詹建波, 肖 果, 王 浩, 鄭 晗, 余振華, 雷 濤, 余 娟, 王家強(qiáng)

(1. 云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，云南 昆明 650231； 2. 云南大學(xué) a. 教育部自然資源藥物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， b. 云南大學(xué)國家光電子能源材料國際聯(lián)合研究中心， c. 材料與能源學(xué)院， d. 化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院， 云南 昆明 650091)

無機(jī)抗菌材料具有廣譜高效的殺菌性能、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，使其成為抗菌材料中的研究熱點(diǎn)，如納米銀[1]、Ag/GO[2]、氧化石墨烯[3]等。而三元硫化物ABmCn[4]由于其在催化[5]、電化學(xué)[6]、生物醫(yī)學(xué)[7]等方面的應(yīng)用而備受關(guān)注。目前低毒甚至無毒的金屬三元硫化物在抑菌領(lǐng)域的應(yīng)用正在迅速興起，特別是其廣譜抑菌活性和低成本的獲取方式吸引了人們的目光，如Cu2SnS3[8]和Cu2ZnSnS4[9]對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌都有較好的抗菌活性；CdIn2S4對大腸桿菌具有良好的光催化滅菌活性[10]等。

合成金屬硫化物有多種方法如水熱/溶劑熱[11]、微波輻射[12]、模板法[13]等。在眾多方法中模板法是合成無機(jī)材料[14-16]的重要方法之一，通過加入不同的模板劑可以在材料合成過程中對其形貌、結(jié)構(gòu)、排布等進(jìn)行調(diào)控[17]，將納米材料的合成引導(dǎo)為難以獲得的形式。模板法中所用模板分為硬模板和軟模板，其中軟模板中生物模板法因其所具備的優(yōu)良特點(diǎn)近年來被廣泛用于材料的合成[18]。目前，已經(jīng)將很多軟模板(DNA[19]、谷胱甘肽[20]、木質(zhì)素[21])用于制備新型納米材料。三元硫化物的生物模板合成相比于化學(xué)合成來說在保證所合成的材料準(zhǔn)確性的前提下可以降低合成成本，增強(qiáng)相應(yīng)性能等優(yōu)點(diǎn)，如以水生植物的葉片為模板合成ZnIn2S4用以提高其光催化產(chǎn)氫性能[22]，以L-半胱氨酸為模板制備硫化鉍銀(AgBiS2)可以降低污染物的排放及控制相應(yīng)成本[23]，利用碳纖維的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)合成CuCo2S4納米片用以增強(qiáng)對葡萄糖氧化的電催化特性[24]等。

基于生物模板在材料制備中的優(yōu)點(diǎn)，以及其特殊的抑菌性能，利用天然易得的植物或植物提取物(如橡膠乳、大豆粉、三七粉、菠菜提取物、苝醌提取物等)為模板，采用溶劑熱法制備了形貌各異的AgBiS2和Cu3BiS3材料，研究了其對枯草芽孢桿菌的抑制作用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

TTR III D/max-3B型X射線衍射儀；Quanta 200 FEG型掃描電子顯微鏡；JEM-2100型透射電鏡；Spectra max型酶標(biāo)儀。

所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1) 三元硫化物(AgBiS2和Cu3BiS3)的合成[13,25]

取0.85 g AgNO3(或2.42 g Cu(NO3)2·3H2O)和2.42 g Bi(NO3)3·3H2O 溶于30 mL的乙二醇中，同時(shí)，稱取1.52 g的硫脲溶于20 mL乙二醇中，將該溶液加入到前者溶液中，持續(xù)攪拌30 min；分別將1.0 g的生物模板分散于10 mL的乙二醇溶劑中，將該模板溶液滴加至上述混合溶液中，持續(xù)攪拌3 h后，裝入聚四氟乙烯反應(yīng)釜內(nèi)襯中，在200 ℃下反應(yīng)24 h，反應(yīng)后自然冷卻至室溫，分別用無水乙醇和蒸餾水將所得樣品洗滌數(shù)次，90 ℃下干燥，得到黑色粉末材料為生物模板合成的AgBiS2或Cu3BiS3。

