宋東紅，馬利方，于洋

肥胖及其誘發(fā)的代謝紊亂已成為世界性公共衛(wèi)生問題，特別是對(duì)女性生殖健康有負(fù)面影響，包括增加月經(jīng)失調(diào)、無排卵和其他生育問題的風(fēng)險(xiǎn)［1-2］。此外，越來越多的證據(jù)表明，在超重或肥胖的不孕女性中，促排卵和輔助生殖技術(shù)（如體外受精）的成功率通常較低。肥胖增加了不孕癥的治療成本，患者需要使用更大劑量的促性腺激素［3-4］，且胚胎著床率和妊娠率降低［5-7］,流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)增高［8］,接受輔助生殖助孕治療的受孕率降低［9］。研究表明，肥胖患者胚胎質(zhì)量下降與其顆粒細(xì)胞功能失調(diào)具有密切關(guān)系，改善其顆粒細(xì)胞功能，可以提高肥胖患者的卵母細(xì)胞和胚胎發(fā)育潛能［10-11］。

雷公藤紅素是雷公藤等中藥天然存在的一種五環(huán)三萜類的生物活性成分［12］，在中醫(yī)領(lǐng)域用于治療發(fā)熱、關(guān)節(jié)疼痛、水腫及炎癥，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等［13］。近年來研究表明，雷公藤紅素作為瘦素增敏劑可調(diào)節(jié)體質(zhì)量，具有成為新型減肥藥物的潛力，同時(shí)可以緩解肥胖導(dǎo)致的糖尿病胰島素抵抗等病理表型［14］。但是，雷公藤紅素能否直接作用于肥胖患者卵巢局部微環(huán)境，改善因肥胖導(dǎo)致的顆粒細(xì)胞功能失調(diào)，提高卵母細(xì)胞及胚胎發(fā)育潛能目前仍不清楚。本研究使用雷公藤紅素干預(yù)肥胖小鼠模型，探討其對(duì)顆粒細(xì)胞功能的影響，以及改善肥胖小鼠生育能力的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)CD-1小鼠均購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司。其中雌性5周齡62只，體質(zhì)量21.4～23.2 g；雌性8 周齡20 只，體質(zhì)量27.2～28.5 g；雄性10周齡10只，體質(zhì)量30.3～31.6 g；雄性結(jié)扎小鼠10周齡10只，體質(zhì)量29.5～30.3 g。雷公藤紅素（C0869）、細(xì)胞松弛素B（C6762）、體外操作液M2（M7167）、水合氯醛（23100）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，孕馬血清促性腺激素、人絨毛膜促性腺激素（寧波第二激素廠），透明質(zhì)酸酶（美國(guó)Sigma 公司，H4272），總RNA提取試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司，AM1921），cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（德國(guó)Qiagen 公司，205111），KSOMaa 培養(yǎng)基（德國(guó)Merck-Millipore公司，MR-020P-D），熒光定量PCR試劑盒（TIANGEN 公司，F(xiàn)P303-01），CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司，3111），體式顯微鏡（日本尼康，SMZ1000），倒置顯微鏡（日本尼康，Ti-E），顯微操作系統(tǒng)（日本Narishige，NT-88-V3），顯微注射系統(tǒng)（日本PRIME-TECH，PMM-150），實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司，ABI 7900），納米滴分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司，NanoDrop2000），凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司，Gel Doc XR），離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司，5810）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 62只5周齡雌性CD-1小鼠采用拋硬幣隨機(jī)方法分為正常飲食組（n=26）、高脂飲食組（n=26）和雷公藤紅素組（n=10）；正常飲食組和高脂飲食組再通過拋硬幣隨機(jī)方法分為正常飲食A組（n=10）、正常飲食B組（n=6）、正常飲食C 組（n=10），高脂飲食A 組（n=10）、高脂飲食B 組（n=6）和高脂飲食C組（n=10）。

