吳通榮, 簡榮超, 陳小樂, 唐小文, 李鈺鈴, 盛釗君, 吳盼盼, 洪為謙*

(1. 五邑大學 生物科技與大健康學院，廣東 江門 529020；2. 江門市 大健康國際創(chuàng)新研究院，廣東 江門 529000)

酪氨酸酶是一種含銅離子的氧化還原酶[1]。與黑色素合成密切相關(guān)，易引起果蔬酶促褐變及人體色素障礙性疾病[2]。酪氨酸酶抑制劑在醫(yī)藥、化妝品和農(nóng)業(yè)中具有重要作用，因此，尋找高效、低毒、穩(wěn)定的酪氨酸酶抑制劑具有廣闊的前景[3]。

自由基具有強烈的氧化作用，與人體一些重大疾病有一定的相關(guān)性，正常情況下，生物體內(nèi)自由基處于平衡性動態(tài)，機體的免疫和其他防御系統(tǒng)，包括酶和細胞膜本身，可以阻斷它的損害[4]。然而過多的自由基會氧化各種酶和蛋白質(zhì)的巰基，改變其功能和結(jié)構(gòu)；還會損害核酸和染色體，從而誘發(fā)多種疾病，如癌癥、動脈粥樣硬化、心糖尿病和腦血管疾病等[5-6]。而抗氧化劑能夠幫助人體祛除自由基，從而減少多種疾病(如癌癥、動脈硬化和腦血管疾病)的發(fā)生。

Scheme 1

原兒茶酸具有抑菌[7]、抗炎[8]等多方面藥理活性，是一種重要的天然活性物質(zhì)。近年來的研究發(fā)現(xiàn)了原兒茶酸抗氧化[9-10]、抗癌及介導腫瘤細胞凋亡等許多新的藥理作用[11]。胡椒酸是從胡椒中提取的一種芳香酸，目前研究發(fā)現(xiàn)它具有抗菌活性[12]，可抑制酪氨酸酶活性[13]，而且其衍生物胡椒酸乙二胺具有降血脂及抗氧化作用[14]。樊倩[15]等研究了一系列肉桂酰氨基酸酯類化合物，發(fā)現(xiàn)其中部分化合物的抗氧化活性和酪氨酸酶抑制活性相較于肉桂酸有明顯的提升，具有較好的抗氧化活性和酪氨酸酶抑制活性。

將原兒茶酸、胡椒酸分別與具有生物活性的L-酪氨酸甲酯、D-酪氨酸酶甲酯、章胺、多巴胺通過酰胺鍵偶聯(lián)，合成了原兒茶酸系列和胡椒酸系列化合物(Scheme 1)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR和13C NMR表征。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Bruker 500 MHz型核磁共振儀(Methanol-d4為溶劑，TMS為內(nèi)標)。

所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1) 原兒茶酸羥基保護產(chǎn)物(中間體)合成

將原兒茶酸15.412 g(100 mmol)溶于20 mL DMF中，0 ℃下加入叔丁基二甲基氯硅烷60.288 g(400 mmol)，三乙胺調(diào)節(jié)pH 至9～10，室溫反應(yīng)20 h，以TLC檢測反應(yīng)終點(展開劑：石油醚/乙酸乙酯=12/1，V/V)，減壓濃縮后加入15 mL THF/MeOH混合溶劑(2/1，V/V)，再加入適量飽和碳酸鉀反應(yīng)1～2 h。減壓濃縮，濃縮液用DCM溶解后依次用2 M鹽酸、飽和碳酸氫鈉、飽和食鹽水洗滌，收集有機相，干燥、減壓濃縮得到粗產(chǎn)品，硅膠柱層析(洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯=15/1，V/V)純化得中間體產(chǎn)物。

(2) 胺類化合物羥基保護產(chǎn)物(中間體)合成(以L-酪氨酸甲酯為例)

