何冠濤, 方成喬, 羅旭娜, 蘇金龍, 饒 雨, 林漢森

(廣東藥科大學(xué) 藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

光親和標(biāo)記(photo-affinity labeling, PAL)自1962年首次報(bào)道以來[1]，迅速成為了藥物與靶蛋白研究之間的重要橋梁，不僅可以指導(dǎo)先導(dǎo)物的篩選，更能夠?qū)崿F(xiàn)高效靈敏的藥物受體識別[2]。PAL探針是目標(biāo)化合物鏈接光反應(yīng)性基團(tuán)(photo-reactive group)以及報(bào)告基團(tuán)(reporter group)的衍生物[3]，其中雙吖丙啶類PAL探針的合成及其靶標(biāo)識別研究已有許多相關(guān)報(bào)道[4-7]?；赑AL探針的設(shè)計(jì)原則[8]，李正球等[9-10]報(bào)道了一種具有簡約結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的端炔基雙吖丙啶類PAL的合成(Scheme 1)，同時(shí)證明了此類PAL探針具有良好的靶標(biāo)識別性能，目前國內(nèi)外已有各種靶蛋白研究采用此方法來合成PAL探針[11-16]。

Scheme 1

Scheme 2

在研究該中間體3-氧代-6-庚炔酸酯的合成方法時(shí)，發(fā)現(xiàn)上述制備方法略有不足：一方面，使用二異丙基氨基鋰(LDA)直接與原料中的γ-H作用形成γ碳負(fù)離子，然而LDA的使用條件苛刻，反應(yīng)需要在極低溫(-78 ℃)、無水、無氧和氮?dú)獗Ｗo(hù)下進(jìn)行，且后處理復(fù)雜，對儀器設(shè)備要求較高。另一方面，乙酰乙酸乙酯具有更加活潑的α-H，可與LDA作用形成α碳負(fù)離子，因此上述方法在原料與溴丙炔的親核取代中，往往會生成大量的α-取代物和α,γ-二取代物，而γ-取代物3-氧代-6-庚炔酸乙酯的實(shí)際收率僅有5%～15%，且重現(xiàn)性較差，難以達(dá)到預(yù)定的效果。為此，改進(jìn)了3-氧代-6-庚炔酸酯的合成工藝(Scheme 2)：利用二異丙胺氨解乙酰乙酸乙酯生成N,N-二異丙基乙?；阴０?，減弱α-H酸性，增大α-位空間位阻。之后再與3-溴丙炔進(jìn)行親核取代，經(jīng)硅膠柱層析分離得到α-取代物2與γ-取代物3，兩者比例為1/9，反應(yīng)的區(qū)域選擇性以及γ-位目標(biāo)取代物的收率均有所提高。3再經(jīng)水解與酯化一鍋法反應(yīng)得到3-氧代-6-庚炔酸甲酯3a。優(yōu)化后的工藝操作簡便、后處理簡單、反應(yīng)條件溫和，目標(biāo)產(chǎn)物總收率可達(dá)43.3%。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Bruker AVANCEⅢ 600 MHz型超導(dǎo)核磁共振儀(CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo))；6210 ESI-TOF型高分辨質(zhì)譜儀。

所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1)N,N-二異丙基乙?；阴０?1)的合成

稱取乙酰乙酸乙酯2.3 g(18.0 mmol)、二異丙胺3.6 g(36.0 mmol)，85 ℃反應(yīng)4 h后冷卻至室溫，加水30 mL，攪拌，二氯甲烷(3×30 mL)萃取，飽和氯化鈉水溶液(50 mL)洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮得深黃色油狀液體13.10 g，收率93.0%;1H NMR(CDCl3, 600 MHz)δ: 3.70～3.63(m, 2H), 3.33(s, 2H), 2.08(s, 3H), 1.23～1.22(d,J=6.7 Hz, 6H), 1.03～1.02(d,J=6.7 Hz, 6H);13C NMR(CDCl3, 151 MHz)δ: 202.74, 165.25, 52.01, 45.77, 29.73, 20.18; HR-MS(ESI-TOF)m/z: Calcd for C10H19NO2{[M+H]+}186.1494, found 186.1489。

