王定鋒，李良德，李慧玲，張輝，吳光遠(yuǎn)

一株對(duì)茶麗紋象甲高毒力白僵菌菌株的篩選、鑒定與培養(yǎng)研究

王定鋒，李良德，李慧玲，張輝，吳光遠(yuǎn)*

福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，福建 福州 350013

茶麗紋象甲（）是一種重要的茶樹害蟲，當(dāng)前對(duì)其防治仍以化學(xué)手段為主。為尋找一種高效、安全和可持續(xù)的生物防治方法，本研究采用浸蟲法從12株原寄主為鞘翅目昆蟲的白僵菌spp.中篩選出一株對(duì)茶麗紋象甲成蟲高毒力的Bbr1552菌株。室內(nèi)生物測(cè)定結(jié)果表明，用每毫升含5.0×107個(gè)孢子的孢懸液（25℃）處理茶麗紋象甲成蟲的LT50值為4.49?d，處理7?d，茶麗紋象甲的累計(jì)校正死亡率為100%，僵蟲率為69.44%，LC50值為每毫升1.55×106個(gè)孢子。對(duì)菌株Bbr1552進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定與rDNA-ITS序列和Bloc序列分析，明確其為布氏白僵菌。此外，對(duì)該菌株的最適培養(yǎng)基和培養(yǎng)溫度研究發(fā)現(xiàn)，其最適生長(zhǎng)和產(chǎn)孢培養(yǎng)基均為PPDA培養(yǎng)基；最適生長(zhǎng)和產(chǎn)孢溫度均為25℃。

茶麗紋象甲；布氏白僵菌；毒力；鑒定；培養(yǎng)條件

茶麗紋象甲（Voss）屬鞘翅目（Coleoptera）象甲科（Curculionidae），又名茶葉象甲、茶小綠象甲，俗稱“茶鱟”，是一種重要的茶樹害蟲。該蟲在中國(guó)各茶區(qū)均有分布，并在局部茶區(qū)為害嚴(yán)重。其主要以成蟲嚼食茶樹葉片形成不規(guī)則弧形缺刻，既影響茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)，又損傷樹勢(shì)，對(duì)綠茶區(qū)的夏茶和烏龍茶區(qū)的春茶為害尤為嚴(yán)重。除茶樹外，還為害油茶、桃、梨等多種經(jīng)濟(jì)作物[1-3]。當(dāng)前，茶麗紋象甲田間防治主要仍以化學(xué)防治為主[3-6]，而由此引起的農(nóng)業(yè)“3R”（農(nóng)藥殘留、有害生物再度猖獗及生物抗藥性）問(wèn)題阻礙了茶產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。隨著人們對(duì)茶葉食品安全問(wèn)題的重視，急需尋找對(duì)該蟲有效，對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類健康安全、無(wú)害的防治方法。

白僵菌（）是一類重要的昆蟲病原真菌，包含20多個(gè)種[7-11]；其屬內(nèi)常見(jiàn)種球孢白僵菌（）和布氏白僵菌（）在多種農(nóng)林害蟲生物防治中發(fā)揮重要作用[12]。據(jù)報(bào)道，全球（除中國(guó)外）先后有171個(gè)真菌殺蟲劑產(chǎn)品問(wèn)世，其中以球孢白僵菌和布氏白僵菌為有效成分的制劑分別占33.9%和4.1%[13]。我們?cè)谇捌诘难芯恐幸押Y選到一株對(duì)茶麗紋象甲高毒力球孢白僵菌菌株[14]，為篩選出更多對(duì)茶麗紋象甲高毒力的白僵菌菌株，以便更好地開發(fā)出相應(yīng)的生防菌劑，本研究利用室內(nèi)生物測(cè)定法從12株分離自鞘翅目昆蟲的白僵菌中篩選出一株對(duì)茶麗紋象甲高毒力的菌株，并對(duì)該菌株的分類歸屬和培養(yǎng)特性進(jìn)行了研究，旨在為今后更好地利用白僵菌防治茶麗紋象甲及其他鞘翅目害蟲奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