將L-酪氨酸甲酯19.522 g(100 mmol)溶于20 mL DMF中，0 ℃下加入叔丁基二甲基氯硅烷(其中對L-酪氨酸甲酯和D-酪氨酸甲酯為200 mmol，章胺和多巴胺為300 mmol)，三乙胺調(diào)節(jié)pH至9～10，室溫下反應(yīng)20 h，以TLC檢測反應(yīng)終點(展開劑：二氯甲烷/甲醇=15/1，V/V)，反應(yīng)液依次用2 M鹽酸、飽和碳酸氫鈉、飽和食鹽水洗滌，收集有機相，干燥、減壓濃縮得到粗產(chǎn)品，硅膠柱層析(洗脫劑：二氯甲烷/甲醇=20/1，V/V)純化得中間體產(chǎn)物。

(3) 化合物a～d合成(以a合成為例)

將原茶兒酸羥基保護產(chǎn)物0.200 g(0.523 mmol)溶于5～8 mL無水DCM中，加入EDCI(羧酸化合物的2 eq.)和HOBT(羧酸化合物的1.2 eq.)，0 ℃下攪拌10 min后加入胺類化合物的羥基保護產(chǎn)物(羧酸化合物的1.2 eq.)，三乙胺調(diào)節(jié)pH至9～10，室溫反應(yīng)過夜后，依次用2 M鹽酸、飽和碳酸氫鈉、飽和食鹽水洗滌，收集有機相，干燥、減壓濃縮，殘余經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯=15/1，V/V)純化得羥基被保護的酰胺產(chǎn)物，再定量加入1 M的四丁基氟化銨的THF溶液，室溫反應(yīng)2 h。反應(yīng)完成后，濃縮，殘余經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：二氯甲烷/甲醇=24/1，V/V)純化得目標產(chǎn)物。

a： 白色固體，收率 42.1%;1H NMRδ: 7.24(d,J=2.1 Hz, 1H, ArH), 7.18(dd,J=8.2 Hz, 2.1 Hz, 1H, ArH), 7.08(d,J=8.5 Hz, 2H, ArH), 6.80(d,J=8.3 Hz, 1H, ArH), 6.72(d,J=8.5 Hz, 2H, ArH), 4.75～4.71(dd,J=8.9 Hz, 5.7 Hz, 1H, CH), 3.72(s, 3H, CH3), 3.16～3.03(m, 2H, CH2);13C NMRδ: 172.64, 168.73, 155.95, 148.99, 144.88, 129.84, 127.70, 125.05, 119.43, 114.87, 114.39, 54.75, 51.29, 36.03, 25.50, 19.61, 12.55。

b： 白色固體，收率 42.1%;1H NMRδ: 7.24(d,J=2.1 Hz, 1H, ArH), 7.21～7.16(dd,J=8.2 Hz, 2.2 Hz, 1H, ArH), 7.08(d,J=8.5 Hz, 2H, ArH), 6.80(d,J=8.3 Hz, 1H, ArH), 6.73(d,J=8.5 Hz, 2H, ArH), 4.77～4.74(dd,J=8.9 Hz, 5.7 Hz, 1H, CH), 3.72(s, 3H, CH3), 3.14～2.99(m, 2H, CH2);13C NMRδ: 172.65, 168.74, 155.95, 149.00, 144.88, 129.84, 127.69, 125.08, 119.43, 114.87, 114.39, 54.75, 51.30, 36.0, 25.67, 19.58, 12.58。

c： 白色固體，收率42.6%;1H NMRδ: 7.30～7.24(m, 3H, ArH), 7.23～7.17(dd,J=8.3 Hz, 2.1 Hz, 1H, ArH), 6.82～6.76(m, 3H, ArH), 4.80(q,J=5 Hz, 1H, CH), 3.60～3.47(m, 2H, CH2);13C NMRδ: 169.14, 156.68, 148.80, 144.90, 133.37, 127.06, 125.54, 119.17, 114.68, 114.39, 114.28, 72.07, 12.55。

d： 白色固體，收率 40.9%;1H NMRδ: 7.28(d,J=2.1 Hz, 1H, ArH), 7.21～7.17(dd,J=8.3 Hz, 2.2 Hz, 1H, ArH), 6.81(d,J=8.3 Hz, 1H, ArH), 6.73～6.68(m, 2H, ArH), 6.61～6.57(dd,J=8.0 Hz, 2.1 Hz, 1H, ArH), 3.51(t,J=7.5 Hz, 2H, CH2), 2.76(t,J=7.5 Hz, 2H, CH2);13C NMRδ: 168.84, 148.76, 144.89, 143.36, 130.84, 125.72, 119.70, 119.08, 115.52, 114.96, 114.39, 114.23, 52.92, 41.58, 34.73, 26.54, 19.92, 12.74。