(2)α-取代物(2)和γ-取代物(3)的合成

稱取化合物13.1 g(16.7 mmol)，氫化鈉0.8g(33.4 mmol)溶解于20 mL四氫呋喃中，冰水浴下攪拌0.5 h后，緩慢滴加3-溴丙炔2.0 g(16.7 mmol)，低溫反應(yīng)2 h(TLC監(jiān)測)。加水40 mL和乙酸乙酯40 mL，攪拌，分液，水層用乙酸乙酯(2×30 mL)萃取。合并有機(jī)層，飽和氯化鈉水溶液(50 mL)洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，殘余經(jīng)硅膠柱層析[洗脫劑：V(乙酸乙酯)/V(石油醚)=1/5]純化得α-取代物2和γ-取代物3。

Scheme 3

α-取代物2： 黃色油狀液體0.3 g，收率 8.0%;1H NMR(CDCl3, 600 MHz)δ: 4.24～4.17(m, 2H, 8,11-H), 3.78～3.75(t,J=7.5 Hz, 1H, 2-H), 2.84～2.67(m, 2H, 5-H), 2.16(s, 3H, 4-H), 2.00～1.99(t,J=2.7 Hz, 1H, 7-H), 1.24～1.23(d,J=6.7 Hz, 6H, 12,13-H), 1.21～1.20(d,J=6.7 Hz, 6H, 9,10-H);13C NMR(CDCl3, 151 MHz)δ: 202.88, 166.76, 81.20, 70.53, 57.60, 46.62, 27.07, 20.73, 20.25, 18.67; HR-MS(ESI-TOF)m/z: Calcd for C13H21NO2{[M+H]+}224.1650, found 224.1645。

γ-取代物3： 黃色油狀液體2.7 g，收率 72.4%;1H NMR(CDCl3, 600 MHz)δ: 3.83～3.76(m, 2H, 8,11-H), 3.48(s, 2H, 2-H), 2.80～2.77(t,J=7.2 Hz, 2H, 4-H), 2.45～2.42(td,J=7.2, 2.7 Hz, 2H, 5-H), 1.91～1.90(t,J=2.7 Hz, 1H, 7-H), 1.36～1.35(d,J=6.7 Hz, 6H, 12,13-H), 1.16～1.15(d,J=6.7 Hz, 6H, 9,10-H);13C NMR(CDCl3, 151 MHz)δ: 202.93, 165.26, 83.00, 68.84, 51.33, 46.18, 41.47, 20.50, 12.98; HR-MS(ESI-TOF)m/z: Calcd for C13H21NO2{[M+H]+}224.1650, found 224.1645。

(3) 3-氧代-6-庚炔酸甲酯(3a)的合成

在裝有化合物32.7 g(12.1 mmol)的反應(yīng)瓶中加入無水甲醇15 mL，油浴加熱升溫，攪拌下緩慢滴加80%硫酸15 mL，回流反應(yīng)10 h。反應(yīng)液緩慢倒入冷水50 mL中，攪拌，二氯甲烷(3×30 mL)萃取，依次用飽和碳酸氫鈉水溶液(50 mL)和飽和氯化鈉水溶液(50 mL)洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，得淺黃色油狀液體3a1.3 g，收率64.3%;1H NMR(CDCl3, 600 MHz)δ: 3.71(s, 3H), 3.46(s, 2H), 2.79～2.77(t,J=7.2 Hz, 2H), 2.46～2.43(td,J=7.2, 2.7 Hz, 2H), 1.94～1.93(t,J=2.7 Hz, 1H);13C NMR(CDCl3, 151 MHz)δ: 200.55, 169.76, 83.97, 68.24, 51.92, 48.99, 42.58, 12.83; HR-MS(ESI-TOF)m/z: Calcd for C8H10O3{[M+H]+}155.0708, found 155.0703。

