān)激素和抗體的作用，探討其改善EAT的作用機(jī)制，為臨床治療AIT提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 55 只SPF 級雌性SD 大鼠，5 周齡，體質(zhì)量（130±10）g，購自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（滬）2018-0004。飼養(yǎng)于SPF 級環(huán)境，溫度20～25 ℃、相對濕度45%～65%，光照12 h/黑暗12 h循環(huán)。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。

1.1.2 藥物、主要試劑和儀器 硒酵母片［國藥準(zhǔn)字H10940161，50 μg（以每片70 mg硒酵母中含硒量計(jì)）］購自牡丹江靈泰藥業(yè)有限公司，維生素D3注射液（國藥準(zhǔn)字H31021404，1 mL∶7.5 mg）購自上海通用藥業(yè)股份有限公司，豬甲狀腺球蛋白（pTG）、磷酸緩沖鹽溶液（PBS），完全弗氏佐劑（CFA）、不完全弗氏佐劑（IFA）均購自美國Sigma 公司，大鼠游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）、游離甲狀腺素（FT4）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，促甲狀腺激素（TSH）、甲狀腺球蛋白抗體（TGAb）、甲狀腺過氧化物酶抗體（TPOAb）ELISA試劑盒均購自武漢基因美生物科技有限公司，大鼠干擾素-γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素（IL）-4 ELISA試劑盒均購自美國R&D公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TOYOBO 公司，PCR 試劑盒購自美國KAPA Biosystems 公司，兔抗大鼠p38MAPK、p-p38MAPK、環(huán)氧合酶-2（COX-2）單抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG 均購自美國Cell Signaling Technology 公司，ELX8000酶標(biāo)儀、電泳儀購自美國Bio-rad公司，PCR儀購自瑞士Roche公司。

1.2 方法

1.2.1 EAT 大鼠模型建立及分組 將10 mg pTG 溶解于5 mL PBS 中，再與5 mL CFA 混合，充分乳化，制成抗原含量為1 g/L的pTG乳化劑備用；稱體質(zhì)量后采用隨機(jī)數(shù)字表法抽取45 只大鼠參與建模，pTG 乳化劑按1 mL/kg 體質(zhì)量于大鼠足墊及背部皮下多點(diǎn)注射，每周1 次，連續(xù)2 周，為初次免疫。2 周后采用同法加強(qiáng)免疫：取pTG 與IFA 混合充分乳化制成乳化劑備用，pTG 乳化劑按1 mL/kg 體質(zhì)量于大鼠皮下多點(diǎn)注射，每周1 次，連續(xù)4 周。大鼠造模期間避光，不限量飲用0.05%碘化鉀水。加強(qiáng)免疫2 周后，建模大鼠眶靜脈取血1 mL/只，檢測血清TPOAb 水平，TPOAb 滴度≥60 IU/mL 為建模成功［6］。其余10 只大鼠為對照組，前2 周按1 mL/kg 體質(zhì)量皮下多點(diǎn)注射CFA 和PBS等體積混合的乳化劑，后4周按1 mL/kg 體質(zhì)量皮下多點(diǎn)注射IFA 和PBS 等體積混合的乳化劑。建模成功大鼠（40只）采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、硒酵母組、維生素D組和硒酵母組+維生素D聯(lián)合組（聯(lián)合組），每組10只。

1.2.2 給藥方法 加強(qiáng)免疫4周后進(jìn)行藥物干預(yù)，將40片硒酵母片碾碎溶于100 mL生理鹽水，配制成20 g/L硒酵母溶液備用。對照組和模型組：生理鹽水灌胃（10 mL/kg，1次/d）+腹腔注射生理鹽水（0.67 mL/kg，隔天1次）。硒酵母組：硒酵母溶液灌胃（10 mL/kg，1次/d）+腹腔注射生理鹽水（0.67 mL/kg，隔天1次）；維生素D組：生理鹽水灌胃（10 mL/kg，1次/d）+腹腔注射維生素D3注射液（0.67 mL/kg，隔天1 次）；聯(lián)合組：硒酵母溶液灌胃（10 mL/kg，1次/d）+腹腔注射維生素D3注射液（0.67 mL/kg，隔天1次）。各組均連續(xù)給藥6周。

