饒超峰，薛笑楠，朱明英，羅富里

腎小球足細(xì)胞損傷與糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［1-2］。最近發(fā)現(xiàn)，腎小球足細(xì)胞增殖和蛋白尿與自噬抑制有關(guān)［3］。有研究表明，鏈脲佐菌素（Streptozocin，STZ）誘導(dǎo)的糖尿病小鼠足細(xì)胞自噬不足，并伴有大量蛋白尿；而在基礎(chǔ)代謝條件下，足細(xì)胞中高水平的自噬與細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)正相關(guān)［4］。然而，高糖（high glucose，HG）環(huán)境如何介導(dǎo)腎小球足細(xì)胞自噬尚不清楚。以往研究表明，HG 環(huán)境通過激活核因子（NF）-κB 信號通路，產(chǎn)生大量的促炎介質(zhì)，如轉(zhuǎn)化生長因子-β1、單核細(xì)胞趨化蛋白-1、腫瘤壞死因子（TNF）-α 和白細(xì)胞介素（IL）-1β，促進(jìn)巨噬細(xì)胞遷移和活化，進(jìn)而導(dǎo)致腎臟損傷［5］。這些發(fā)現(xiàn)強調(diào)了HG 在巨噬細(xì)胞活化中的作用。巨噬細(xì)胞具有招募免疫細(xì)胞的能力，其在DN進(jìn)展過程中起著中心作用，但是在糖尿病狀態(tài)下巨噬細(xì)胞和足細(xì)胞之間的通訊機制尚有待闡明。外泌體（Exosomes，Exos）是一類大小為30～120 nm的小膜泡，在細(xì)胞間通訊和相關(guān)免疫細(xì)胞激活中發(fā)揮作用［5］。Exos 具有改變靶細(xì)胞表型和功能的能力［5］。巨噬細(xì)胞來源的Exos 可以誘導(dǎo)靶細(xì)胞活化和分化［6］。最近研究觀察到，HG誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞Exos通過NF-κB 信號途徑激活巨噬細(xì)胞并誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)［7］。但HG誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞Exos是否與DN足細(xì)胞損傷有關(guān)尚未明確。鑒于此，本研究觀察HG處理的Raw264.7 巨噬細(xì)胞來源的Exos 對足細(xì)胞的損傷作用，并探討其作用機制是否與抑制足細(xì)胞自噬相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 主要材料及儀器 小鼠巨噬細(xì)胞系Raw264.7和原代足細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。DMEM 培養(yǎng)基、RPMI 1640 培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco 公司；青霉素、鏈霉素、氯喹、雷帕霉素、綠色親脂熒光染料PKH67 購自美國Sigma 公司；外泌體提取試劑ExoQuick-TC、EXOCET Exosome 定量試劑盒購自美國System Biosciences 公司；Phalloidin-iFluor 594 試劑、兔抗Nephrin 抗體、兔抗LC3B、Calnexin、p62、p-mTOR、mTOR單克隆抗體購自英國Abcam公司；CD63、CD9、GAPDH單克隆抗體和HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗購自美國Cell Signaling Technology 公司；Pierce?BCA 蛋白檢測試劑盒購自美國Thermo公司。H-7700透射電子顯微鏡（TEM）購自日本Hitachi 公司；激光掃描共聚焦顯微鏡購自德國Carl Zeiss 公司；NOVA 超顯微切片機購自瑞典Pharmacia LKB 公司；Tanon 5200 Multi全自動化學(xué)發(fā)光/熒光圖像分析系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司；Safire2酶標(biāo)儀購自瑞士TECAN公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和實驗分組 小鼠巨噬細(xì)胞系Raw264.7和原代足細(xì)胞分別接種在含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 g/L 鏈霉素的低葡萄糖DMEM 培養(yǎng)基或RPMI 1640 培養(yǎng)基中。細(xì)胞于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%時，更換新的培養(yǎng)基，完成一次細(xì)胞傳代。取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。（1）將Raw264.7 細(xì)胞分別用正常葡萄糖（NG；5.5 mmol/L 葡萄糖+24.5 mmol/L 甘露醇）組和高糖（HG；30 mmol/L 葡萄糖）處理48 h，探討HG 對Raw264.7 細(xì)胞釋放Exos 的影響。（2）原代足細(xì)胞用HG 提取不同劑量的Exos（0、7、14、28、56、112 mg/L）處理，對照組加入等量溶媒，探討高糖外泌體（HG-Exos）對足細(xì)胞存活、自噬的影響。（3）原代足細(xì)胞用HG-Exos（28 mg/L）處理不同時間（0、6、12、24、48、72、96 h），對照組加入等量溶媒，探討HGExos對足細(xì)胞存活的影響。（4）將原代足細(xì)胞分為6組：對照組（加入100 μL PBS）、HG-Exos組（加入100 μL 28 mg/L HGExos）、氯喹（自噬抑制劑，CQ）組（加入100 μL 10 μmol/L CQ）、HG-Exos+氯喹組（加入100 μL 28 mg/L HG-Exos 和100 μL 10 μmol/L CQ）、雷帕霉素（自噬誘導(dǎo)劑，Rapamycin）組（加入100 μL 100 μg/L Rapamycin）、HG-Exos+雷帕霉素組（加 入100 μL 28 mg/L HG-Exos 和100 μL 100 μg/L Rapamycin），探討HG-Exos誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性是否會受到自噬調(diào)節(jié)劑的影響。

