張靖悅 趙恒俠 陳宇陽 連李榮

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院2019級碩士研究生，廣東 深圳 518033)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是育齡期女性常見的以高雄激素及持續(xù)無排卵或排卵障礙為特征的內(nèi)分泌代謝異常的疾病，長期可導(dǎo)致生殖功能障礙，增加子宮內(nèi)膜癌、心腦血管等疾病發(fā)病風(fēng)險[1]。目前，PCOS發(fā)病機(jī)制尚不明確，胰島素抵抗、低度炎性反應(yīng)等與PCOS的發(fā)生相關(guān)[2]。西醫(yī)治療PCOS常對癥予促排卵、調(diào)節(jié)月經(jīng)周期、增加胰島素敏感性等，但效果一般且有毒副作用[3]。

中藥具有多成分、多靶點的特點，防治PCOS有一定優(yōu)勢。趙恒俠教授認(rèn)為，痰濁阻滯為PCOS發(fā)病的主要病機(jī)，以輕清荷葉為君藥，自擬“荷芪散(主要藥物：荷葉、黃芪、蒼術(shù)、香附、郁金、決明子等)”健脾除濕、升清降濁治療PCOS。前期實驗及臨床觀察證實，荷芪散具有改善PCOS大鼠及PCOS患者胰島素抵抗、糖脂代謝，糾正性激素紊亂等作用，但缺少方中中藥單體作用機(jī)制的研究[4-6]。

荷葉的有效成分主要包括生物堿類及黃酮類等[7-8]，其中荷葉堿為荷葉中富含的一種異喹啉類生物堿，是荷葉發(fā)揮藥理作用的重要成分。目前研究證明，荷葉堿可減輕體質(zhì)量，改善胰島素抵抗[9]，減緩炎性反應(yīng)[10]，因此推測荷葉堿可通過提高胰島素敏感性及干預(yù)炎性反應(yīng)起到治療PCOS的作用。但荷葉堿作用靶點及通路眾多，傳統(tǒng)藥理學(xué)研究思維方法單一，難以進(jìn)行全面系統(tǒng)的分析。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以生物信息學(xué)、藥理學(xué)、生物學(xué)等學(xué)科為基礎(chǔ)，通過建立“成分-靶點-疾病”模型，全面、系統(tǒng)、多維度分析藥物作用的潛在分子機(jī)制，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用[11]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究荷葉堿對PCOS的作用靶點及通路，為后續(xù)研究提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 荷葉堿結(jié)構(gòu)及作用靶點獲取 ①利用Pubchem數(shù)據(jù)庫(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)以“Nuciferin“為關(guān)鍵詞檢索獲取荷葉堿的3D結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch)得到荷葉堿的相關(guān)靶點；②利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, TCMSP)(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)以“Nuciferin”為關(guān)鍵詞，檢索項為“Chemical Name”進(jìn)行檢索，獲取荷葉堿的靶點。將上述2個來源的靶點匯總?cè)ブ睾蟮玫胶扇~堿的相關(guān)靶點，利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org)將靶點名稱進(jìn)行基因標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2 PCOS疾病靶點獲取 在GeenCard數(shù)據(jù)庫(The Human Gene Database，http://www.genecards.org)、OMMI數(shù)據(jù)庫(http://www.omim.org)輸入“polycystic ovary syndrome”檢索，獲得PCOS的疾病相關(guān)靶點，匯總?cè)ブ睾罄肬niprot數(shù)據(jù)庫規(guī)范靶點。

1.3 成分-疾病共同靶點篩選 借助Venny 2.1.0(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)在線工具將1.1項中獲得的荷葉堿相關(guān)靶點與1.2項中獲得的PCOS疾病靶點進(jìn)行比對，取交集，并借助Venny 2.1.0在線工具繪制Venn圖，利用Cytoscape軟件建立“成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 荷葉堿治療PCOS靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將1.3項中獲得的荷葉堿與PCOS疾病共同靶點基因輸入STRING數(shù)據(jù)庫，選擇物種為“Homo sapiens”，隱藏游離位點，其余默認(rèn)選項，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)，并用Cytoscape 3.8.1的Network Analyzer功能分析其網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，得到主要靶點并可視化。運用R語言軟件繪制度(Degree)值前30位靶點(即核心靶點)的柱狀圖。

1.5 基因本體(gene ontology，GO) 功能富集分析及京都基因與基因組百科全書(kyotoencyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析 利用R軟件的ClusterProfiler包將荷葉堿與PCOS的共同靶點進(jìn)行GO功能富集分析以描述基因靶點的功能，包括生物過程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)和細(xì)胞組成(cellular component，CC)，并對交集基因進(jìn)行KEGG通路富集分析以探討荷葉堿作用的信號通路。GO功能富集分析和KEGG通路富集分析均以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義，并用微生信平臺繪制條形圖，根據(jù)富集分析結(jié)果進(jìn)一步探究荷葉堿治療PCOS的分子機(jī)制。

