張園園，朱淑霞，張?jiān)饺A，張燕燕

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是兒童和青少年時(shí)期最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤［1］。替莫唑胺（temozolomide，TMZ）是臨床治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的一線藥物，但患者對其耐藥的情況大大降低了其治療效果。微小RNA（microRNA，miRNA）-495表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和凋亡有關(guān)，參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展［2-5］。高遷移率族核小體結(jié)合域5（high-mobility group nucleosome-binding domain 5，HMGN5）是miRNA-495的直接靶基因之一［6］，體外研究表明其可促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)展，與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的惡性程度相關(guān)［7-8］，其亦是腫瘤化療耐藥的調(diào)控因子［9］?；|(zhì)金屬 蛋 白 酶-9（matrix metalloprotein-9，MMP-9）是HMGN5 的下游基因之一，抑制HMGN5 的表達(dá)可降低MMP-9基因的表達(dá)［6，10-11］。miRNA-495是否可通過影響HMGN5和MMP-9的表達(dá)參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展，并影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤對TMZ的敏感性尚不明確。本研究通過分析過表達(dá)miRNA-495 對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞HMGN5、MMP-9表達(dá)的影響，以及過表達(dá)miRNA-495聯(lián)合TMZ對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡的作用，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251、A172由濱州醫(yī)學(xué)院腫瘤分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；胎牛血清（fetal bovine serium，F(xiàn)BS）購自杭州四季青生物工程材料有限公司；RPMI-1640 購自美國Hyclone 公司；miRNA 類似物（miRNA mimics）和陰性序列（negative control，NC）由上海吉瑪生物技術(shù)有限公司合成；轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購自北京索萊寶科技有限公司，長期保存于-20 ℃冰箱，避免反復(fù)凍融；Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基公司；CCK-8試劑盒由同仁化學(xué)研究所開發(fā)；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；細(xì)胞裂解液、反轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增試劑盒購自日本TaKaRa 公司；HMGN5、MMP-9 單抗購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，GAPDH兔抗人單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 購自碧云天生物技術(shù)研究所。TMZ 購自江蘇天士力帝益藥業(yè)。流式細(xì)胞儀（Lter EpicsXL）購自美國Beckman-Coulter 公司；自動(dòng)酶標(biāo)分析儀（AT-858）購自美國熱電Thermo 公司；電泳儀（DYY-8C）、熒光定量PCR 儀（CFX96）、擴(kuò)增儀（Mastercycler 梯度+原位適配器）均購自美國Bio-Rad公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 自液氮罐內(nèi)（約-196 ℃）取出凍存的U251細(xì)胞，于37 ℃恒溫水浴箱中快速復(fù)蘇，接種于含14%完全細(xì)胞培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞培養(yǎng)基顏色變黃時(shí)更換細(xì)胞培養(yǎng)基，時(shí)間為1～3 d，待細(xì)胞密度達(dá)80%以上且細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行傳代。取對數(shù)生長期U251細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞按5×105/mL接種于12 孔板，依照LipofectamineTM2000 說明書分別轉(zhuǎn)染miRNA-495 mimics（miRNA-495 mimics 組）和miRNA-495 NC（miRNA-495 NC 組），并設(shè)未轉(zhuǎn)染U251 細(xì)胞組為空白對照組。轉(zhuǎn)染條件：無血清，miRNA-495 mimics（μL）∶轉(zhuǎn)染試劑（μL）=1∶1，轉(zhuǎn)染6 h 后更換完全培養(yǎng)基，以保持細(xì)胞良好狀態(tài)，培養(yǎng)24 h觀察轉(zhuǎn)染效率。同樣的方法培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染A172細(xì)胞。

1.3 qPCR 法檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)miRNA-495、HMGN5 mRNA相對表達(dá)量的變化 取轉(zhuǎn)染24 h 的U251、A172 細(xì)胞，用RNAiso Plus 試劑提取細(xì)胞總RNA，需檢測RNA 的濃度和純度。根據(jù)說明書配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，總體系為20 μL，合成cDNA反應(yīng)條件為30 ℃10 min，42 ℃15 min，95 ℃5 min。根據(jù)說明書配制PCR反應(yīng)液，總體系為25 μL，PCR反應(yīng)條件為95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，共40個(gè)循環(huán)。引物均由上海生工生物技術(shù)公司合成，引物序列見表1。以U6 snRNA為內(nèi)參，根據(jù)CT 值計(jì)算RNA 相對表達(dá)量變化，計(jì)算公式：目的基因 的 量=2-ΔΔCt，ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）試驗(yàn)組-（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）對照組。