本試驗(yàn)所用的12株白僵菌菌株，原寄主均為鞘翅目害蟲（表1），保存于超低溫冰箱（–70℃）中。所有供試菌株均采用SDAY培養(yǎng)基在25℃下培養(yǎng)活化備用。

1.2 供試蟲源

2016年5月3日，于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所2號(hào)山茶葉試驗(yàn)基地（27.21N，119.57E）選擇茶麗紋象甲發(fā)生嚴(yán)重的地塊。采用茶行間鋪塑料膜震落法，從前一天預(yù)先拍打收集過(guò)一次的固定茶行中再拍打一遍，收集同日齡成蟲（茶麗紋象甲成蟲具有陸續(xù)出土為害的特性），帶回養(yǎng)蟲室[溫度25℃，相對(duì)濕度（RH）80%]用新鮮茶梢飼養(yǎng)于網(wǎng)兜中。1?d后挑取健康活潑、大小基本一致的成蟲用于后續(xù)生物測(cè)定試驗(yàn)。

表1 供試菌株

1.3 培養(yǎng)基配制

薩氏培養(yǎng)基（SDAY）：蛋白胨10?g、葡萄糖40?g、酵母10?g、瓊脂20?g，補(bǔ)充蒸餾水至1?000?mL。1/4 SDAY培養(yǎng)基：除瓊脂外，其余成分都為SDAY培養(yǎng)基的1/4。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200?g煮沸過(guò)濾液、葡萄糖20?g、瓊脂20?g，加熱溶解后補(bǔ)充蒸餾水至1?000?mL。蛋白胨馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PPDA）：在PDA培養(yǎng)基中添加1%蛋白胨。察氏培養(yǎng)基（Czapek）：NaNO33?g、K2HPO41?g、KCl 0.5?g、MgSO4·7H2O 0.5?g、FeSO4·7H2O 0.01?g、蔗糖30?g、瓊脂15?g，蒸餾水1?000?mL。上述培養(yǎng)基的pH值均為7.0，高壓滅菌鍋121℃滅菌20?min。

1.4 茶麗紋象甲成蟲毒力測(cè)定

1.4.1 不同菌株對(duì)茶麗紋象甲成蟲的毒力測(cè)定

從SDAY平板上分別收集培養(yǎng)了15?d的各菌株分生孢子，并將各孢子粉用0.05% Tween-80溶液分別配成每毫升5.0×107個(gè)孢子的孢懸液。采用王定鋒等[14]浸蟲法處理茶麗紋象甲，每個(gè)菌株作為1個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)12頭茶麗紋象甲成蟲；以0.05% Tween-80處理作為對(duì)照。接種后放置在人工氣候箱中（25℃，RH=90%，12L/12D）培養(yǎng)，每2?d更換一次新的茶梢。接菌完第2天起，每天定時(shí)觀察處理組和對(duì)照組茶麗紋象甲存活情況并記錄；將蟲尸轉(zhuǎn)移至無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)保濕培養(yǎng)，并觀察是否有真菌菌絲長(zhǎng)出。死亡率、校正死亡率和僵蟲率計(jì)算公式如下：

1.4.2 不同濃度Bbr1552菌株對(duì)茶麗紋象甲成蟲的毒力測(cè)定

從1.4.1章節(jié)結(jié)果中挑選出對(duì)茶麗紋象甲毒力最強(qiáng)的菌株，并按照1.4.1章節(jié)孢懸液配制法配成5個(gè)濃度梯度（每毫升5.0×107、1.0×107、5.0×106、1.0×106、5.0×105個(gè)孢子）接種茶麗紋象甲成蟲。每個(gè)濃度為1個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15頭象甲成蟲，以0.05% Tween-80處理作為對(duì)照。試蟲的處理方法、飼養(yǎng)條件和死亡率計(jì)算等方法同1.4.1章節(jié)。

1.5 菌株Bbr1552的分類鑒定

1.5.1 形態(tài)學(xué)鑒定

將菌株Bbr1552接種于PDA培養(yǎng)基上，25℃，12L/12D下培養(yǎng)8?d；并觀察菌落形態(tài)特征、菌株產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和分生孢子形態(tài)等顯微結(jié)構(gòu)。

