李純璞，張立清，侯存強(qiáng)，李紅巖b，于 鑫，張開剛，郭冬梅c*

（1.泰安市中心醫(yī)院a：骨科；b：麻醉科；c：血液內(nèi)科；2.泰安市榮軍醫(yī)院；3解放軍第960醫(yī)院泰安院區(qū)；4.泰安市中醫(yī)醫(yī)院，泰安 271000）

骨肉瘤起源于間充質(zhì)組織，是兒童和青少年中最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤［1,2］。骨肉瘤惡性度高，早期即可發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，危害性大。當(dāng)前骨肉瘤的主要治療方法包括手術(shù)、化學(xué)療法和放射治療［3］。隨著治療的不斷改進(jìn)，骨肉瘤患者5年生存率達(dá)到60%～70%，但對于復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和化療耐藥的患者，生存時間明顯縮短［4］。已有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)許多與骨肉瘤進(jìn)展密切相關(guān)的基因，包括 CDC2［5］，ANRIL［6］，HER2和CD44［7］。然而，骨肉瘤發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制仍不清楚［8-10］。RPUSD1（RNA pseudouridylate synthase domain containing 1）是一個蛋白質(zhì)編碼基因，目前研究顯示其在多種腫瘤中發(fā)揮重要作用［11-13］。然而，RPUSD1在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及其潛在的分子機(jī)制尚不清楚。本研究通過Gene Expression Omnibus（GEO）公共數(shù)據(jù)庫，利用生物信息學(xué)的方法研究骨肉瘤中基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)［14］，分析RPUSD1在骨肉瘤中的表達(dá)及對預(yù)后的影響，并采用基因集富集分析（gene set enrichment analysis,GSEA）和基因集變異分析（gene set variation analysis,GSVA）方法探索RPUSD1 可能參與的腫瘤相關(guān)生物學(xué)通路［15，16］，為明確RPUSD1在骨肉瘤中預(yù)后預(yù)測價值及在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 芯片數(shù)據(jù)

利用美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）的GEO 芯片數(shù)據(jù)庫 （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），以“osteosarcoma，Homo”為關(guān)鍵詞搜索相關(guān)芯片。篩選后，獲取3組轉(zhuǎn)錄組基因芯片數(shù)據(jù)：基于GPL13376芯片分析平臺（Illumina HumanWG-6 v2.0 expression beadchip）的 GSE28424數(shù)據(jù)集、基于GPL10295芯片分析平臺（Illumina HumanWG-6 v2.0 expression beadchip）的 GSE42352與 GSE21257數(shù)據(jù)集。GSE28424包括19例骨肉瘤細(xì)胞樣本和4例正常對照骨樣本。GSE42352包括19例骨肉瘤細(xì)胞樣本和12例對照間充質(zhì)干細(xì)胞樣本。GSE21257包括53例具有臨床特征及相關(guān)病理學(xué)參數(shù)的骨肉瘤樣本。

1.2 數(shù)據(jù)處理及相關(guān)臨床病理資料研究

采用各數(shù)據(jù)集已標(biāo)準(zhǔn)化的表達(dá)矩陣數(shù)據(jù)，基于R語言軟件（3.6.3版本）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。在GSE28424和GSE42352數(shù)據(jù)集中，采用Wilcoxon rank-sum檢驗(yàn)分析RPUSD1基因在骨肉瘤與對照組中的差異表達(dá)。在GSE21257數(shù)據(jù)集中，剔除臨床相關(guān)病理學(xué)參數(shù)缺失的樣本后，根據(jù)RPUSD1的表達(dá)量，按照中位值將數(shù)據(jù)集分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，采用Kaplan-Meier方法進(jìn)行生存分析。隨后利用單因素和多因素Cox風(fēng)險回歸方法對臨床特征及相關(guān)病理學(xué)參數(shù)進(jìn)行預(yù)后分析。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 GSEA與GSVA分析

采用GSEA軟件（https://software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp）進(jìn)行富集分析。在GSE21257數(shù)據(jù)集中，根據(jù)RPUSD1表達(dá)水平將骨肉瘤樣本分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。從MsigDB數(shù)據(jù)庫獲得生物信號基因集作為參照基因集，通過GSEA進(jìn)行信號通路富集分析。GSEA分析不同RPUSD1表達(dá)組骨肉瘤的信號通路富集情況。將P＜0.05的基因集作為顯著富集基因集。并通過R軟件GSVA包分析高、低表達(dá)組富集信號通路的變異情況。