1.2.3 血清FT3、FT4、TSH、TGAb、TPOAb、IFN-γ、IL-4 檢測 末次干預(yù)后禁食12 h，腹主動(dòng)脈采血5 mL 置于離心管中靜置1 h，3 000 r/min 離心10 min（離心半徑12 cm）取上清，-20 ℃保存。取保存血清，按照ELISA試劑盒說明書測定血清FT3、FT4、TSH、TGAb、TPOAb、IFN-γ、IL-4，用酶標(biāo)儀在450 nm 波長測量各樣品孔吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測樣品各指標(biāo)濃度。

1.2.4 甲狀腺病理學(xué)形態(tài)觀察 采血完畢處死大鼠并置于載物臺(tái)上，充分暴露頸部，分離雙側(cè)甲狀腺組織，左側(cè)甲狀腺置于10%中性福爾馬林固定72 h，右側(cè)甲狀腺置于液氮中保存?zhèn)溆?。取固定甲狀腺組織約1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm，脫水浸蠟包埋，切成5 μm薄片，脫蠟，常規(guī)蘇木精-伊紅染色法（HE）染色，中性樹膠封固后置于光鏡下觀察。

1.2.5 甲狀腺組織中p38MAPK、COX-2 mRNA相對表達(dá)量檢測 取液氮保存的甲狀腺組織80 mg，研磨后Trizol法提取總RNA，測定RNA 純度及濃度，取適量RNA 為模板，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）擴(kuò)增。反應(yīng)體系：上、下游引物各1 μL，2 μL 模板cDNA，10 μL SYBR Premix ExTaq Ⅱ（2×），加雙蒸水至總體積20 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性5 s，55 ℃退火30 s，35個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量，每個(gè)樣本做3次，取Ct平均值。引物序列見表1。

Tab.1 Primer sequence for qPCR表1 qPCR引物序列

1.2.6 甲狀腺組織中p38MAPK、p-p38MAPK、COX-2蛋白相對表達(dá)量檢測 取液氮保存甲狀腺組織80 mg，加入裂解液冰上孵育30 min，提取組織總蛋白，BAC法測定蛋白濃度，稀釋蛋白樣品，蛋白變性，上樣。100 V電泳2 h，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶搖床封閉2 h，加入稀釋的一抗p38MAPK（1∶1 000）、p-p38MAPK（1∶1 000）、COX-2（1∶1 000）和βactin（1∶1 000）4 ℃搖床過夜，洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶5 000），室溫?fù)u床封閉2 h，加ECL試劑反應(yīng)后壓片、顯影、定影，采用Image J軟件分析灰度值，與β-actin內(nèi)參灰度做比值進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q 檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清FT3、FT4、TSH、TGAb、TPOAb 水平比較 與對照組相比，模型組、硒酵母組、維生素D組和聯(lián)合組FT3、FT4、TSH、TGAb、TPOAb水平均升高（P＜0.05）；與模型組比較，硒酵母組、維生素D組、聯(lián)合組FT3、FT4、TSH、TGAb、TPOAb水平均降低（P＜0.05）；與硒酵母組、維生素D組比較，聯(lián)合組FT3、FT4、TSH、TGAb、TPOAb水平均降低（P＜0.05）；硒酵母組與維生素D組FT3、FT4、TSH、TGAb、TPOAb水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

Tab.2 Comparison of serum levels of FT3,FT4,TSH,TGAb and TPOAb between five groups of rats表2 5組大鼠血清FT3、FT4、TSH、TGAb、TPOAb水平比較 （n=10，±s）

Tab.2 Comparison of serum levels of FT3,FT4,TSH,TGAb and TPOAb between five groups of rats表2 5組大鼠血清FT3、FT4、TSH、TGAb、TPOAb水平比較 （n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，c與硒酵母組比較，d與維生素D組比較，P＜0.05

