張佳韌，倪士明，王瑛琪

（黑龍江農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154002）

肥大細(xì)胞瘤（mast cell tumor，MCT）是犬最常見(jiàn)的皮膚圓形細(xì)胞腫瘤，7 歲以上犬高發(fā)［1］，可發(fā)生于身體任何部位的皮膚。 肥大細(xì)胞在脫顆粒過(guò)程中會(huì)釋放大量組胺，引發(fā)腫物周?chē)装Y，甚至導(dǎo)致消化道反應(yīng)［2-3］。由于MCT 的高發(fā)特點(diǎn)，有效地診斷及分級(jí)、分期變得非常必要。 細(xì)胞學(xué)檢查作為一種實(shí)用高效的診斷方法，已經(jīng)在人醫(yī)臨床及病理診斷中得到廣泛應(yīng)用。Ghisleni 等［4］比較了皮膚腫塊細(xì)胞學(xué)檢查和組織學(xué)檢查的一致性，得出細(xì)胞學(xué)檢查的敏感性和特異性分別為89.3%和97.9%。 何丹等［5］通過(guò)對(duì)犬貓皮膚腫瘤進(jìn)行細(xì)胞學(xué)與組織病理學(xué)聯(lián)合診斷研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞學(xué)檢查對(duì)圓形細(xì)胞瘤的診斷準(zhǔn)確率達(dá)100%。 由于現(xiàn)在肥大細(xì)胞瘤主流的診斷方法為病理組織學(xué)及免疫組織化學(xué)檢查，檢查流程較為繁瑣，成本較高，對(duì)診斷人員的專(zhuān)業(yè)水平要求也較高，不利于臨床推廣。 由于細(xì)胞學(xué)檢查操作流程較為簡(jiǎn)單，成本較低，診斷速度快，筆者希望通過(guò)對(duì)細(xì)胞學(xué)檢查與病理組織學(xué)檢查方法的比較，證明細(xì)胞學(xué)檢查對(duì)肥大細(xì)胞瘤具有診斷價(jià)值，從而對(duì)臨床上2 例犬皮膚腫瘤進(jìn)行細(xì)胞學(xué)與病理組織學(xué)診斷對(duì)照分析。

1 材料

1.1 樣品

來(lái)自病例1 的腫瘤和病例2 的腫瘤。

1.1.1 病例1 2019 年4 月， 犬主帶一只泰迪犬前來(lái)就診，病犬名為艾尼，13 歲公犬，體重4.9 kg。半年前發(fā)現(xiàn)該犬后肢有黃豆粒大小的結(jié)節(jié)， 最近幾個(gè)月增長(zhǎng)較快，用過(guò)外用藥（成分未知），用藥后結(jié)節(jié)縮小，但最近用藥效果不好，結(jié)節(jié)增長(zhǎng)較快。

臨床檢查：整體偏瘦，食欲有所降低，視診發(fā)現(xiàn)右后肢股骨后側(cè)存在1 個(gè)直徑2 cm 左右的腫物，表面發(fā)紅，中央接近破潰（如圖1 所示），觸診無(wú)明顯疼痛反應(yīng)，體表淋巴無(wú)明顯腫大，可視黏膜顏色無(wú)明顯異常。 實(shí)驗(yàn)室檢查僅顯示該犬存在輕度貧血和膽囊息肉，其他無(wú)明顯異常。

圖1 病例1 的腫瘤

1.1.2 病例2 2020 年6 月15 日， 犬主帶一只12 歲喜樂(lè)蒂犬前來(lái)就診。病史介紹：1 年前包皮頭部出現(xiàn)疑似腫物， 之后一直在增大， 近期生長(zhǎng)較快，并出現(xiàn)流膿現(xiàn)象，食欲、飲欲正常。 臨床檢查：身體偏胖，精神狀態(tài)良好，陰莖頭部包皮處存在雞蛋大小的腫物，包皮與龜頭間出現(xiàn)流膿現(xiàn)象，腫物頂部出現(xiàn)輕度破潰（見(jiàn)圖2）。 血常規(guī)檢查結(jié)果顯示該犬白細(xì)胞輕度升高， 血液生化指標(biāo)未見(jiàn)明顯異常。

1.2 主要試劑

Diff-Quik 染液，購(gòu)自德國(guó)納博科林診斷實(shí)驗(yàn)室。 福爾馬林、甲醛、乙醇、二甲苯、蘇木紫、伊紅、中性樹(shù)脂等，購(gòu)自沈陽(yáng)寵之康有限公司。

1.3 主要儀器

光學(xué)顯微鏡，購(gòu)于日本奧林巴斯；全自動(dòng)組織脫水機(jī)、切片機(jī)購(gòu)自北京百萬(wàn)電子科技中心；注射器，購(gòu)自丹麥古氏公司；載玻片購(gòu)于沈陽(yáng)寵之康有限公司。