1.3 Exos 提取及TEM 觀察 將NG 組和HG 組Raw264.7 細(xì)胞按1×106/mL 接種于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，并以3 000×g離心15 min以去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片。將3.3 mL外泌體提取試劑ExoQuick-TC 加到10.0 mL 上清液中，并將混合物在4 ℃冷藏過夜（至少12 h）。然后1 500×g離心30 min，取上清液，再通過1 500×g離心5 min將剩余的ExoQuick-TC 溶液離心去除。使用EXOCET Exosome 定量試劑盒定量Exos。將純化的Exos 沉淀物在無菌PBS中稀釋，并將10 μL懸浮液在室溫下置于銅網(wǎng)上2 min。然后將Exos 用2%磷鎢酸染色5 min，并用2%戊二醛固定5 min，然后用PBS 洗滌3 次。用H-7700 TEM觀察。

1.4 Exos 在原代足細(xì)胞的內(nèi)化 采用綠色親脂熒光染料PKH67 標(biāo)記HG 組Raw264.7 源Exos（HG-Exos）。然后，將標(biāo)記PKH67 的Exos 與原代足細(xì)胞共培養(yǎng)24 h，4%多聚甲醛固定10 min，1%牛血清白蛋白封閉1.5 h。隨后，在PBS 中用50 mg/L Phalloidin-iFluor 594 試劑染色在室溫下染色足細(xì)胞40 min。最后用DAPI染色，用激光掃描共聚焦顯微鏡對原代足細(xì)胞進(jìn)行檢測和拍照。

1.5 TEM觀察自噬體 將按1.2中（2）、（4）的分組處理足細(xì)胞以2×105/孔接種在96 孔板中，將足細(xì)胞用4%戊二醛固定12 h，再用1%OsO4固定2 h，梯度乙醇（體積分?jǐn)?shù)50%、70%、90%）脫水，70%醋酸鈾染色6 h，乙醇脫水，環(huán)氧樹脂包埋3 h，將樣品置于60 ℃烘箱中48 h，并進(jìn)行切片，厚度70 nm。最后用2%（W/V）醋酸鈾和檸檬酸鉛對樣品進(jìn)行染色，用TEM觀察自噬體。

1.6 CCK-8法測定HG-Exos 對細(xì)胞活力的影響 將足細(xì)胞以2×105/孔接種在96孔板中，按1.2中（2）、（3）的分組處理足細(xì)胞，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)孵育1 h。然后使用Safire2 酶標(biāo)儀通過測量450 nm 的光密度（OD）確定細(xì)胞活力。計算公式：細(xì)胞活力（%）=［OD（加藥）-OD（空白）］/［OD（對照）-OD（空白）］×100%。