組別對照組模型組硒酵母組維生素D組聯(lián)合組F FT3（pmol/L）4.96±5.54 37.16±4.13a 28.84±3.21ab 26.97±2.95ab 20.17±2.47abcd 99.837＊＊FT4（pmol/L）25.81±3.78 147.67±15.25a 87.69±9.12ab 90.17±9.85ab 65.49±6.86abcd 206.500＊＊組別對照組模型組硒酵母組維生素D組聯(lián)合組F TSH（ng/L）2 061.04±236.14 4 150.82±425.58a 3 216.26±341.65ab 3 345.57±355.24ab 2 645.57±275.23abcd 55.235＊＊TGAb（ng/L）24.12±2.67 176.36±18.58a 74.97±8.12ab 87.23±9.64ab 46.45±5.68abcd 312.731＊＊TPOAb（ng/L）21.57±2.51 152.38±16.16a 84.82±8.65ab 91.63±9.26ab 54.72±6.19abcd 253.381＊＊

2.2 各組甲狀腺病理組織學(xué)形態(tài) HE染色結(jié)果顯示，對照組可見甲狀腺濾泡排列規(guī)則緊密，膠質(zhì)豐富分布均勻，濾泡間無淋巴細(xì)胞浸潤，無纖維化。模型組甲狀腺濾泡結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，形態(tài)不規(guī)則，部分濾泡萎縮，膠質(zhì)稀少且分布不均，濾泡間可見大量淋巴細(xì)胞浸潤，周圍可見纖維組織增生。硒酵母組和維生素D組濾泡形態(tài)較完整，可見部分濾泡結(jié)構(gòu)破壞，膠質(zhì)減少，濾泡間可見淋巴細(xì)胞浸潤，與模型組比有一定改善。聯(lián)合組濾泡形態(tài)大部分較規(guī)則，膠質(zhì)較多，濾泡間可見少量淋巴細(xì)胞浸潤，濾泡破壞及淋巴細(xì)胞浸潤較模型組有顯著改善。見圖1。

Fig.1 Comparison of histopathological changes of thyroid gland between five groups of rats(HE，×200)圖1 5組大鼠狀腺組織病理學(xué)變化比較（HE，×200）

2.3 各組大鼠血清IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4水平比較 與對照組比較，模型組、硒酵母組、維生素D組、聯(lián)合組IFN-γ、IFN-γ/IL-4水平均升高，IL-4水平均降低（P＜0.05）；與模型組比較，硒酵母組、維生素D組、聯(lián)合組IFN-γ、IFN-γ/IL-4 水平均降低，IL-4 水平均升高（P＜0.05）；與硒酵母組、維生素D組比較，聯(lián)合組IFN-γ、IFN-γ/IL-4水平均降低，IL-4水平升高（P＜0.05）；硒酵母組與維生素D 組IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4 水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

Tab.3 Comparison of serum levels of IFN-γ,IL-4 and IFN-γ/IL-4 between five groups of rats表3 5組大鼠血清IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4水平比較（n=10，±s）

Tab.3 Comparison of serum levels of IFN-γ,IL-4 and IFN-γ/IL-4 between five groups of rats表3 5組大鼠血清IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4水平比較（n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，c與硒酵母組比較，d與維生素D組比較，P＜0.05

組別對照組模型組硒酵母組維生素D組聯(lián)合組F IFN-γ（ng/L）135.86±18.47 376.31±38.13a 226.97±25.17ab 235.81±25.49ab 176.89±18.05abcd 121.661＊＊IL-4（ng/L）141.48±15.14 72.53±8.16a 104.91±12.06ab 110.05±12.72ab 123.61±13.74abcd 41.120＊＊IFN-γ/IL-4 0.96±0.11 5.19±0.52a 2.16±0.25ab 2.14±0.23ab 1.43±0.17abcd 319.849＊＊