1.2.2 肥胖小鼠模型的構(gòu)建 正常飲食組小鼠喂食正常飼料；高脂飲食組和雷公藤紅素組小鼠喂食高脂肪飲食（能量比：62%脂肪，18%蛋白質(zhì)，20%碳水化合物）。高脂飲食組和雷公藤紅素組小鼠體質(zhì)量大于正常飲食組小鼠平均體質(zhì)量20%時(shí)，被認(rèn)為肥胖小鼠模型造模成功。所有動(dòng)物被單籠飼養(yǎng)，環(huán)境溫度為22～26 ℃，相對(duì)濕度為50%～60%，光暗周期為12 h/12 h，自由采食和飲水。6周后，對(duì)小鼠稱質(zhì)量并確定肥胖模型造模是否成功。本研究得到北京大學(xué)第三醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，并遵守《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》。

1.2.3 雷公藤紅素給藥方法 用含5%二甲基亞砜（DMSO）和1%吐溫20（Tween-20）的生理鹽水溶解雷公藤紅素粉末制備成的雷公藤紅素使用液（含雷公藤紅素500 mg/L）。雷公藤紅素組按照100 μg/（kg·d）的標(biāo)準(zhǔn)［15］，每日下午4：00 采用灌胃方法給藥，連續(xù)給藥21 d。正常飲食C組與高脂飲食C 組同期以灌胃的方式給予等體積的含5% DMSO 和1%Tween-20的生理鹽水。3組小鼠每日下午3：00稱體質(zhì)量。

1.2.4 交配實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠產(chǎn)仔數(shù) 將正常飲食A 組與高脂飲食A組按照1∶1的比例，與10周齡雄性CD-1小鼠合籠，次日檢查雌性小鼠陰栓。有陰栓的小鼠移入新籠中單獨(dú)飼養(yǎng)，沒有陰栓的小鼠繼續(xù)合籠，直到檢查到陰栓為止。19.5 d 產(chǎn)仔后，記錄產(chǎn)仔數(shù)。

1.2.5 小鼠顆粒細(xì)胞及卵母細(xì)胞收集 正常飲食B組、高脂飲食B組、正常飲食C組、高脂飲食C組和雷公藤紅素組小鼠（其中正常飲食C 組、高脂飲食C 組和雷公藤紅素組6 只小鼠，均采用拋硬幣隨機(jī)分組方法，從每組10只小鼠中隨機(jī)抽取）腹腔注射10 IU 孕馬血清促性腺激素（PMSG），48 h 后腹腔注射10 IU 人絨毛膜促性腺激素（hCG）。注射hCG 后14～16 h，處死小鼠，取出輸卵管，顯微鏡下劃開壺腹部收集卵母細(xì)胞—卵丘顆粒細(xì)胞復(fù)合物。將卵母細(xì)胞—卵丘顆粒細(xì)胞復(fù)合物置于1 mg/L透明質(zhì)酸酶中3 min，直到卵丘細(xì)胞分散。將散落在透明質(zhì)酸酶中的卵丘顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)移到1.5 mL 試管中，在200×g 條件下離心5 min，去除上清液，將細(xì)胞懸浮在KSOMaa培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）法檢測(cè)小鼠顆粒細(xì)胞基因表達(dá)水平 使用RNA 分離試劑盒從1.2.5中5組小鼠顆粒細(xì)胞中提取總RNA。使用納米滴分光光度計(jì)測(cè)定分離RNA的濃度和質(zhì)量。用cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成目的基因cDNA，利用熒光定量PCR 儀檢測(cè)目的基因的表達(dá)。用GADPH 作為PCR 內(nèi)對(duì)照。PCR 反應(yīng)體系的擴(kuò)增條件：95 ℃變性120 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，循環(huán)40次。用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。檢測(cè)的目的基因包括：B 細(xì)胞淋巴瘤-2 相關(guān)X 蛋白編碼基因（Bax）、BCL2拮抗/殺傷因子1（Bak1）、FAS相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白編碼基因（Fadd）、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2（Traf2）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8（Casp8）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9（Casp 9）、細(xì)胞色素P450-家族11-亞家族A-肽1（Cyp11a1）、細(xì)胞色素P450-家族19-亞家族A-肽1（Cyp19a1）、白細(xì)胞介素（IL）-1β和IL-6。其中Bax、Bak1、Fadd、Traf2、Casp8和Casp9反映顆粒細(xì)胞凋亡情況，Cyp11a1 和Cyp19a1 反映雌激素合成情況，IL-1β 和IL-6 反映顆粒細(xì)胞炎癥反應(yīng)激活情況。引物序列見表1。