2 結(jié)果與討論

2.1 γ-取代物3的合成方法改進(jìn)與工藝優(yōu)化

通過二異丙胺氨解乙酰乙酸乙酯生成N,N-二異丙基乙?；阴０?后，反應(yīng)起始物的α-位附近被引入一較大的供電子位阻基團(tuán)，因此α-H的酸性減弱，同時(shí)α-位附近的空間位阻效應(yīng)增大，阻礙了α碳負(fù)離子的形成及其對3-溴丙炔的進(jìn)攻(Scheme 3)。改進(jìn)后的親核取代反應(yīng)具有更好的區(qū)域選擇性，α-取代物大大減少，γ-取代物明顯增多，兩者比例可達(dá)1/9，提高了后續(xù)合成3-氧代-6-庚炔酸酯的效率。

親核取代中選擇不同的堿對反應(yīng)的影響也較大，一般的選擇有：LDA、正丁基鋰、氫化鈉、甲醇鈉、乙醇鈉、叔丁醇鉀。考慮到使用LDA和正丁基鋰所附帶的危險(xiǎn)性，我們考察了氫化鈉、甲醇鈉、乙醇鈉、叔丁醇鉀4種相對較穩(wěn)定的堿的催化效果，用量均為2 eq.。結(jié)果顯示，使用叔丁醇鉀時(shí)，1尚未完全轉(zhuǎn)化，α-取代物與γ-取代物比例約2/9，反應(yīng)或需要更長的時(shí)間。而選擇使用氫化鈉時(shí)，1可完全反應(yīng)，TLC顯示原料點(diǎn)消失，經(jīng)柱層析純化后γ-取代物收率最佳，兩種取代物比例達(dá)到1/9。使用甲醇鈉、乙醇鈉時(shí)可見原料點(diǎn)基本消失，兩種取代物比例分別約為2/7和1/5，對比使用氫化鈉，反應(yīng)生成的雜質(zhì)斑點(diǎn)更加明顯。相比LDA，使用氫化鈉的反應(yīng)體系更加溫和、操作簡便、后處理簡單，因此選擇氫化鈉代替LDA催化親核取代反應(yīng)。

Scheme 4

2.2 3-氧代-6-庚炔酸甲酯3a的合成工藝優(yōu)化

使用一鍋法合成3-氧代-6-庚炔酸甲酯3a，反應(yīng)首先由γ-取代物3水解脫去位阻基團(tuán)得到β-羰基羧酸，緊接著與甲醇酯化生成目標(biāo)化合物(Scheme 4)。酰胺鍵的水解活性較低，需要在高溫以及濃酸或濃堿催化下長時(shí)間反應(yīng)，但過高的反應(yīng)溫度可能會導(dǎo)致水解物β-羰基羧酸發(fā)生脫羧，因此本研究選擇在100 ℃下使用濃硫酸催化水解以及進(jìn)一步的酯化。在實(shí)際操作中，直接使用市售98%濃硫酸往往容易造成嚴(yán)重的碳化現(xiàn)象，導(dǎo)致后處理困難，影響收率。在考察使用不同濃度的濃硫酸(70%～90%)后發(fā)現(xiàn)，隨著硫酸濃度的升高，水解與酯化反應(yīng)更加徹底，而在80%濃硫酸催化下效果最佳，收率約64%，同時(shí)避免了原料與產(chǎn)物被碳化。

以乙酰乙酸乙酯為原料，通過氨解引入N,N-二異丙基成酰胺以添加空間位阻效應(yīng)后進(jìn)行親核取代，得到α-和γ-兩種取代物比例為1/9，提高了反應(yīng)的區(qū)域選擇性，且γ-取代物的收率達(dá)到72.4%，對比原路線中5%～15%的實(shí)際收率有所提升。γ-取代物再經(jīng)水解與酯化一鍋法反應(yīng)成功地合成了目標(biāo)化合物3-氧代-6-庚炔酸甲酯，3步反應(yīng)總收率43.3%。改進(jìn)優(yōu)化后的3-氧代-6-庚炔酸酯合成方法具有成本低、操作處理簡單、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)。