2.4 各組大鼠甲狀腺組織中p38MAPK、COX-2 mRNA 水平比較 與對照組比較，模型組、硒酵母組、維生素D組、聯(lián)合組COX-2 mRNA相對表達(dá)量均升高（P＜0.05）；與模型組比較，硒酵母組、維生素D組、聯(lián)合組COX-2 mRNA 相對表達(dá)量均降低（P＜0.05）；與硒酵母組、維生素D組比較，聯(lián)合組COX-2 mRNA 相 對 表 達(dá) 量 均 降 低（P＜0.05）。 各 組p38MAPK mRNA 相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

Tab.4 Comparison of p38MAPK and COX-2 mRNA levels in thyroid tissues between five groups of rats表4 5組大鼠甲狀腺組織中p38MAPK、COX-2 mRNA水平比較 （n=10，±s）

Tab.4 Comparison of p38MAPK and COX-2 mRNA levels in thyroid tissues between five groups of rats表4 5組大鼠甲狀腺組織中p38MAPK、COX-2 mRNA水平比較 （n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，c與硒酵母組比較，d與維生素D組比較，P＜0.05

組別對照組模型組硒酵母組維生素D組聯(lián)合組F p38MAPK 1.00±0.00 1.08±0.12 1.03±0.11 1.05±0.12 1.07±0.11 0.972 COX-2 1.00±0.00 1.96±0.15a 1.57±0.13ab 1.65±0.15ab 1.28±0.12abcd 3.067＊＊

2.5 各組大鼠甲狀腺組織中p38MAPK、pp38MAPK、COX-2 蛋白水平比較 與對照組比較，模型組、硒酵母組、維生素D 組、聯(lián)合組pp38MAPK、COX-2 蛋白相對表達(dá)量均升高（P＜0.05）；與模型組比較，硒酵母組、維生素D 組、聯(lián)合組p-p38MAPK、COX-2蛋白相對表達(dá)量均降低（P＜0.05）；與硒酵母組、維生素D 組比較，聯(lián)合組pp38MAPK、COX-2 蛋白相對表達(dá)量均降低（P＜0.05）；硒酵母組與維生素D 組p-p38MAPK、COX-2蛋白相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組p38MAPK 蛋白相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表5、圖2。

Tab.5 Comparison of p38MAPK,p-p38MAPK and COX-2 protein levels in thyroid tissues between five groups of rats表5 5組大鼠甲狀腺組織中p38MAPK、p-p38MAPK、COX-2蛋白水平比較 （n=10，±s）

Tab.5 Comparison of p38MAPK,p-p38MAPK and COX-2 protein levels in thyroid tissues between five groups of rats表5 5組大鼠甲狀腺組織中p38MAPK、p-p38MAPK、COX-2蛋白水平比較 （n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，c與硒酵母組比較，d與維生素D組比較，P＜0.05

組別對照組模型組硒酵母組維生素D組聯(lián)合組F p38MAPK 1.06±0.11 1.05±0.12 1.07±0.10 1.10±0.11 1.09±0.10 0.367 p-p38MAPK 0.15±0.02 0.98±0.13a 0.73±0.08ab 0.76±0.07ab 0.28±0.04abcd 202.732＊＊COX-2 0.21±0.02 0.95±0.10a 0.63±0.07ab 0.67±0.08ab 0.32±0.05abcd 180.331＊＊

Fig.2 Comparison of p38MAPK,p-p38MAPK and COX-2 protein levels in thyroid tissues between five groups of rats圖2 5組大鼠甲狀腺組織中p38MAPK、p-p38MAPK、COX-2蛋白水平比較