2 結(jié) 果

2.1 骨肉瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞中RPUSD1的表達(dá)情況

首先比較RPUSD1在骨肉瘤細(xì)胞和對照細(xì)胞中的表達(dá)情況。在GSE28424中（圖1a），骨肉瘤細(xì)胞樣本（19例）RPUSD1的表達(dá)水平明顯高于正常骨樣本（4例）（P＜0.05）。進(jìn)一步在GSE42352中進(jìn)行驗(yàn)證（圖1b），作者發(fā)現(xiàn)骨肉瘤細(xì)胞樣本（19例）RPUSD1的表達(dá)水平明顯高于對照間充質(zhì)干細(xì)胞（12例）（P＜0.05）。結(jié)果提示，RPUSD1在骨肉瘤細(xì)胞中顯著高表達(dá)。

圖1 RPUSD1 mRNA在對照細(xì)胞和骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá) 1a:GSE28424數(shù)據(jù)集（正常骨樣本和骨肉瘤細(xì)胞樣本） 1b:GSE42352數(shù)據(jù)集（對照間充質(zhì)干細(xì)胞和骨肉瘤細(xì)胞樣本）

2.2 RPUSD1表達(dá)與骨肉瘤臨床Huvos分級的關(guān)系

Huvos腫瘤壞死率分級系統(tǒng)包括4個等級。I級：很少或沒有壞死的證據(jù)；II級：壞死50%～90%；III級：壞死在90%～99%之間；IV級：100%壞死。Huvos分級廣泛用于骨肉瘤的化療評估。根據(jù)化療后腫瘤壞死的百分比，患者可歸類為不良反應(yīng)者或良好反應(yīng)者。該分級指標(biāo)是預(yù)測長期預(yù)后的重要參數(shù)。I級和II級被認(rèn)為化療療效差，而III級和IV級被認(rèn)為是治療反應(yīng)良好。在GSE21257數(shù)據(jù)集中（表1），作者進(jìn)行RPUSD1表達(dá)水平與Huvos分級的相關(guān)性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RPUSD1表達(dá)水平隨著Huvos分級升高而降低（P＜0.05）（圖2）。說明化療后腫瘤壞死組織率升高時，RPUSD1表達(dá)水平下降。提示RPUSD1可能成為預(yù)測骨肉瘤化療療效的指標(biāo)。

表1 GSE21257數(shù)據(jù)集骨肉瘤患者的臨床特點(diǎn)

2.3 RPUSD1表達(dá)與骨肉瘤預(yù)后的相關(guān)性分析

在GSE21257中，對46名具有完整臨床信息骨肉瘤患者進(jìn)行分析。中位隨訪時間為71.2個月。生存分析結(jié)果顯示RPUSD1高表達(dá)患者的總體生存率明顯低于RPUSD1低表達(dá)組（P=0.011）。對各臨床特征進(jìn)行單因素Cox分析，發(fā)現(xiàn)RPUSD1高表達(dá)組患者總體生存率較低（P=0.003，HR=23.27，95%CI=3.02～179.49）。Huvos高等級患者總體生存率較高（P=0.025，HR=0.52、95%CI=0.30～0.92）。多因素分析結(jié)果顯示 RPUSD1表達(dá) （P=0.033，HR=4.41，95%CI=1.12～17.28） 和 Huvos分級 （P=0.020，HR=0.51，95%CI=0.29～0.90）分別是患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因子。以上結(jié)果表明，RPUSD1是骨肉瘤生存的獨(dú)立預(yù)后生物標(biāo)志物。