1.7 Western blot 檢測自噬相關(guān)蛋白的表達(dá) 取足細(xì)胞或Exos，加入RIPA蛋白裂解液提取總蛋白質(zhì)，混勻后冰上裂解15 min。在4 ℃以12 000×g 離心20 min，收集上清液。用Pierce?BCA 蛋白檢測試劑盒檢測蛋白質(zhì)濃度。將蛋白質(zhì)樣品（50 μg）加載在12%聚丙烯酰胺凝膠上，然后電泳轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF 膜，與抗Calnexin（1∶1 000）、抗CD63（1∶1 000）、抗CD9（1∶1 000）、抗LC3B（1∶2 000）、抗Nephrin（1∶2 000）、抗Beclin 1（1∶2 000）、抗p62（1∶2 000）、抗p-mTOR（1∶2 000）、抗mTOR（1∶2 000）和GAPDH（1∶15 000）的一抗于4 ℃孵育過夜。次日，在室溫下與HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（1∶5 000）孵育2 h。最后用Tanon 5200 Multi全自動化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)發(fā)光顯影。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行Bonferroni校正法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HG處理的Raw264.7細(xì)胞分泌Exos特征 TEM顯示，Raw264.7 細(xì)胞分泌的Exos 呈圓形的膜囊泡，直徑為30～100 nm，且NG 組和HG 組的Raw264.7 細(xì)胞分離出Exos 在形態(tài)學(xué)上無明顯差異，見圖1。Western blot結(jié)果顯示，提取的Exos均表達(dá)特征性外泌體標(biāo)志物CD63 和CD9，而不表達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)志物Calnexin（常與細(xì)胞碎片有關(guān)），分離的Exos 未被細(xì)胞污染，見圖2。HG組Raw264.7細(xì)胞釋放的Exos數(shù)量（5.88±0.31）×108顯著多于NG 組的（1.84±0.26）×108（n=3，t=3.146，P＜0.05）。在TEM下觀察到HG組PKH67 標(biāo)記的Exos 位于足細(xì)胞的核周區(qū)中，表明Exos可以內(nèi)化到足細(xì)胞中，見圖3。

Fig.1 The Exos extracted from RAW264.7 cells observed by TEM(×150 000)圖1 TEM觀察Raw264.7細(xì)胞提取的Exos（×150 000）

Fig.2 The expressions of Calnexin,CD9 and CD63 detected by Western blot assay圖2 Western blot檢測Exos蛋白標(biāo)志物Calnexin、CD9和CD63的表達(dá)

2.2 HG-Exos 誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷的劑量和時間依賴性 足細(xì)胞活性在HG-Exos刺激后隨劑量和時間的增加而降低。當(dāng)HG-Exos劑量≥7 mg/L時HG-Exos組細(xì)胞活力均低于對照組（P＜0.05），當(dāng)HG-Exos 劑量為28 mg/L時，細(xì)胞活力下降至51.8%±4.0%，見表1，將7 mg/L、14 mg/L 和28 mg/L 作為后續(xù)的干預(yù)劑量。當(dāng)作用時間≥12 h時，HG-Exos組細(xì)胞活力均低于對照組，當(dāng)HG-Exos作用時間為48 h時，細(xì)胞存活率下降至52.3%±3.4%，見表2，將48 h作為后續(xù)干預(yù)時間。

Fig.3 Exos secreted by Raw264.7 cells were internalized by podocytes(immunofluorescence staining,×500;Scale=50 μm)圖3 Raw264.7細(xì)胞分泌Exos被足細(xì)胞內(nèi)化（免疫熒光染色，×500；比例尺=50 μm）

Tab.1 The cell viability of podocytes at different concentrations of HG-Exos determined by CCK-8 method表1 2組經(jīng)CCK-8法測定不同HG-Exos劑量干預(yù)后足細(xì)胞的細(xì)胞活力 （n=3，%，±s）

Tab.1 The cell viability of podocytes at different concentrations of HG-Exos determined by CCK-8 method表1 2組經(jīng)CCK-8法測定不同HG-Exos劑量干預(yù)后足細(xì)胞的細(xì)胞活力 （n=3，%，±s）

＊P＜0.05

組別對照組HG-Exos組t 0 mg/L 100.0±1.0 100.0±1.0 0.350 7 mg/L 99.0±1.5 80.0±3.6 2.264＊14 mg/L 100.0±1.2 61.0±2.5 3.051＊組別對照組HG-Exos組t 28 mg/L 101.0±1.3 50.0±2.8 3.433＊56 mg/L 100.0±1.1 35.0±3.3 4.579＊112 mg/L 100.0±1.0 11.0±2.4 5.837＊

Tab.2 The cell viability of podocytes exposed to HGExos at different time points determined by CCK-8 method圖2 2組經(jīng)CCK-8法測定不同HG-Exos干預(yù)時間后足細(xì)胞的細(xì)胞活力 （n=3，%，±s）