Tab.1 The sequence of primer for qPCR表1 qPCR引物序列

1.4 Western blot 法檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)HMGN5 及MMP-9 蛋白表達(dá)量的變化 分別收集轉(zhuǎn)染48 h 后miRNA-495 mimics組、miRNA-495 NC 組、空白對照組的U251、A172 細(xì)胞，按照RIPA∶PMSF=16∶1配置蛋白裂解液提取蛋白，BCA 蛋白濃度試劑盒測定蛋白濃度。加入1/5體積的5×蛋白上樣緩沖液，95 ℃煮沸10 min。配置SDS-PAGE 凝膠，每組取15 μL 蛋白上樣后電泳，待Marker 完全分開時(shí)停止電泳，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，7%脫脂奶粉（TBST 配制）室溫?fù)u床上低速封閉2～4 h。加入兔抗人HMGN5 單抗（1∶500）、MMP-9 單抗（1∶1 000）、兔抗人GAPDH 單抗（1∶1 000），4 ℃冰箱封閉過夜。37 ℃暖箱復(fù)溫后TBST清洗4次。1∶5 000辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗室溫、搖床封閉2 h。TBST清洗4次。然后每條條帶各加入200 μL 配制好的發(fā)光液。將PVDF 膜放置于熒光成像儀中，用Image J 軟件進(jìn)行條帶灰度掃描，比較各組蛋白相對表達(dá)量變化。

1.5 CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染及聯(lián)合TMZ對細(xì)胞增殖的影響 取對數(shù)生長期的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板上，調(diào)整每個(gè)孔中細(xì)胞數(shù)為1×104個(gè)，按照1.2 中轉(zhuǎn)染條件轉(zhuǎn)染細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分組為空白對照組（含有細(xì)胞的培養(yǎng)基）、miRNA-495 NC 組、miRNA-495 mimics 組、TMZ 組、TMZ+miRNA-495 NC組、TMZ+miRNA-495 mimics 組，每組均設(shè)置5 個(gè)平行復(fù)孔，非加藥組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)時(shí)間分別為24、48、72 h，加藥組轉(zhuǎn)染24 h后加入濃度為200 μmol/L TMZ，其溶劑為DMSO，并使其體積分?jǐn)?shù)＜0.1%，再培養(yǎng)24 h。在各培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)結(jié)束前斜貼培養(yǎng)板壁快速向每孔加入10 μL CCK-8 試劑，輕輕振搖，混勻CCK-8 試劑和培養(yǎng)基。分別于轉(zhuǎn)染24、48、72 h 后和加藥后將培養(yǎng)板放置于37 ℃，5%CO2，濕度100%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1.5 h，后用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的光密度（OD）值，分析細(xì)胞增殖情況。

1.6 Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測miRNA-495 聯(lián)合TMZ對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響 取對數(shù)生長期U251 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105/mL，接種于12 孔板，置于37 ℃恒溫、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按照1.2中轉(zhuǎn)染條件轉(zhuǎn)染細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分組為空白對照組、miRNA-495 NC 組、miRNA-495 mimics 組、TMZ 組、TMZ+miRNA-495 NC 組、TMZ+miRNA-495 mimics 組。轉(zhuǎn)染完成24 h 后在相應(yīng)組別中加入200 μmol/L TMZ，48 h 后用200 μL 不含EDTA 的胰酶消化收集各組細(xì)胞，PBS 洗滌細(xì)胞2 次，2 000 r/min 離心5 min，棄上清，加入500 μL Binding Buffer 使細(xì)胞重懸，加入5 μL Annexin V-FITC 溶液，用移液槍輕輕吹打混勻后，再加入5 μL Propidium Iodide溶液，再次用移液槍輕輕吹打混勻。放置于室溫條件下避光反應(yīng)5～15 min，1 h 內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間多重比較行LSD-t 檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05（雙側(cè)）。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞miRNA-495、HMGN5 mRNA相對表達(dá)量的變化情況 在神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251、A172 細(xì)胞中，miRNA-495 mimics 組miR-495 相對表達(dá)量較空白對照組和miRNA-495 NC 組升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；miRNA-495 NC 組miRNA-495 相對表達(dá)量與空白對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見圖1。

Fig.1 The relative expression of miRNA-495 after the transfection in glioma cells detected by qPCR圖1 qPCR法檢測轉(zhuǎn)染后神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中miRNA-495的相對表達(dá)量