1.5.2 白僵菌Bbr1552菌株的分子鑒定

采用引物ITS5（5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'）/ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）[15]與引物B5.1F（5'-CGACCCGGCCAACTACTTTGA-3'）/B3.1R（5'-GTCTTCCAGTACCACTACGCC-3'）[16]分別從Bbr1552基因組中PCR擴(kuò)增rDNA-ITS序列與Bloc序列。兩個(gè)序列的PCR反應(yīng)體系均為：2×Mix 10?μL，模板DNA 1?μL，引物（10?mmoL）各1?μL，ddH2O 12?μL，合計(jì)25?μL。PCR反應(yīng)程序均為：94℃預(yù)變性5?min；94℃變性30?s，58℃退火30?s，70℃延伸30?s，30個(gè)循環(huán)；70℃延伸5?min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，使用凝膠回收試劑盒（天根）純化回收后，委托鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司進(jìn)行核苷酸測(cè)序。通過(guò)NCBI Blast程序分別將rDNA-ITS序列和Bloc序列測(cè)序結(jié)果進(jìn)行初步分析。選擇Rehner等[7]報(bào)道中分類地位明確的14種白僵菌（球孢白僵菌，布氏白僵菌，，，，，，，，，，，和.）的rDNA-ITS序列和Bloc序列，并以蟬棒束孢（）相應(yīng)序列為外源種。按照Mega 4.0軟件中鄰接法（Neigbor-joining method，NJ）分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并用Bootstrap（1?000次重復(fù)）對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行檢驗(yàn)[17]。

1.6 最適培養(yǎng)基和最適培養(yǎng)溫度的篩選

1.6.1 菌株Bbr1552在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)與產(chǎn)孢試驗(yàn)

參照1.4.1章節(jié)方法收集Bbr1552分生孢子，并配成每毫升1.0×106個(gè)孢子的孢懸液。然后用移液器將2?μL孢懸液分別點(diǎn)植于SDAY培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、PPDA培養(yǎng)基、1/4SDAY培養(yǎng)基和Czapek培養(yǎng)基平板中央。每種培養(yǎng)基為1個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)，于25℃，14L/10D下培養(yǎng)14?d。菌落直徑采用直尺十字交叉法測(cè)量；產(chǎn)孢量采用菌塊測(cè)定法，即從菌落中心至邊緣距離的1/2處用打孔器（直徑6?mm）打取菌塊，置于0.05% Tween-80溶液充分?jǐn)嚢?，并用血球?jì)數(shù)板觀察，計(jì)算單位面積產(chǎn)孢量。

1.6.2 菌株Bbr1552在不同溫度下的生長(zhǎng)與產(chǎn)孢試驗(yàn)

參照1.6.1章節(jié)菌液點(diǎn)植法，將孢懸液（每毫升1.0×106個(gè)孢子）接種于PPDA平板上，然后分別置于5個(gè)不同溫度（15、20、25、30℃和35℃）下，光照（14L/10D）培養(yǎng)14?d。每個(gè)溫度為1個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)。培養(yǎng)14?d后，菌落直徑和產(chǎn)孢量測(cè)定參照1.6.1章節(jié)。

1.7 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。不同白僵菌菌株對(duì)茶麗紋象甲成蟲的校正死亡率和僵蟲率分析前先進(jìn)行反正弦平方根轉(zhuǎn)換，并利用Tukey多重比較檢驗(yàn)試驗(yàn)數(shù)據(jù)差異顯著性；接種濃度和處理時(shí)間對(duì)茶麗紋象甲的死亡率影響情況采用雙因素方差分析；茶麗紋象甲的致死中時(shí)（LT50）和致死中濃度（LC50）采用probit方法計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同白僵菌菌株對(duì)茶麗紋象甲成蟲的毒力