(4) 化合物e～h合成(以e合成為例)

將胡椒酸0.200 g(1.204 mmol)溶于5～8mL無水DCM中，定量加入EDCI(羧酸化合物的2 eq.)和HOBT(羧酸化合物的1.2 eq.)，0 ℃下攪拌10 min后加入胺類化合物的羥基保護產(chǎn)物(羧酸化合物的1.2 eq.)，三乙胺調(diào)節(jié)pH至9～10，室溫反應(yīng)過夜后，依次用2 M鹽酸、飽和碳酸氫鈉、飽和食鹽水洗滌，收集有機相，干燥、減壓濃縮，殘余經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯=15/1，V/V)純化得羥基被保護的酰胺產(chǎn)物，再定量加入1 M的四丁基氟化銨的THF溶液，室溫攪拌2 h，反應(yīng)完成后，濃縮，殘余經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：二氯甲烷/甲醇=30/1，V/V)純化得目標產(chǎn)物。

e： 白色固體，收率 65.3%;1H NMRδ: 7.37～7.35(dd,J=8.1 Hz, 1.8 Hz, 1H, ArH), 7.25(d,J=1.7 Hz, 1H, ArH), 7.12～7.06(m, 2H, ArH), 6.89(d,J=8.2 Hz, 1H, ArH), 6.75～6.69(m, 2H, CH2), 6.05(s, 2H, CH2), 4.76～4.73(m, 1H, CH), 3.74(s, 3H, CH3), 3.17～3.01(m, 2H, CH2);13C NMRδ: 172.53, 168.00, 155.98, 150.75, 147.90, 129.82, 127.69, 127.59, 122.18, 114.86, 107.48, 107.16, 101.83, 54.85, 51.32, 35.99。

f： 白色固體，收率 65.3%;1H NMRδ: 7.38～7.35(dd,J=8.1 Hz, 1.8 Hz, 1H, ArH), 7.25(d,J=1.7 Hz, 1H, ArH), 7.11～7.06(m, 2H, ArH), 6.88(d,J=8.1 Hz, 1H, ArH), 6.76～6.70(m, 2H, CH2), 6.04(s, 2H, CH2), 4.78～4.72(m, 1H, CH), 3.74(s, 3H, CH3), 3.17～3.02(m, 2H, CH2);13C NMRδ: 172.51, 168.00, 155.98, 150.75, 147.91, 129.80, 127.69, 127.62, 122.18, 114.84, 107.48, 107.15, 101.84, 54.85, 51.30, 35.98。

g： 白色固體，收率 59.2%;1H NMRδ: 7.41～7.39(dd,J=8.2 Hz, 1.8 Hz, 1H, ArH), 7.30(d,J=1.7Hz, 1H, ArH), 7.26(d,J=8.5 Hz, 2H, ArH), 6.89(d,J=8.1 Hz, H, ArH), 6.81～6.78(m, 2H, ArH), 6.04(s, 2H, CH2), 4.82～4.79(dd,J=7.9 Hz, 5.0 Hz, 1H, CH), 3.60～3.48(m, 2H, CH2);13C NMRδ: 168.32, 156.71, 150.56, 147.93, 133.32, 128.18, 127.07, 121.93, 114.67, 107.47, 107.06, 101.80, 71.93, 52.67, 25.64, 19.56, 12.55。

h： 白色固體，收率 50.7%;1H NMRδ: 7.38～7.36(dd,J=8.1 Hz, 1.6 Hz, 1H, ArH), 7.27(d,J=1.5 Hz, 1H, ArH), 6.86(d,J=8.1 Hz, 1H, ArH), 6.72(d,J=8.1, 2H, CH2), 6.58～6.56(dd,J=8.0 Hz, 1.8 Hz, 1H, CH), 6.02(s, 2H, CH2), 3.51(t,J=7.5 Hz, 2H, CH2), 2.75(t,J=7.5 Hz, 2H, CH2);13C NMRδ: 168.02, 150.47, 147.90, 130.80, 128.31, 121.84, 119.76, 115.57, 107.49, 107.02, 101.77, 41.67, 34.63, 25.49, 19.51, 12.58。