在神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251、A172 細(xì)胞中，miRNA-495 mimics 組HMGN5 mRNA 相對表達(dá)量較空白對照組和miRNA-495 NC組下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；miRNA-495 NC 組HMGN5 mRNA 相對表達(dá)量與空白對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見圖2。

Fig.2 The relative expression of HMGN5 mRNA after the transfection in glioma cells detected by qPCR圖2 qPCR檢測轉(zhuǎn)染后神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中HMGN5 mRNA的相對表達(dá)量

2.2 Western blot法檢測轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞HMGN5及MMP-9 蛋白表達(dá)的變化情況 在神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中，miRNA-495 mimics 組HMGN5 及MMP-9 蛋白表達(dá)量較miRNA-495 NC 組和空白對照組下降（均P＜0.05）；miRNA-495 NC 組HMGN5 及MMP-9蛋白表達(dá)量與空白對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見圖3、4。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤A172 細(xì)胞中，miRNA-495 mimics 組HMGN5 及MMP-9 蛋白表達(dá)量較miRNA-495 NC 組和空白對照組下降（均P＜0.05）；miRNA-495 NC 組HMGN5 及MMP-9 蛋白表達(dá)量與空白對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖5、6。

2.3 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞的增殖變化情況 在神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251、A172 細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miRNA-495 mimics 24、48、72 h 后，miRNA-495 mimics 組細(xì)胞增殖能力較miRNA-495 NC 組和空白對照組明顯減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；miRNA-495 NC 組細(xì)胞增殖能力與空白對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖7、8。

Fig.3 The protein expression levels of HMGN5 and MMP-9 in U251 cells detected by Western blot assay圖3 Western blot法檢測轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞后HMGN5、MMP-9蛋白表達(dá)變化

Fig.4 The relative expression levels of HMGN5 and MMP-9 protein in U251 cells圖4 3組U251細(xì)胞中HMGN5、MMP-9蛋白的相對表達(dá)量

Fig.5 The protein expression levels of HMGN5 and MMP-9 in A172 cells detected by Western blot assay圖5 Western blot法檢測轉(zhuǎn)染A172細(xì)胞后HMGN5、MMP-9蛋白表達(dá)變化

Fig.6 The relative expression levels of HMGN5 and MMP-9 protein in A172 cells圖6 3組A172細(xì)胞中HMGN5、MMP-9蛋白的相對表達(dá)量

Fig.7 The effect of the transfection on proliferation of U251 cells detected by CCK-8圖7 CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染后對U251細(xì)胞增殖能力的影響

Fig.8 The effect of the transfection on proliferation of A172 cells detected by CCK-8圖8 CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染后對A172細(xì)胞增殖能力的影響

2.4 過表達(dá)miRNA-495 聯(lián)合TMZ 對U251 細(xì)胞增殖的影響 在神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞中，TMZ+miRNA-495 mimics 組細(xì)胞增殖能力明顯低于miRNA-495 mimics組和TMZ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=61.755，P＜0.05）；TMZ+miRNA-495 NC 組 與TMZ 組、miRNA-495 mimics 組與TMZ 組、miRNA-495 NC 組與空白對照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖9。

Fig.9 The proliferation of U251 cells detected by CCK-8圖9 CCK-8法檢測U251細(xì)胞增殖能力的變化情況

2.5 過表達(dá)miRNA-495 聯(lián)合TMZ 對U251 細(xì)胞凋亡的影響 在神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞中，空白對照組、miRNA-495 NC 組、miRNA-495 mimics 組、TMZ組、TMZ+miRNA-495 NC 組、TMZ+miRNA-495 mimics 組 細(xì) 胞 凋 亡 率分 別 為（3.550±0.404）%、（3.737±0.466）% 、（10.110±0.303）% 、（10.437±0.330）% 、（10.530±0.384）% 、（16.720±0.315）% 。TMZ+miRNA-495 mimics 組細(xì)胞凋亡率明顯高于miRNA-495 mimics組和TMZ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=533.035，P＜0.05），TMZ+miRNA-495 NC 組與TMZ組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖10。

Fig.10 The apoptosis of U251 cells detected by flow cytometry圖10 流式細(xì)胞術(shù)檢測U251細(xì)胞凋亡的變化情況