由表2可知，供試的12株白僵菌對(duì)茶麗紋象甲成蟲的毒力存在顯著差異（<0.05），茶麗紋象甲死亡率為35.15%~100%，僵蟲率為0%~69.44%，LT50值為4.59~7.78?d。雖然大部分菌株處理后，茶麗紋象甲的僵蟲率較低，只有菌株Bbr1552的僵蟲率超過(guò)60%，但菌株Bbr1527、Bbr1573、Bbr1552、Bbr1581、Bbr1563、Bbr1578、Bbr1571和Bbr1514對(duì)茶麗紋象甲成蟲的校正死亡率都大于90%，LT50值小于5.59?d，顯示出較強(qiáng)的殺蟲毒力。綜合校正死亡率、LT50值和僵蟲率3個(gè)指標(biāo)，在12個(gè)菌株中，菌株Bbr1552對(duì)茶麗紋象甲成蟲具有最強(qiáng)的殺蟲毒力，校正死亡率達(dá)100%，LT50值達(dá)4.59?d，僵蟲率達(dá)69.44%。

2.2 不同濃度Bbr1552對(duì)茶麗紋象甲成蟲的毒力試驗(yàn)結(jié)果

白僵菌的接種濃度和茶麗紋象甲的處理時(shí)間對(duì)茶麗紋象甲的死亡率分析結(jié)果表明，白僵菌的接種濃度（5,72=124.49，<0.01）、茶麗紋象甲的處理時(shí)間（5,72=147.34，<0.01）以及兩者的交互作用（25,72=8.08，<0.01）均極顯著影響茶麗紋象甲成蟲的死亡率。由圖2可知，隨著白僵菌Bbr1552接種濃度的增大，茶麗紋象甲成蟲的累計(jì)死亡率不斷增高，呈現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)。低濃度孢懸液（每毫升5.0×105個(gè)孢子）處理7?d，茶麗紋象甲累計(jì)死亡率僅為22.22%。中濃度孢懸液（每毫升5.0×106、1.0×106個(gè)孢子）處理時(shí)，從第5天開始，茶麗紋象甲死亡率才開始大量增加，第7天累計(jì)死亡率分別為64.44%和51.11%。高濃度孢懸液（每毫升5.0×107個(gè)孢子）處理時(shí)，第4天茶麗紋象甲就開始大量死亡；處理7?d的累計(jì)死亡率達(dá)100%。從死亡率隨時(shí)間變化的趨勢(shì)來(lái)看（圖1和表3），同一接種濃度下，茶麗紋象甲成蟲死亡率隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐步增大。LT50值隨著孢懸液濃度的增加而遞減，當(dāng)孢子濃度為每毫升5.0×105~5.0×107個(gè)孢子時(shí)，LT50值為8.912~4.493?d；處理7?d，茶麗紋象甲成蟲累計(jì)死亡率為22.22%~100%。從SPSS軟件計(jì)算得到白僵菌Bbr1552處理麗紋象甲7?d的LC50值為每毫升1.55×106個(gè)孢子，95%置信限為每毫升3.49×105~3.86×106個(gè)孢子。

表2 白僵菌不同菌株對(duì)茶麗紋象甲成蟲的毒力

注：數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示0.05水平上存在顯著差異

Note: Data were mean±SD. Date with different lowercase letters in the same column indicated significantly different at 0.05 level

圖1 不同孢子濃度Bbr1552對(duì)麗紋象甲成蟲的毒力

表3 不同孢子濃度Bbr1552對(duì)麗紋象甲成蟲的毒力

注：式中是幾率值，是時(shí)間的對(duì)數(shù)

Note:means probit,is log of time

2.3 白僵菌Bbr1552的鑒定

在PDA培養(yǎng)基上白僵菌Bbr1552菌落為白色粉狀，培養(yǎng)幾天后自菌落中心形成白色的孢子層（圖2-A）。顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)孢細(xì)胞單生，很少簇生；產(chǎn)孢軸纖細(xì)，膝狀彎曲，具小齒突；分生孢子透明、光滑、橢圓形，大小約為(2.5~3.5)?μm×(1~2)?μm（圖2-B）。白僵菌Bbr1552形態(tài)學(xué)特征符合《昆蟲真菌學(xué)》[12]中布氏白僵菌的特征，將該菌株初步鑒定為布氏白僵菌。