圖2 病例2 的腫瘤

2 方法

2.1 細(xì)胞學(xué)檢查

針對(duì)2 個(gè)病例樣品均采用2 種收集方法。 腫物還在動(dòng)物體表時(shí)， 采用針刺細(xì)胞學(xué)的方式進(jìn)行收集：腫物表面剃毛，經(jīng)碘伏及酒精消毒后，使用20～22 G 針頭配合10 mL 注射器刺入，在保證同一刺入點(diǎn)的前提下， 通過(guò)改變注射器針頭進(jìn)入角度采樣，為保證檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性，需要多次采集；細(xì)胞樣品采用Diff-Quik 染液染色，使用光學(xué)顯微鏡反復(fù)觀察。腫瘤手術(shù)切除后，采用印片細(xì)胞學(xué)檢查的方式進(jìn)行多次采樣： 從中間切開(kāi)腫物后，使用無(wú)菌吸水濾紙吸干殘留的血跡及組織液后，使用載玻片多次按壓腫物切面獲取樣品， 為保證檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性，需要多次采集，收集到的樣品同樣使用Diff-Quik 染液染色，使用光學(xué)顯微鏡反復(fù)觀察。

2.2 病理學(xué)檢查

對(duì)于通過(guò)外科手術(shù)的方式切除的腫物， 使用生理鹽水徹底清洗，并對(duì)腫物進(jìn)行登記（見(jiàn)表1），進(jìn)行組織病理學(xué)觀察， 每個(gè)腫瘤取數(shù)塊1～1.5 cm3左右的組織塊， 放到10%的甲醛中固定， 常規(guī)脫水、浸蠟、包埋、切片，HE 染色，封片，使用光學(xué)顯微鏡觀察。

表1 腫物信息登記表

3 結(jié)果分析

3.1 細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果

2 份樣本均同時(shí)采用針刺細(xì)胞學(xué)與印片細(xì)胞學(xué)兩種方式進(jìn)行檢查，但結(jié)果無(wú)明顯差異。

病例1：細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果顯示，鏡下可見(jiàn)大量的圓形或橢圓形的有核細(xì)胞，細(xì)胞大小不一，細(xì)胞質(zhì)存在大量嗜堿性顆粒（見(jiàn)圖3），核質(zhì)比較大，細(xì)胞膜不清晰，偶見(jiàn)核仁，出現(xiàn)典型“荷包蛋”樣結(jié)構(gòu)（見(jiàn)圖4）。

病例2：細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果顯示，涂片背景存在血液成分，其中存在大量中性粒細(xì)胞（見(jiàn)圖5），少量的圓形及橢圓形有核細(xì)胞，大小均一，細(xì)胞異型性較小，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)存在大量嗜堿性顆粒，細(xì)胞核較為粗糙，部分細(xì)胞核存在核仁（見(jiàn)圖6 黑色箭頭），細(xì)胞邊界較清晰。

圖3 細(xì)胞存在大量的嗜堿性顆粒（10×40）

圖4 細(xì)胞大小不一、細(xì)胞膜不清晰（10×100）

圖5 大量的中性粒細(xì)胞（10×40）

圖6 細(xì)胞質(zhì)內(nèi)存在大量嗜堿性顆粒、核仁明顯（10×100）

參考Patnaik 分級(jí)體系和Kiupel 分級(jí)體系分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)： 病例1 腫瘤為Ⅲ級(jí)或高等級(jí)惡性肥大細(xì)胞瘤； 病例2 腫瘤為Ⅰ級(jí)或低等級(jí)的良性肥大細(xì)胞瘤。

3.2 病理學(xué)檢查結(jié)果

3.2.1 病例1 腫物病理剖檢變化 表面出現(xiàn)乳頭樣結(jié)構(gòu)，腫物表面中心出現(xiàn)輕度破潰，少量滲出；腫物周?chē)つw泛紅，脫毛（見(jiàn)圖1）。 腫物切面與肌肉部分存在包膜，部分浸潤(rùn)生長(zhǎng)。

3.2.2 病例2 腫物病理剖檢變化 皮膚表面較為平滑，腫物生長(zhǎng)在陰莖頭部的包皮下方（見(jiàn)圖2），質(zhì)地堅(jiān)實(shí)。 腫物與肌肉存在粘連，中間部分化膿，存在膿汁，存在包囊。

3.2.3 病例1 病理組織學(xué)觀察 鏡下觀察可見(jiàn)，腫瘤團(tuán)塊為部分包被、部分與周邊界線不明顯，一部分腫瘤浸潤(rùn)在真皮層、皮下層，靠近肌肉層（見(jiàn)圖7）。腫瘤細(xì)胞排列呈片狀（見(jiàn)圖8），高倍鏡下可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞大小不一， 腫瘤細(xì)胞外形呈圓形至卵圓形，細(xì)胞邊緣不清楚，細(xì)胞大小不一（見(jiàn)圖9）；細(xì)胞質(zhì)為少量至中等量，內(nèi)含嗜堿性顆粒；細(xì)胞核為多形性，大小不一，可見(jiàn)有絲分裂相。 在腫瘤內(nèi)可見(jiàn)炎癥細(xì)胞聚集浸潤(rùn)。 病理組織學(xué)診斷為惡性肥大細(xì)胞瘤。