1.2.7 小鼠胚胎發(fā)育情況檢測(cè) 取10周齡CD-1雄鼠，斷頸法處死后從附睪中取出精子，放入含有5 mg/L 細(xì)胞松弛素B的M2 體外操作液中。用注射針吸取一個(gè)精子，注射入小鼠卵母細(xì)胞中。注射后的卵母細(xì)胞放入KSOMaa培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。6 h后，在200倍倒置顯微鏡下觀察出現(xiàn)原核的受精卵數(shù)量，統(tǒng)計(jì)受精率（受精率=原核受精卵數(shù)÷卵母細(xì)胞總數(shù)×100%）。24 h后在200倍倒置顯微鏡下觀察2細(xì)胞胚胎數(shù)量，統(tǒng)計(jì)卵裂率，卵裂率=卵裂胚胎數(shù)÷卵母細(xì)胞總數(shù)×100%。3.5 d 后在200 倍倒置顯微鏡下觀察囊胚數(shù)量，統(tǒng)計(jì)囊胚率，囊胚率=囊胚數(shù)÷卵母細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.8 胚胎移植 將8 周齡的CD-1 雌鼠與10 周齡CD-1 結(jié)扎雄鼠合籠交配，次日檢查陰栓。將具有陰栓的雌鼠單獨(dú)飼養(yǎng)2 d，即為假孕2.5 d 的小鼠，待用。移植當(dāng)天，給小鼠腹腔注射4%水合氯醛，麻醉后，剪開皮膚和肌肉層，暴露出子宮，利用玻璃針將囊胚移入假孕2.5 d小鼠的子宮中，17.5 d仔鼠出生后，計(jì)算產(chǎn)仔數(shù)，產(chǎn)仔數(shù)與移植囊胚數(shù)的比值即為出生率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定量數(shù)據(jù)均采用±s表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果

2.1 肥胖對(duì)小鼠產(chǎn)仔數(shù)及顆粒細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響 高脂飲食A 組小鼠11 周齡體質(zhì)量顯著高于正常飲食A組（P＜0.01），每窩平均產(chǎn)仔數(shù)顯著低于正常飲食A 組（P＜0.01），見表2。與正常飲食B組比較，高脂飲食B 組小鼠顆粒細(xì)胞IL-1β、IL-6、Bax、Bak1、Fadd、Traf2、Casp8、Casp9表達(dá)顯著升高，而Cyp11a1和Cyp19a1表達(dá)顯著降低（均P＜0.01），見表3。

Tab.2 Effects of normal and high-fat diet on the body weight and litter size of mice表2 正常飲食與高脂飲食對(duì)小鼠體質(zhì)量及產(chǎn)仔數(shù)的影響（n=10，x±s）

Tab.3 Effects of normal and high-fat diet on the gene expression levels of mouse granulosa cells表3 正常飲食與高脂飲食對(duì)小鼠顆粒細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響 （n=6，x±s）

2.2 雷公藤紅素對(duì)肥胖小鼠顆粒細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響 雷公藤紅素組與高脂飲食C組小鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表4。與高脂飲食C組相比較，雷公藤紅素組小鼠顆粒細(xì)胞IL-1β、IL-6、Bax、Bak1、Fadd、Traf2、Casp8、Casp9表達(dá)顯著降低（P＜0.01），而Cyp11a1和Cyp19a1表達(dá)顯著升高（P＜0.01）。與正常飲食C組小鼠相比，雷公藤紅素組小鼠顆粒細(xì)胞Il-1β、Il-6、Bax、Bak1、Casp8、Cyp11a1和Cyp19a1表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而Fadd、Traf2、Casp9表達(dá)顯著升高（P＜0.05），見表5。