Tab.2 The cell viability of podocytes exposed to HGExos at different time points determined by CCK-8 method圖2 2組經(jīng)CCK-8法測定不同HG-Exos干預(yù)時間后足細(xì)胞的細(xì)胞活力 （n=3，%，±s）

＊P＜0.05

組別對照組HG-Exos組t 0 h 100.0±1.0 100.0±1.5 0.292 6 h 99.0±1.3 91.0±2.0 1.345 12 h 101.0±1.1 82.0±3.2 3.362＊24 h 100.0±1.2 67.0±2.3 4.178＊組別對照組HG-Exos組t 48 h 100.0±1.0 52.0±2.8 4.178＊72 h 101.0±1.0 41.0±3.5 4.765＊72 h 101.0±1.2 35.0±2.4 5.193＊

2.3 HG-Exos 通過抑制自噬誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷 Western blot 結(jié)果顯示，與0 mg/L HG-Exos 組比較，7 mg/L、14 mg/L 和28 mg/L HG-Exos 組足細(xì)胞中Nephrin、Beclin 1、LC3B 蛋白表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.05），見圖4。TEM 顯示，與0 mg/L HG-Exos組（7.7±1.0）比較，7 mg/L（5.4±0.8）、14 mg/L（3.8±0.7）和28 mg/L（1.8±0.4）HG-Exos 組含有雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體數(shù)量均顯著減少（F=32.163，P＜0.05），見圖5。

2.4 自噬對HG-Exos 細(xì)胞毒性的影響 Western blot 結(jié)果顯示，HG-Exos 組、氯喹組、HG-Exos+氯喹組Nephrin、Beclin 1、LC3B蛋白表達(dá)水平均明顯低于對照組（均P＜0.05）；雷帕霉素組、HG-Exos+雷帕霉素組Nephrin、Beclin 1、LC3B蛋白表達(dá)水平明顯高于HG-Exos 組、氯喹組和HG-Exos+氯喹組（P＜0.05）；HG-Exos 組、氯喹組和HG-Exos+氯喹組Nephrin、Beclin 1、LC3B 蛋白表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖6。TEM顯示，各組間自噬體數(shù)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=95.092，P＜0.05）。HG-Exos 組（1.60±0.45）、氯喹組（1.51±0.42）、HG-Exos+氯喹組（0.84±0.24）自噬體數(shù)量明顯少于對照組（7.22±1.34），雷帕霉素組（11.16±1.03）、HG-Exos+雷帕霉素組（6.96±0.87）自噬體數(shù)量明顯多于HG-Exos 組、氯喹組和HG-Exos+氯喹組（P＜0.05）；HG-Exos 組、氯喹組和HG-Exos+氯喹組自噬體數(shù)量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖7。

Fig.4 Effects of different concentrations of HG-Exos on the expressions of LC3B，Beclin 1 and Nephrin autophagy related proteins in podocytes detected by Western blot assay圖4 Western blot檢測不同劑量HG-Exos對足細(xì)胞中Nephrin、Beclin 1、LC3B蛋白表達(dá)的影響

Fig.5 Effects of different concentrations of HG-Exos on autophagy detected by transmission electron microscope (×60 000)圖5 TEM觀察不同劑量HG-Exos對自噬小體的影響（×60 000）

Fig.6 The effects of chloroquine,rapamycin and HG-Exos on the expressions of LC3B,Beclin 1 and Nephrin autophagy related proteins in podocytes detected by Western blot assay圖6 Western blot檢測6組足細(xì)胞中Nephrin、Beclin 1、LC3B蛋白的表達(dá)

Fig.7 The effects of chloroquine,rapamycin and HG-Exos on autophagy detected by transmission electron microscope(×60 000)圖7 TEM觀察氯喹、雷帕霉素和HG-Exos對自噬體的影響（×60 000）