通過(guò)對(duì)白僵菌Bbr1552菌株的rDNA-ITS序列和Bloc序列PCR擴(kuò)增、測(cè)序，分別獲得長(zhǎng)度為557?bp和1?465?bp的基因片段。通過(guò)GenBank中Blast程序比對(duì)基因庫(kù)中的核酸序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Bbr1552菌株的rDNA-ITS序列相似性達(dá)100%的大部分序列為布氏白僵菌；而與Bbr1552菌株Bloc序列相似性達(dá)100%的大部分序列也是布氏白僵菌。對(duì)菌株Bbr1552的rDNA-ITS序列和Bloc序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，Bbr1552的rDNA-ITS序列與其他布氏白僵菌聚在一個(gè)較小的進(jìn)化分支上，Bootstrap值為72%，具有較高的同源性（圖3）；Bbr1552的Bloc序列也與其他布氏白僵菌聚在一個(gè)較小的進(jìn)化分支上，Bootstrap值為91%，具有很高的同源性（圖4）。綜合形態(tài)學(xué)鑒定和分子鑒定結(jié)果，判定Bbr1552菌株為布氏白僵菌。

2.4 菌株Bbr1552最適培養(yǎng)基和培養(yǎng)溫度

2.4.1 培養(yǎng)基對(duì)Bbr1552生長(zhǎng)速率和產(chǎn)孢量的影響

菌株Bbr1552生長(zhǎng)速率在各培養(yǎng)基之間存在顯著差異（<0.05），其中在PPDA上生長(zhǎng)速度最快，14?d菌落直徑達(dá)46.33?mm，是生長(zhǎng)速率最慢的PDA培養(yǎng)基的1.8倍。PPDA培養(yǎng)基最適合菌株Bbr1552產(chǎn)孢，培養(yǎng)14?d產(chǎn)孢量達(dá)每平方毫米3.96×105個(gè)孢子，顯著高于其他4種培養(yǎng)基；在PDA、1/4SDAY和Czapek上的產(chǎn)孢性能較差，且三者之間差異不顯著（圖5）?？傮w而言，菌株Bbr1552的最適生長(zhǎng)和最適產(chǎn)孢培養(yǎng)基均為PPDA培養(yǎng)基。

2.4.2 溫度對(duì)Bbr1552菌株生長(zhǎng)速度和產(chǎn)孢量的影響

菌株Bbr1552除了在35℃下不能生長(zhǎng)外，在其他幾個(gè)測(cè)試溫度下，菌株生長(zhǎng)速率存在顯著差異（<0.05）。在25℃下菌株生長(zhǎng)速度最快，培養(yǎng)14?d菌落直徑達(dá)46.33?mm，顯著高于其他溫度。菌株Bbr1552在20℃和25℃下產(chǎn)孢量較大，培養(yǎng)14?d產(chǎn)孢量分別達(dá)每平方毫米105個(gè)孢子和4.11×105個(gè)孢子，且兩者之間不存在顯著差異，但都與其他溫度（15℃和30℃）之間存在顯著差異（圖6）?？傮w而言，菌株Bbr1552的最適生長(zhǎng)和最適產(chǎn)孢溫度均為25℃。