Tab.4 Effects of celastrol diet on the body weight of mice in normal,high-fat and celastrol-diet groups表4 喂食雷公藤紅素對(duì)正常飲食、高脂飲食和雷公藤紅素組小鼠體質(zhì)量的影響 （n=10，x±s）

2.3 雷公藤紅素對(duì)小鼠生育能力影響 雷公藤紅素組和正常飲食C組小鼠排卵數(shù)、卵裂率、囊胚率和出生率均顯著高于高脂飲食C組（P＜0.05），雷公藤紅素組和正常飲食C 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3 組小鼠受精率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表6。

Tab.5 Effects of celastrol diet on the gene expression levels of mouse granulosa cells in normal,high-fat and celastrol-diet groups表5 喂食雷公藤紅素對(duì)正常飲食、高脂飲食和雷公藤紅素組小鼠顆粒細(xì)胞基因表達(dá)的影響（n=6，x±s）

Tab.6 Effects of celastrol diet on the ovulation,fertilization,embryonic development and birth rate of mice in normal,high-fat and celastrol-diet groups表6 喂食雷公藤紅素對(duì)正常飲食、高脂飲食和雷公藤紅素組小鼠排卵、受精、胚胎發(fā)育及出生率的影響（n=6，x±s）

3 討論

3.1 肥胖與女性不孕 肥胖是導(dǎo)致女性內(nèi)分泌失調(diào)，進(jìn)而誘發(fā)不孕癥的主要因素之一。臨床研究表明，肥胖女性的激素分泌異常表現(xiàn)為雌激素水平顯著升高，而孕激素水平顯著降低［16］。同時(shí)，肥胖女性的流產(chǎn)率增加［8］，即便在采用輔助生殖助孕技術(shù)后，其胚胎發(fā)育率、優(yōu)質(zhì)胚胎率仍然較非肥胖患者顯著降低［5-6，9］。目前，臨床上針對(duì)肥胖不孕癥患者仍然以降低體質(zhì)量、調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)分泌等整體治療為主，而缺乏對(duì)改善卵巢局部功能的治療方式的深入探索。本文探究了一種具有多種生物活性的天然產(chǎn)物雷公藤紅素對(duì)小鼠卵巢顆粒細(xì)胞的作用，結(jié)果顯示雷公藤紅素能夠通過調(diào)控炎癥因子基因的表達(dá)，改善顆粒細(xì)胞的凋亡與激素合成相關(guān)基因的表達(dá)模式，進(jìn)而提高小鼠生育能力。

3.2 肥胖引起顆粒細(xì)胞炎癥、凋亡及對(duì)雌激素合成基因表達(dá)的影響 顆粒細(xì)胞是女性卵巢內(nèi)重要的細(xì)胞類型之一，其不僅為卵母細(xì)胞發(fā)育提供必須的代謝產(chǎn)物，同時(shí)也是雌激素和雄激素的重要合成場(chǎng)所。既往研究表明，肥胖女性體內(nèi)炎癥基因水平增高，機(jī)體處于慢性炎癥狀態(tài)［17］。本研究檢測(cè)小鼠卵巢顆粒細(xì)胞中炎癥因子基因IL-1β和IL-6的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)高脂飲食組小鼠顆粒細(xì)胞中兩個(gè)炎癥因子基因的編碼基因表達(dá)水平顯著上調(diào)，提示肥胖可誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。在腫瘤等疾病中，炎癥反應(yīng)已被證實(shí)可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［18］。本研究中，細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bax、Bak1、Fadd、Traf2、Casp8與Casp9的表達(dá)水平在高脂飲食組小鼠顆粒細(xì)胞中均顯著上調(diào)，提示肥胖可誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡主要通過兩種方式進(jìn)行，即線粒體途徑和死亡受體途徑。Bax、Bak1和Casp8屬于線粒體途徑的凋亡相關(guān)分子，而Fadd、Traf2和Casp9屬于死亡受體途徑的凋亡相關(guān)分子。本研究提示，高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖會(huì)同時(shí)通過兩條經(jīng)典細(xì)胞凋亡途徑誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞發(fā)生凋亡。Cyp11a1和Cyp19a1是雌激素合成過程中重要的限速酶的編碼基因，其表達(dá)量的降低可導(dǎo)致雌激素分泌水平降低。本研究結(jié)果表明，高脂飲食組小鼠Cyp11a1和Cyp19a1基因表達(dá)水平顯著下調(diào)，這與既往研究結(jié)論一致［19-20］。以上研究結(jié)果說明，肥胖會(huì)通過誘發(fā)顆粒細(xì)胞促炎因子的表達(dá)，激活顆粒細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞凋亡，同時(shí)降低顆粒細(xì)胞激素合成限速酶編碼基因表達(dá)水平，影響顆粒細(xì)胞的激素分泌功能，進(jìn)而導(dǎo)致肥胖小鼠產(chǎn)仔數(shù)的降低。