3 討論

甲狀腺是人體最大的內(nèi)分泌器官，由濾泡上皮細(xì)胞組成，其主要功能是合成甲狀腺激素，調(diào)節(jié)機(jī)體平衡。AIT 是器官特異性自身免疫性疾病，由于機(jī)體異常識(shí)別自身抗原，引起淋巴細(xì)胞侵入并攻擊甲狀腺組織，從而導(dǎo)致甲狀腺功能受損。目前臨床治療AIT 多為甲狀腺激素的替代治療，但激素替代療法無法阻止甲狀腺的破壞，且易合并其他自身免疫性疾?。?］。因此，尋找新的治療方法對早期干預(yù)AIT有重要意義。硒在甲狀腺組織中具有重要作用，通過補(bǔ)硒治療，可有效緩解AIT病情［8］。維生素D及其代謝產(chǎn)物對于自身免疫類疾病有良好的調(diào)節(jié)作用，可以阻止AIT 病理發(fā)展［9］。故本研究選取常用的補(bǔ)硒制劑硒酵母片及維生素D3注射液，觀察其對EAT的緩解作用，探討其作用機(jī)制。

FT3、FT4、TSH 主要反映甲狀腺功能是否異常，TGAb、TPOAb 則是甲狀腺自身抗體，在AIT 發(fā)病過程中有重要作用，是反映甲狀腺自身免疫病的特異性指標(biāo)。本研究中模型組大鼠表現(xiàn)出典型EAT 癥狀，經(jīng)治療后，HE染色顯示硒酵母組、維生素D組及聯(lián)合組甲狀腺組織病理形態(tài)都較模型組有顯著改善，其中聯(lián)合組改善效果最明顯；同時(shí)與模型組比較，硒酵母組、維生素D 組及聯(lián)合組血清FT3、FT4、TGAb、TPOAb 水平顯著下降，其中以聯(lián)合組下降最明顯，提示硒酵母和維生素D 能有效抑制EAT 的進(jìn)展。Pirola 等［10］發(fā)現(xiàn)補(bǔ)硒治療可顯著降低AIT 患者患者TPOAb 水平，有效緩解病情。Krysiak 等［11-12］發(fā)現(xiàn)AIT 患者服用維生素D 后，TPOAb 滴度、TSH、TGAb 水平較未服用者顯著降低。本研究與上述研究結(jié)果相一致，表明硒和維生素D 均可有效改善EAT大鼠癥狀，減輕甲狀腺組織損傷，保護(hù)甲狀腺功能，且兩者聯(lián)合應(yīng)用效果更好。

AIT 發(fā)生與Th1/Th2 細(xì)胞失衡存在密切關(guān)系，AIT 發(fā)展過程中以Th1 細(xì)胞因子優(yōu)勢表達(dá)，其中IFN-γ 是Th1 細(xì)胞的特征分子，本研究中模型組大鼠IFN-γ/IL-4 明顯升高，提示處于Th1/Th2 細(xì)胞失衡狀態(tài)，與既往研究結(jié)果相符［13-14］。MAPK 信號(hào)通路在炎癥反應(yīng)過程中起重要作用，p38MAPK是其重要成員，當(dāng)細(xì)胞受到各種因素刺激時(shí)可以磷酸化形成p-p38MAPK，p-p38MAPK 引起核轉(zhuǎn)錄因子κB 活化，進(jìn)而促進(jìn)白細(xì)胞介素等炎癥因子表達(dá)，p38MAPK 作為上游調(diào)節(jié)因子，調(diào)節(jié)下游COX-2 表達(dá)，COX-2 表達(dá)增加刺激炎癥因子產(chǎn)生，介導(dǎo)全身炎癥反應(yīng)［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)治療后，硒酵母組、維生素D 組及聯(lián)合組IFN-γ/IL-4 顯著下降，COX-2 mRNA 及蛋白、p-p38MAPK 蛋白表達(dá)顯著下降，提示硒酵母和維生素D可顯著調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞失衡，可能是通過下調(diào)p38MAPK 及COX-2 表達(dá)從而抑制MAPK信號(hào)通路發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，硒酵母聯(lián)合維生素D 可有效改善EAT大鼠癥狀，減輕甲狀腺組織損傷，保護(hù)甲狀腺功能，其機(jī)制可能是通過抑制MAPK 信號(hào)通路調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡來發(fā)揮調(diào)控作用。