3.2.4 病例2 腫瘤病理組織學(xué)觀察 病理組織學(xué)觀察顯示：組織間可見(jiàn)大量的纖維組織增生（見(jiàn)圖10），伴有脂肪浸潤(rùn)（見(jiàn)圖11），可見(jiàn)大量的深染的圓形細(xì)胞，細(xì)胞核圓形，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有大量的嗜堿性或嗜酸性顆粒（見(jiàn)圖12）。 細(xì)胞大小均一，核質(zhì)比例適中，未見(jiàn)明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。病理組織學(xué)診斷為良性肥大細(xì)胞瘤。

4 討論

肥大細(xì)胞瘤作為常見(jiàn)的犬皮膚腫瘤， 通過(guò)實(shí)用的細(xì)胞學(xué)檢查對(duì)腫瘤性質(zhì)做出判斷， 并通過(guò)病理組織學(xué)檢查對(duì)腫瘤進(jìn)行分期， 準(zhǔn)確的組織病理學(xué)分級(jí)可以極大地提高肥大細(xì)胞瘤的診斷水平，并為預(yù)后提供指導(dǎo)意見(jiàn)［6-8］。

圖7 腫瘤浸潤(rùn)在皮下層、靠近肌肉層（10×10）

圖8 腫瘤細(xì)胞排列呈片狀（10×10）

圖9 腫瘤細(xì)胞呈圓形至卵圓形，細(xì)胞邊緣不清楚、大小不一，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)嗜堿性顆粒（10×40）

圖10 大量的纖維組織（10×10）

圖11 脂肪浸潤(rùn)（10×40）

圖12 細(xì)胞質(zhì)內(nèi)大量嗜堿性或嗜酸性顆粒（10×100）

由于細(xì)胞學(xué)檢查較為方便，成本較低，操作難度較小，適合在臨床推廣。一般細(xì)胞學(xué)檢查僅需幾十分鐘就能得到結(jié)果，初步判斷腫瘤的來(lái)源，并對(duì)分化程度進(jìn)行初步判斷［5，9］。 有研究顯示細(xì)胞學(xué)檢查對(duì)犬肥大細(xì)胞瘤的診斷準(zhǔn)確率超過(guò)92%［6］。 但有時(shí)Diff-Quik 染液無(wú)法顯示肥大細(xì)胞內(nèi)部色素顆粒，因此，在無(wú)法確定的情況下，建議使用瑞氏染液繼續(xù)染色觀察［10］。 該次采用的病理組織學(xué)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分別為Patnaik 系統(tǒng)病理學(xué)分級(jí)體系和Kiupel 分級(jí)體系，前者在歐美的認(rèn)可度更高，后者常常作為輔助指標(biāo)出現(xiàn)［11］。 Scarpa 等［12］認(rèn)為細(xì)胞學(xué)檢查也可以作為腫瘤分級(jí)的重要指標(biāo)之一。

針對(duì)上述2 例犬皮膚腫瘤病例， 細(xì)胞學(xué)檢查初步確定了腫瘤來(lái)源為肥大細(xì)胞瘤， 并進(jìn)行了初步分級(jí)， 為腫瘤摘除時(shí)手術(shù)方式的選擇及手術(shù)范圍的確定提供了指導(dǎo)意見(jiàn)。 但病例1 由于細(xì)胞學(xué)顯示惡性程度較高， 在手術(shù)時(shí)就采取了較大范圍的切除，同時(shí)切除了腫瘤下層的相關(guān)肌肉，盡可能降低復(fù)發(fā)概率，截至發(fā)稿前，未見(jiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，極大地提高了生存概率。 同時(shí)作為惡性程度較高的腫瘤病例，在手術(shù)治療的基礎(chǔ)上，盡早介入藥物治療也是非常必要的， 筆者選擇醋酸潑尼松龍參與治療，醋酸潑尼松龍作為糖皮質(zhì)激素的一種，可以通過(guò)非基因組機(jī)制快速抑制抗原激發(fā)的肥大細(xì)胞組胺釋放，同時(shí)快速抑制抗原激發(fā)肥大細(xì)胞脫顆粒時(shí)的磷酸化， 通過(guò)快速降低肥大細(xì)胞細(xì)胞膜流動(dòng)性， 增加細(xì)胞膜穩(wěn)定性等手段降低肥大細(xì)胞帶來(lái)的機(jī)體反應(yīng)及擴(kuò)散轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)［13-14］。 細(xì)胞學(xué)檢查也存在一定的局限性， 如病例2 中在病理組織中發(fā)現(xiàn)了大量的脂肪浸潤(rùn)，但未在細(xì)胞學(xué)檢查中發(fā)現(xiàn)，而細(xì)胞學(xué)檢查中發(fā)現(xiàn)的大量炎性細(xì)胞存在的情況，但并未在組織中發(fā)現(xiàn)，這提示當(dāng)腫物存在空腔或液體時(shí)，細(xì)胞樣品應(yīng)來(lái)自實(shí)質(zhì)組織，這對(duì)進(jìn)一步判讀有重要意義。因此，在犬皮膚肥大細(xì)胞瘤的診斷中，細(xì)胞學(xué)檢查具有一定的診斷價(jià)值，值得在寵物臨床診療中推廣。