1.3 活性測試

(1) 酪氨酸酶抑制活性測試[16]

測定酪氨酸酶抑制活性，將96孔微孔板放入酶標儀中，使其溫度達到37 ℃后，向96孔微孔板中依次加入80 uL的PBS緩沖溶液(0.05 mol/L， pH=6.81)， 10 μL的酪氨酸酶溶液，10 μL的樣品溶液(2 mM)， 37 ℃下孵育10 min，其中振動30 s。孵育完成后，加入100 μL的L-多巴溶液引發(fā)反應(yīng)，測定0 s與60 s的吸光度值。

(2) DPPH自由基清除試驗[17]

測定DPPH自由基清除能力，取2 mL濃度為0.2 mmol/L的DPPH自由基的甲醇溶液與2 mL不同濃度的樣品溶液混合搖勻。避光靜置反應(yīng)10 min后，測量其在波長517 nm處的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成

通過羥基的硅醚化反應(yīng)保護母體結(jié)構(gòu)上的羥基，再經(jīng)羧基與氨基的偶合反應(yīng)合成酰胺類化合物，最后使用TBAF作為羥基的脫保護劑脫去羥基保護基團得到8個目標產(chǎn)物。所有目標分子都通過HPLC進行純度分析，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR和13C NMR表征。

2.2 活性

通過體外酪氨酸酶活性測試實驗，對所合成的原兒茶酸系列和胡椒酸系列的酰胺類化合物在100 μM濃度下進行活性篩選，結(jié)果如表1所示，以原兒茶酸為母體結(jié)構(gòu)合成的酰胺化合物比其母體結(jié)構(gòu)對酪氨酸酶抑制活性有了一定的提高。而以胡椒酸為母體結(jié)構(gòu)合成的酰胺化合物對酪氨酸酶的抑制活性比胡椒酸對酪氨酸酶的的抑制活性低，說明胡椒酸對酪氨酸酶的抑制活性可能很大程度來自其羧基。但化合物對酪氨酸酶的抑制活性均低于陽性對照物曲酸。

測試了化合物對 DPPH 自由基清除活性，結(jié)果分別見表2和表3。在50 μM的濃度下，a、b、c和h對DPPH自由基具有較強的清除能力，其對DPPH自由基的清除能力均高于原料化合物及陽性對照物抗壞血酸。結(jié)合化合物對酪氨酸酶的抑制活性，選擇a、b和c，測定其對DPPH半數(shù)清除濃度，所得結(jié)果分別為6.1、 6.3和13.3 μM，均高于陽性對照物抗壞血酸(IC50=40.3 μM)。

表1 100 μM下化合物對酪氨酸酶的抑制率

表2 50 μM下化合物對DPPH自由基清除率

表 3 部分化合物對DPPH自由基的半數(shù)清除濃度

選取原兒茶酸和胡椒酸兩種羧酸化合物，通過酰胺鍵與L-酪氨酸甲酯、D-酪氨酸甲酯、章胺、多巴胺4種具有生物活性的胺類的化合物偶聯(lián)。成功合成了8個新型酰胺類化合物，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR和13C NMR表征。測試目標產(chǎn)物的體外酪氨酸酶抑制活性和DPPH自由基清除能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：以原兒茶酸系列作為母體結(jié)構(gòu)與4種胺所合成的酰胺類化合物對酪氨酸酶的抑制活性比母體結(jié)構(gòu)稍有提升；而以胡椒酸為母體結(jié)構(gòu)合成的酰胺類化合物對酪氨酸酶的抑制活性比胡椒酸本身對酪氨酸酶的抑制活性低，說明胡椒酸對酪氨酸酶的抑制活性可能很大程度來自于其羧基。再通過對化合物進行的DPPH自由基清除能力試驗，發(fā)現(xiàn)化合物a、b、c、d和h具有較強自由基清除能力。而化合物a、b和c不僅對酪氨酸酶具有一定的抑制活性，并且具有較強的DPPH自由基清除能力。