3.3 雷公藤紅素可改善肥胖小鼠顆粒細(xì)胞功能并提高其生育能力 本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)高脂飲食小鼠喂食雷公藤紅素后體質(zhì)量沒有顯著降低，這與既往研究結(jié)果不同。近年來，雷公藤紅素已經(jīng)在多項(xiàng)研究中被發(fā)現(xiàn)可以作為瘦素增敏劑來有效降低肥胖小鼠的體質(zhì)量［21］。本研究與既往研究的這種差異可能來自于喂食雷公藤紅素的持續(xù)時(shí)間不同。既往研究中，小鼠需要喂食2個(gè)月，大鼠喂食6周后，體質(zhì)量方能顯著降低［22-23］，而本研究?jī)H喂食21 d。盡管體質(zhì)量沒有下降，但是本研究發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素可以通過作用于卵巢局部，降低顆粒細(xì)胞炎癥因子基因的表達(dá)，提高顆粒細(xì)胞激素合成限速酶編碼基因表達(dá)水平，改善顆粒細(xì)胞的雌激素分泌功能。本研究還發(fā)現(xiàn)，雷公藤紅素組小鼠顆粒細(xì)胞中Bax、Bak1和Casp8的表達(dá)被顯著抑制，而Fadd、Traf2和Casp9的表達(dá)仍然顯著增高，提示雷公藤紅素通過抑制線粒體凋亡途徑，而不是死亡受體凋亡途徑來改善顆粒細(xì)胞的功能。這可能與雷公藤紅素具有較強(qiáng)的抗氧化應(yīng)激能力有關(guān)，有研究證明雷公藤紅素可以對(duì)線粒體發(fā)揮作用［24］，而線粒體是炎癥反應(yīng)發(fā)生的重要細(xì)胞器之一。與雷公藤紅素具有相似功能的二甲雙胍和白藜蘆醇，已經(jīng)被證明可以通過保護(hù)顆粒細(xì)胞線粒體功能，抑制炎癥反應(yīng)，改善多囊卵巢綜合征女性的生育力［25］，這也為本研究發(fā)現(xiàn)的雷公藤紅素可以通過抑制細(xì)胞凋亡和炎癥，改善肥胖小鼠生育力提供了佐證。

綜上所述，本研究初步證實(shí)肥胖可以誘導(dǎo)雌性小鼠卵巢局部的顆粒細(xì)胞炎癥因子基因表達(dá)異常，誘發(fā)顆粒細(xì)胞凋亡，降低顆粒細(xì)胞的雌激素分泌功能，進(jìn)而導(dǎo)致生育能力降低。雷公藤紅素在不降低體質(zhì)量的情況下，即可通過抑制卵巢局部顆粒細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和線粒體凋亡途徑的激活，上調(diào)顆粒細(xì)胞激素合成限速酶編碼基因表達(dá)水平，改善顆粒細(xì)胞的雌激素分泌功能，改善肥胖小鼠模型的生育能力。由于炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡是通過多種細(xì)胞通路進(jìn)行調(diào)控，雷公藤紅素改善顆粒細(xì)胞激素分泌功能的具體分子機(jī)制仍然有待進(jìn)一步探索。