1.6 成分-靶點分子對接 通過TCMSP下載荷葉堿結(jié)構(gòu)的mol2格式文件，使用AutoDock對其進(jìn)行加氫、加電子等修飾操作，以pdbqt文件格式輸出，利用PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org)獲取核心靶點蛋白3D結(jié)構(gòu)的pdb格式文件，使用AutoDock軟件去水、加氫、加電子后輸出pdbqt格式文件，最后使用AutoDock對以上蛋白進(jìn)行分子對接并獲得相應(yīng)結(jié)合能(binding energy，BE)，并利用Pymol軟件將結(jié)果進(jìn)行可視化。通過BE評價靶點與蛋白之間的結(jié)合活性，BE越低，結(jié)合活性越大，發(fā)生作用可能性越大。

2 結(jié)果

2.1 靶點獲取結(jié)果 通過Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫及TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索荷葉堿有效靶點，匯總?cè)ブ睾蠊驳玫?3個靶點，利用GeenCard數(shù)據(jù)庫和OMMI數(shù)據(jù)庫檢索PCOS疾病靶點，匯總?cè)ブ睾蠊驳玫?575個靶點。

2.2 成分-疾病共同靶點篩選結(jié)果 將2.1項中獲得的荷葉堿靶點與PCOS疾病靶點比對取交集后得到交集靶點36個，推測這些靶點可能是荷葉堿治療PCOS的潛在靶點，見表1、圖1；“成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。

表1 荷葉堿治療PCOS潛在靶點

圖1 荷葉堿-PCOS交集靶點Venn圖

圖2 “成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 荷葉堿治療PCOS靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果 將交集靶點輸入STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，并利用Cytoscape 3.8.1可視化，生成荷葉堿治療PCOS靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。PPI網(wǎng)絡(luò)中除去游離靶點DDP4、NR4A1、FDFT1，共得到33個節(jié)點，146條邊，其中節(jié)點圖標(biāo)越大，顏色越深接近墨綠色則在網(wǎng)絡(luò)中作用越大，邊越粗表明相互作用關(guān)系越強。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鍪荆W(wǎng)絡(luò)平均度值為8.11，度值越高，表明越傾向為關(guān)鍵蛋白，度值排名前30的靶點繪制核心靶點基因條形圖(見圖4)，推測SLC6A4、DRD2、MAOA、OPRM1、SLC6A3為荷葉堿治療PCOS的核心靶點。

圖3 荷葉堿治療PCOS靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 核心靶點基因度值條形圖

2.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析結(jié)果 GO功能富集分析共獲得1230個條目，其中MF 77個，包括DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、核受體活性、蛋白激酶活性、氧化還原酶活性、泛素蛋白連接酶結(jié)合、核受體結(jié)合、整合素結(jié)合等；BP 1115個，包括對激素的反應(yīng)、對無機(jī)物的反應(yīng)、對凋亡信號通路的調(diào)控、對缺氧的反應(yīng)等；CC 38個，包括質(zhì)膜蛋白復(fù)合物、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合體、髓鞘、囊泡腔、線粒體外膜、質(zhì)膜外側(cè)等，按照-lgP值由大到小排序，對排名前10位的條目進(jìn)行展示，見圖5。KEGG通路富集分析共得到149條通路(P<0.05)，涉及神經(jīng)活性配體-受體相互作用(Neuroactive ligand-receptor interaction)、5-羥色胺能突觸(Serotonergic synapse)、鈣信號通路(Calcium signaling pathway)、多巴胺能突觸(Dopaminergic synapse)、cAMP信號通路(cAMP signaling pathway)，按-lgP值由大到小排序，對排名前20的通路進(jìn)行展示，見圖6。

圖5 GO功能富集分析條形圖

圖6 KEGG通路富集分析條形圖

2.5 成分-靶點分子對接結(jié)果 將荷葉堿活性成分與SLC6A4、DRD2、MAOA、OPRM1、SLC6A3 5個核心靶點進(jìn)行分子對接，見表2、圖7。結(jié)果顯示，荷葉堿與上述5種核心靶點蛋白均能良好結(jié)合。