3 討論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是兒童和青少年時(shí)期最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤［1］，也是兒童癌癥相關(guān)死亡的主要原因［12］。miRNA 可作為致癌基因或抑癌基因在腫瘤中異常表達(dá)，參與細(xì)胞增殖、凋亡、分化、代謝等過程。其中，miRNA-495在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中通過不同的信號通路發(fā)揮著不同的生物學(xué)功能，在子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、腎腫瘤中抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移；在非小細(xì)胞肺癌中降低了其抗藥性；而在冠狀動(dòng)脈疾病、膀胱癌中促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞的生長、增殖和侵襲。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，miRNA-495可通過調(diào)控細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶6信號通路［2］、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體1 型信號通路［3］、MYB 基因信號通路［4］、獨(dú)立生長因子1 信號通路［5］等參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、周期調(diào)控、新陳代謝及侵襲轉(zhuǎn)移。

HMGN5是HMGN蛋白家族的一個(gè)新成員，它與腫瘤細(xì)胞的生長、細(xì)胞周期的調(diào)控、腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲有關(guān)，是多種惡性腫瘤的潛在治療靶點(diǎn)［13］。HMGN5在體外可促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生成，其低表達(dá)可導(dǎo)致G1期細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞增殖延遲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。已有研究證實(shí)，miRNA-409-3p 可以通過靶向調(diào)控HMGN5抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）和細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1）的表達(dá)，從而抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲［10］。另有研究發(fā)現(xiàn)，HMGN5 的表達(dá)水平隨著神經(jīng)膠質(zhì)瘤級別的增高而增加，并可作為神經(jīng)膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)的預(yù)測指標(biāo)之一，提示神經(jīng)膠質(zhì)瘤的惡性程度可能與HMGN5 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)有關(guān)［7-8］。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)miRNA-495 后，miRNA-495 mimics 組HMGN5 mRNA 和蛋白的相對表達(dá)量均較空白對照組和miRNA-495 NC 組降低，提示miRNA-495 可能通過調(diào)控HMGN5的表達(dá)參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展。

有研究表明，高表達(dá)HMGN5 可通過c-jun 信號通路上調(diào)MMP-2 和MMP-9，導(dǎo)致骨肉瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力增強(qiáng)［11］。Jiang等［6］研究發(fā)現(xiàn)，HMGN5是miRNA-495的直接靶基因之一，miRNA-495在骨肉瘤中表達(dá)下調(diào)，它通過與HMGN5 mRNA 的3'-UTR 靶向結(jié)合抑制HMGN5 的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞周期蛋白B1（cyclin B1）、Bcl-2和MMP-9的表達(dá)，進(jìn)而抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移，并誘導(dǎo)其凋亡。MMP-9是HMGN5的下游基因之一，抑制HMGN5的表達(dá)，可以降低MMP-9基因的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)miRNA-495 后，miRNA-495 mimics 組神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中MMP-9 mRNA 和蛋白的相對表達(dá)量均較空白對照組和miRNA-495 NC 組降低，提示miRNA-495 參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的機(jī)制可能是通過抑制HMGN5/MMP-9信號通路實(shí)現(xiàn)的。

關(guān)于過表達(dá)miRNA-495 后與化療藥物聯(lián)合作用抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制逐漸成為研究熱點(diǎn)。有研究表明，下調(diào)HMGN5的表達(dá)可以增加食管鱗狀細(xì)胞癌對順鉑的敏感性，這與調(diào)控多藥耐藥因子1（MDR1）、cyclin B1 和Bcl-2 基因有關(guān)［9］。另有研究指出，下調(diào)HMGN5的表達(dá)在不影響多藥耐藥相關(guān)蛋白1（MRP-1）的情況下，可抑制P-糖蛋白的表達(dá)，從而增加腦膜瘤細(xì)胞對替莫唑胺的化學(xué)敏感性［7］。本研究采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)過表達(dá)miRNA-495 與化療藥物TMZ 聯(lián)合作用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，結(jié)果顯示，TMZ+miRNA-495 mimics 組細(xì)胞增殖能力明顯低于miRNA-495 mimics組和TMZ組，細(xì)胞凋亡率明顯高于miRNA-495 mimics 組和TMZ組，提示過表達(dá)miRNA-495可增強(qiáng)TMZ對神經(jīng)膠質(zhì)瘤的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用。其機(jī)制可能是過表達(dá)miRNA-495 后可下調(diào)HMGN5 基因的表達(dá)，而HMGN5 又可調(diào)控多藥耐藥因子1、P-糖蛋白等，進(jìn)而提高神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對TMZ的敏感性。

綜上所述，過表達(dá)miRNA-495與化療藥物TMZ聯(lián)合應(yīng)用可協(xié)同抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡；其機(jī)制可能是通過抑制HMGN5/MMP-9 信號通路實(shí)現(xiàn)的。