圖2 在GSE21257中，骨肉瘤不同Huvos病理分級中RPUSD1的表達(dá)情況

2.4 RPUSD1相關(guān)的通路富集與變異分析

利用GSEA分析RPUSD1調(diào)控的相關(guān)信號通路。結(jié)果顯示：在RPUSD1高表達(dá)的樣本中，不飽和脂肪酸生物合成、氧化磷酸化、蛋白質(zhì)組、嘧啶代謝以及RNA聚合酶信號通路高度富集（圖3）。說明這些通路與RPUSD1高表達(dá)密切相關(guān)。隨后，通過GSVA進(jìn)一步證實(shí)氧化磷酸化、蛋白質(zhì)組、嘧啶代謝以及RNA聚合酶通路在RPUSD1不同表達(dá)組存在顯著差異（圖4）。以上結(jié)果說明，RPUSD1通過影響氧化磷酸化、蛋白質(zhì)組、嘧啶代謝以及RNA聚合酶通路，進(jìn)而促進(jìn)骨肉瘤的進(jìn)展。

3 討論

目前，骨肉瘤綜合治療包括假體置換手術(shù)輔以化學(xué)療法，但患者的預(yù)后并不滿意［17］。骨肉瘤的組織學(xué)異質(zhì)性、遺傳不穩(wěn)定性、局部侵襲性強(qiáng)以及缺乏特定的生物標(biāo)志物給骨肉瘤臨床治療帶來很多困難［18］。RPUSD1在多種腫瘤中發(fā)揮重要作用，但在骨肉瘤發(fā)展中的扮演的角色并不清楚［10］。本研究通過生物信息學(xué)綜合分析發(fā)現(xiàn)，RPUSD1在骨肉瘤中存在特異高表達(dá)，并且與預(yù)后不良相關(guān)。骨肉瘤中RPUSD1表達(dá)水平與臨床病理Huvos分級顯著相關(guān)。多因素分析表明RPUSD1是骨肉瘤預(yù)后的獨(dú)立生物標(biāo)志物。

圖3 GSEA基因集富集分析顯示RPUSD1調(diào)控的信號通路

圖4 GSVA基因集變異分析顯示RPUSD1調(diào)控的信號通路

RPUSD1是一個蛋白質(zhì)編碼基因，其相關(guān)的疾病包括痣樣基底細(xì)胞癌（NBCCS）［11］、惡性星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤［12］以及再生障礙性貧血［13］等。NBCCS綜合征是一種罕見的常染色體顯性遺傳病，并具有復(fù)雜的遺傳基礎(chǔ)。全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)RPUSD1是NBCCS潛在致病基因。在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險模型的研究中，包含RPUSD1基因的預(yù)后模型的敏感性為81.8%，特異性為66.7%［19］。Goh TS等使用高維Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)RPUSD1骨肉瘤患者預(yù)后不佳［20］。未來需要收集更多臨床標(biāo)本進(jìn)行功能分析，以進(jìn)一步闡明及驗(yàn)證RPUSD1的生物學(xué)功能。

作者發(fā)現(xiàn)RPUSD1通過影響氧化磷酸化、蛋白質(zhì)組、嘧啶代謝以及RNA聚合酶通路，促進(jìn)骨肉瘤的進(jìn)展。這4個信號通路在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。氧化磷酸化在細(xì)胞能量代謝中發(fā)揮核心作用。Rao等［21］指出氧化磷酸化在肺癌進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。Shi等［22］證實(shí)新型氧化磷酸化抑制劑可抑制人類膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）在管理多種蛋白質(zhì)的活動中具有核心功能，可抑制 UPS，是一種新的惡性腫瘤治療方法［23］。RNA聚合酶指導(dǎo)合成核糖體，癌細(xì)胞可通過大量增加核糖體來驅(qū)動細(xì)胞代謝的上調(diào)［24］。嘧啶代謝是腫瘤細(xì)胞進(jìn)行DNA復(fù)制重要的代謝過程，其與腫瘤發(fā)生發(fā)展密不可分，亦是有價值的診斷和治療靶標(biāo)［25,26］。本研究提示，干擾以上4個信號通路可能達(dá)到治療骨肉瘤的目的。

綜上所述，通過綜合分析公共數(shù)據(jù)庫中骨肉瘤相關(guān)數(shù)據(jù)，本研究發(fā)現(xiàn)RPUSD1是骨肉瘤的預(yù)后生物標(biāo)志物，今后可探索其調(diào)控腫瘤進(jìn)展的信號通路，進(jìn)而為尋找骨肉瘤治療靶點(diǎn)提供科學(xué)依據(jù)。