表2 核心靶點與荷葉堿分子對接結(jié)果

圖7 SLC6A4、DRD2、MAOA、OPRM1、SLC6A3與荷葉堿分子對接圖

3 討論

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理的方法，對荷葉堿治療PCOS進(jìn)行系統(tǒng)全面的研究。結(jié)果顯示，荷葉堿治療PCOS的潛在靶點有36個，SLC6A4、DRD2、MAOA、OPRM1、SLC6A3為荷葉堿治療PCOS的核心靶點，可能通過5-羥色胺能突觸、多巴胺能突觸等發(fā)揮作用。分子對接研究結(jié)果表明，荷葉堿與SLC6A4、DRD2、MAOA、OPRM1、SLC6A3靶點的BE均小于-5 kcal/mol，均可生成氫鍵，說明其與潛在靶點的結(jié)合性較高，因此推測，荷葉堿未來可能成為治療PCOS的有效化合物之一，可為新藥的研發(fā)提供新思路。

5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)是單胺類化合物，又稱血清素，主要由腸嗜鉻細(xì)胞合成，作為一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，廣泛存在于大腦皮層及神經(jīng)突觸內(nèi)[12]。隨著研究的不斷進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)5-HT在中樞神經(jīng)系統(tǒng)之外的許多系統(tǒng)如內(nèi)分泌代謝系統(tǒng)等皆發(fā)揮著重要作用[12]。視前區(qū)(POA)和內(nèi)側(cè)基底下丘腦(MBH)控制排卵期前黃體生成激素(LH)和排卵數(shù)量的增加，而POA和MBA受來自腦干下部5-HT分泌的影響[13]。Maekawa F等[14]研究表明，位于腦干的中縫背核在誘導(dǎo)LH峰和排卵中起重要作用，5-HT受體系統(tǒng)參與了這一機(jī)制。唐怡等[15]和王建紅等[16]研究表明，慢性刺激使5-HT含量下降，雌性鼠的促性腺激素釋放激素(GnRH)含量亦下降。因此，5-HT與性激素分泌及女性排卵有一定相關(guān)性。

多巴胺(DA)系統(tǒng)是維持GnRH和LH基礎(chǔ)分泌的重要因素?，F(xiàn)有研究認(rèn)為，可能由于體內(nèi)類固醇激素水平的不同，DA對GnRH的釋放有雙向調(diào)控作用，即雌激素水平高時抑制GnRH的分泌，雌激素水平低時促進(jìn)GnRH的分泌。PCOS患者表現(xiàn)為高雄激素血癥，較高水平的雄激素在芳香化酶的作用下轉(zhuǎn)化為較多的雌二醇和雌酮，因此多數(shù)研究認(rèn)為，DA對PCOS患者GnRH有較強的抑制作用。國內(nèi)外許多研究表明，PCOS患者表現(xiàn)為中樞性DA減少，從而引起LH異常分泌[18-19]。此外，PCOS患者多合并肥胖，而5-HT和DA神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)可通過調(diào)節(jié)食欲改善肥胖[20]。5-HT影響肝臟局部的脂質(zhì)儲存，而不影響全身能量平衡[21]。5-HT還被發(fā)現(xiàn)通過HTR2A在脂肪組織中誘導(dǎo)脂肪生成[22]。DA作用的發(fā)揮很大程度上受3種酶COMT、MAOA和MAOB以及SLC6A3控制[23]。其中，MAOA還有平衡大腦中5-HT分泌的作用[24]。Need A C等[23]在一項研究對象均為女性的研究中發(fā)現(xiàn)，MAOA基因型與體質(zhì)量和體質(zhì)量指數(shù)(BMI)均顯著相關(guān)，MAOA在肥胖者中表現(xiàn)為過量的低活性基因型。DRD2多態(tài)性亦與體質(zhì)量相關(guān)[25]。

OPRM1是阿片類受體，廣泛存在于大腦和機(jī)體的其他外周組織中。內(nèi)源性阿片肽作為下丘腦GnRH分泌的抑制性調(diào)節(jié)劑，對卵巢功能有著重要的影響[26]。阿片類藥物活性升高在高雄激素血癥、高胰島素血癥的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用，長期阿片受體阻斷治療可以使高雄激素血癥婦女的高胰島素血癥恢復(fù)正常[27]。內(nèi)源性阿片類受體參與改善運動誘導(dǎo)的胰島素抵抗，外周阿片類受體激活有助于改善受損的受體后胰島素信號通路[28]。因此，推測OPRM1可以改善PCOS患者高雄激素血癥以及胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。

綜上，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法證實了荷葉堿通過多靶點、多通路治療PCOS，對實驗結(jié)果預(yù)測的核心靶點與荷葉堿進(jìn)行分子對接均有良好的結(jié)合活性，結(jié)果與現(xiàn)有文獻(xiàn)報道相吻合。進(jìn)一步證明了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的可靠性，為進(jìn)一步實驗和臨床研究提供了理論參考依據(jù)。但網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可能存在疾病、藥物靶點數(shù)據(jù)庫信息不全等不足，因此仍需進(jìn)一步開發(fā)健全完善精度更高的中藥挖掘技術(shù)。