3 討論

巨噬細(xì)胞是體內(nèi)外介導(dǎo)腎臟炎癥反應(yīng)最重要的免疫細(xì)胞之一［8］。有研究顯示，糖尿病小鼠腎臟巨噬細(xì)胞的活化與高血糖、糖化血紅蛋白、蛋白尿、腎小球和腎小管損傷程度呈正相關(guān)［9-10］。此外，糖尿病大鼠模型實驗證實了巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)與腎損傷嚴(yán)重程度密切相關(guān)［11］。但是,在糖尿病狀態(tài)下巨噬細(xì)胞和腎小球足細(xì)胞之間的通訊機制尚有待闡明。近年來，越來越多的證據(jù)表明，在生理和病理條件下，Exos可以將功能分子轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞上，并充當(dāng)細(xì)胞間聯(lián)系的介質(zhì)［12］。本研究結(jié)果顯示，HG處理的Raw264.7細(xì)胞產(chǎn)生的Exos數(shù)量明顯多于NG處理的Raw264.7細(xì)胞，且HG-Exos 可以劑量和時間依賴的方式降低足細(xì)胞的細(xì)胞活力；此外，與對照組相比，HG-Exos 降低了足細(xì)胞中Beclin 1、LC3B蛋白表達(dá)水平，并減少了自噬小體數(shù)量，提示HG-Exos具有通過減少自噬而損傷足細(xì)胞的能力。以上結(jié)果表明在糖尿病中，Exos 介導(dǎo)巨噬細(xì)胞與足細(xì)胞的相互作用，參與DN的發(fā)病機制。足細(xì)胞是位于腎小球基底膜的高度分化的細(xì)胞，參與維持腎小球濾過屏障，所有形式的腎病綜合征均以足細(xì)胞異常為特征［13］。足細(xì)胞狹縫橫隔膜控制著腎小球濾過屏障的結(jié)構(gòu)和功能。由狹縫橫隔膜表達(dá)的Nephrin 蛋白對濾過屏障的完整性具有重要作用，其可作為足細(xì)胞的標(biāo)志物，并已被證實與蛋白尿有關(guān)［14］。本研究結(jié)果顯示，7 mg/L、14 mg/L和28 mg/L HG-Exos刺激后，Nephrin蛋白表達(dá)水平明顯低于0 mg/L HG-Exos 組，提示HG-Exos刺激后足細(xì)胞出現(xiàn)損傷跡象。

自噬是一種高度保守的溶酶體途徑，參與受損細(xì)胞器的清除。自噬失調(diào)導(dǎo)致多種疾病的發(fā)病，包括癌癥、神經(jīng)變性、心臟病和某些腎臟疾病［15］。近年來研究表明，足細(xì)胞中自噬的激活可能是預(yù)防DN進(jìn)展的潛在治療選擇［16-17］。以往研究證明了可通過增強自噬水平對HG 誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷發(fā)揮保護(hù)作用［18］。Beclin 1和LC3B是調(diào)節(jié)自噬體膜的必需蛋白質(zhì)。LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值與自噬體數(shù)目呈正相關(guān)。上調(diào)Beclin 1、LC3B 蛋白表達(dá)可減輕HG-Exos對足細(xì)胞的損傷。據(jù)報道，抑制自噬與足細(xì)胞去分化有關(guān)，自噬缺陷促進(jìn)足細(xì)胞損傷［19］。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，HG-Exos刺激可以劑量依賴的方式導(dǎo)致自噬體數(shù)量減少，提示HG-Exos 的劑量上調(diào)與自噬的下調(diào)有關(guān)，從而導(dǎo)致足細(xì)胞損傷。為了進(jìn)一步研究HG-Exos對自噬介導(dǎo)的足細(xì)胞損傷的抑制作用，采用自噬抑制劑氯喹或mTOR 抑制劑雷帕霉素與HG-Exos 進(jìn)行聯(lián)合處理。結(jié)果顯示，HGExos+雷帕霉素組Nephrin、Beclin 1、LC3B 蛋白表達(dá)水平以及自噬體數(shù)量明顯高于HG-Exos 組，提示雷帕霉素可減弱HG-Exos 的細(xì)胞毒性。因此，再次驗證HG-Exos通過降低足細(xì)胞內(nèi)的自噬水平誘導(dǎo)細(xì)胞損傷。

綜上所述，HG 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞Exos 可以劑量和時間依賴性地降低細(xì)胞活力和增加足細(xì)胞損傷。此外，HG 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞Exos 能有效地降低足細(xì)胞自噬，誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷，雷帕霉素聯(lián)合治療可挽救足細(xì)胞損傷。本研究為HG誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞Exos引起腎損傷提供了一個新的治療靶點，但尚需進(jìn)一步闡明參與自噬激活的特定分子機制和信號途徑。