注：A. PDA上25℃，生長(zhǎng)8?d的菌落。B. 產(chǎn)孢梗和分生孢子（400倍）

圖3 基于rDNA-ITS序列同源性的Bbr1552菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

蟲生真菌對(duì)靶標(biāo)害蟲的殺蟲毒力高低是判斷其生物防治潛力的重要指標(biāo)之一，也是菌株能否進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵。雖然依據(jù)菌落的形態(tài)特征、生長(zhǎng)速率、產(chǎn)孢量和蛋白酶等生物學(xué)特性可對(duì)蟲生真菌高效菌株開展初步篩選[18-19]，但直接通過(guò)室內(nèi)生物學(xué)測(cè)定方法篩選出對(duì)靶標(biāo)害蟲高毒力生防真菌菌株，其結(jié)果往往更直接、可靠[20-22]。本研究通過(guò)對(duì)12株白僵菌菌株進(jìn)行直接生物學(xué)測(cè)定，初步篩選發(fā)現(xiàn)Bbr1552菌株對(duì)茶麗紋象甲成蟲毒力最強(qiáng)；進(jìn)一步的毒力復(fù)測(cè)試驗(yàn)也表明Bbr1552菌株對(duì)茶麗紋象甲成蟲有很強(qiáng)的殺蟲毒力。該結(jié)果說(shuō)明直接生物學(xué)測(cè)定法是一種直接、可靠的高效菌株篩選方法?？紤]到蟲生真菌不同菌株對(duì)寄主可能存在?；詥?wèn)題，本研究選取的12株原寄主都是鞘翅目昆蟲的白僵菌菌株。研究結(jié)果表明，供試的12個(gè)白僵菌菌株中，菌株Bbr1527、Bbr1573、Bbr1552、Bbr1581、Bbr1563、Bbr1578、Bbr1571和Bbr1514等8個(gè)菌株對(duì)茶麗紋象甲成蟲具有較強(qiáng)的毒力，校正死亡率都大于90%，LT50值小于5.59?d。該研究結(jié)果與其他研究者發(fā)現(xiàn)的從原寄主或原寄主近緣種上分離的生防真菌菌株對(duì)靶標(biāo)害蟲往往具有更高毒力的結(jié)果相一致[22-24]。

圖4 基于Bloc序列同源性的Bbr1552菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

注：圖中同一指標(biāo)（相同顏色條形圖）上不同小寫字母表示在0.05水平上不同處理之間存在顯著差異。下同

注：圖中★和☆表示在35℃下菌株死亡，沒(méi)有生長(zhǎng)和產(chǎn)孢數(shù)值

白僵菌作為一個(gè)復(fù)合種，只依靠傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定方法往往難以取得理想的效果。近年來(lái)，rDNA-ITS、Bloc、RPB1、RPB2和TEF等標(biāo)記基因在白僵菌屬內(nèi)的隱秘種鑒定中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用，使得越來(lái)越多的新種被鑒定出來(lái)[7-11]。本研究在形態(tài)學(xué)初步明確Bbr1552菌株為布氏白僵菌的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步的利用rDNA-ITS和Bloc序列從分子生物學(xué)的角度對(duì)該菌株進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，該菌株為布氏白僵菌。研究結(jié)果進(jìn)一步豐富了針對(duì)茶麗紋象甲的生防真菌資源庫(kù)。Mega進(jìn)化樹構(gòu)建中，Bootstrap值大于70%相當(dāng)于統(tǒng)計(jì)學(xué)概率的95%，一般75%以上認(rèn)為是可信的[25]。從圖4可以看出，Bbr1552的Bloc序列與其他布氏白僵菌聚在一個(gè)較小的進(jìn)化分支上，Bootstrap值高達(dá)91%。Bbr1552的rDNA-ITS序列雖然與其他布氏白僵菌聚在一個(gè)較小的進(jìn)化分支上，但Bootstrap值僅72%（圖3）；這與Rehner等[7]報(bào)道的rDNA-ITS序列在白僵菌種內(nèi)建樹時(shí)包含信息較少的結(jié)果相一致。

本研究發(fā)現(xiàn)，布氏白僵菌Bbr1552菌株最適生長(zhǎng)和產(chǎn)孢培養(yǎng)基均為PPDA培養(yǎng)基，林華峰等[26]研究發(fā)現(xiàn)布氏白僵菌和金龜子綠僵菌兩變種的最適宜的培養(yǎng)基也均為PPDA。菌株Bbr1552的最適生長(zhǎng)和產(chǎn)孢溫度均為25℃，與Fargues等[27]研究結(jié)果相一致。而菌株Bbr1552孢懸液點(diǎn)植于PPDA平板上，在35℃時(shí)未能長(zhǎng)出菌落，說(shuō)明孢子在該溫度下不能萌發(fā)，這與前人報(bào)道的大多數(shù)真菌萌發(fā)的最適溫度范圍為20~30℃，在低于5℃或高于35℃條件下，一般不能萌發(fā)的結(jié)果較一致[28]。茶麗紋象甲成蟲發(fā)生期通常是在4—6月份，期間田間氣溫常接近或超過(guò)35℃，而本研究發(fā)現(xiàn)高毒力菌株Bbr1552在35℃時(shí)孢子不能萌發(fā)，這不利于菌劑的田間應(yīng)用。鑒于此，我們?cè)诶镁闎br1552防治麗紋象甲時(shí)應(yīng)該改變防治策略，避開成蟲發(fā)生的高溫季節(jié)；選擇氣溫較低的1—3月份進(jìn)行土壤施菌，針對(duì)茶麗紋象甲若蟲或者蛹，可能會(huì)取得較好的田間防治效果。

白僵菌具有對(duì)環(huán)境友好、害蟲不易產(chǎn)生抗藥性、易于培養(yǎng)和可持續(xù)控制害蟲等優(yōu)點(diǎn)[12]，在茶園害蟲生物防治中具有很大的應(yīng)用潛力。但與其他真菌殺蟲劑類似，其在田間應(yīng)用中易受到高溫[29]、紫外輻射[30]和昆蟲自身生理和行為調(diào)節(jié)[31]等逆境的影響，導(dǎo)致殺蟲速度較慢和田間防效不穩(wěn)定。針對(duì)上述弊端，我們?cè)诎捉┚苿┨镩g應(yīng)用時(shí)可以考慮把白僵菌制劑與其他化學(xué)農(nóng)藥或者植物源農(nóng)藥聯(lián)合使用，以期提高白僵菌殺蟲速度，并降低茶園化學(xué)農(nóng)藥的用量。此外，白僵菌制劑應(yīng)用時(shí)應(yīng)盡量選擇陰天或者傍晚以避開高溫和陽(yáng)光的直接照射。在人們對(duì)茶葉食品安全問(wèn)題關(guān)注度日益增加和我國(guó)政府大力提倡茶園農(nóng)藥減施的大背景下，積極開展以白僵菌等生物防治手段為主的茶園害蟲防控策略，可以有效解決茶葉食品安全和茶園農(nóng)藥的減量使用等問(wèn)題，對(duì)保障我國(guó)茶產(chǎn)業(yè)健康、可持續(xù)發(fā)展具有積極的意義。

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Screening, Identification and Culture Conditions of a High-virulent Isolate ofagainst

WANG Dingfeng, LI Liangde, LI Huiling, ZHANG Hui, WU Guangyuan*

Tea Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350013, China

(Coleoptera: Curculionidae) is one of the most important pests in tea plantation, and chemical control is the usual treatment method for this weevil at present. In order to explore alternative strategy for sustainable control of the weevil, dip method was employed to test the virulence of 12 isolates ofsp., which isolated from insects of Coleoptera. When inoculated with spore suspension (5.0×107spores·mL-1), the strain Bbr1552 showed the highest virulence against the adults of, which caused the highest corrected mortality rates of 100%, shortest LT50of 4.49?d and highest cadaver rates of 69.44%. The LC50value was 1.55×106spores·mL-1on 7?d (25℃) after inoculation with Bbr1552. According to morphological identification and analysis of rDNA-ITS and Bloc sequences, the strain Bbr1552 was identified to be aBesides, the PPDA medium and 25℃ were the most optimal conditions for the colony growth and sporulation of the strain Bbr1552.

,, virulence, identification, cultural condition

S571.1；S435.711

A

1000-369X(2021)01-101-12

2020-07-21

2020-11-01

福建省公益類科研院所基本科研專項(xiàng)（2019R1029-4）、福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所重點(diǎn)項(xiàng)目（2014-cys-02）、國(guó)家茶葉產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系咀嚼式害蟲防控崗位（CARS-19）

王定鋒，男，副研究員，主要從事害蟲生物防治研究。*通信作者：gywupt@163.com

（責(zé)任編輯：黃晨）