(2) 硫化鉍(Bi2S3)的合成

稱取2.42 g Bi(NO3)3·5H2O 或1.60 g BiCl3溶解在30 mL的乙二醇中；另稱取1.52 g的硫脲溶解于20 mL的乙二醇中，在不斷攪拌下，將兩種溶液混合后攪拌3 h后，裝入聚四氟乙烯反應(yīng)釜內(nèi)襯中，在180 ℃下反應(yīng)24 h。反應(yīng)后自然冷卻至室溫，分別用無水乙醇和蒸餾水將所得樣品洗滌數(shù)次，于90 ℃下干燥，得到黑色粉末材料為Bi2S3。

1.3 抑菌性能

(1) 菌種及培養(yǎng)

以枯草芽孢桿菌為培養(yǎng)對象，該菌體是一種需氧的有柱狀內(nèi)芽孢的G菌，屬于芽孢桿菌屬，菌體為直桿狀，0.5～2.0 μm，無莢膜，周生鞭毛，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5 μm，該菌種在30 ℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h后備用。

(2) 抑菌圈測定試驗(yàn)

將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液和培養(yǎng)皿放于高壓滅菌鍋(壓力為0.1～0.15 Mpa)中滅菌20 min，待培養(yǎng)基冷至適宜溫度時(shí)，在超凈工作臺上，將培養(yǎng)基倒入滅菌的培養(yǎng)皿中，保證每皿10～20 mL培養(yǎng)基，并放于培養(yǎng)箱中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。將500 μL配制好的懸菌液均勻涂布在培養(yǎng)基表面，然后加入沾有硫化物材料的圓紙片，將培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。采用平板打孔法，利用打孔器將濾紙打成圓紙片(約6.0 mm)，將其浸泡在無菌液中制成抑菌片，同時(shí)，將濾紙片浸入無菌生理鹽水，作為空白對照。取出抑菌片貼在含菌平板上，蓋好平面皿，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱，24 h后，測定產(chǎn)生的抑菌圈的直徑，并對抑菌圈較大的材料進(jìn)行TEM檢測。

1.4 材料毒性

選取以苝醌提取物為模板制備的AgBiS2和Cu3BiS3為代表檢測硫化物材料對正常細(xì)胞的毒性。將正常細(xì)胞小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(BABL-3T3)分別接種于96孔板中培養(yǎng)24 h，同時(shí)設(shè)置空白與對照組，然后將不同濃度的硫化物材料加到孔板中，分別培養(yǎng)24 h和48 h后，向每個孔中加入50 μL MTT溶液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。取出孔板，將其中的培養(yǎng)基吸走，加入150 μL二甲基亞砜，振搖15 min后，通過酶標(biāo)儀在490 nm處測量每孔的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 XRD

(1) 不同生物模板AgBiS2的XRD

圖1為分別以橡膠乳、大豆粉、三七粉、菠菜提取物、苝醌提取物為模板制備的硫化鉍銀材料的XRD?？梢钥吹?，在10°～70°的衍射范圍內(nèi)，5種不同的生物模板制備的AgBiS2樣品呈現(xiàn)出了相似的XRD譜圖。所有的衍射峰均可以歸屬于立方晶相[25]和六方晶[26]AgBiS2的衍射峰。

2/(°)

(2) 不同生物模板Cu3BiS3的XRD

圖2是分別以橡膠乳、大豆粉、三七粉、菠菜提取物、苝醌提取物為模板制備的硫化鉍銅材料的XRD?？梢钥吹?，在10°～70°的衍射范圍內(nèi)，5種不同的生物模板制備的Cu3BiS3材料表現(xiàn)非常相似的衍射圖譜。所有的衍射峰均可以歸屬于斜方晶相Cu3BiS3[27]的衍射峰。

2/(°)

(3) 不同前驅(qū)體合成的Bi2S3的XRD

圖3為不同前驅(qū)體制備的Bi2S3材料的XRD?？梢钥吹?，分別以Bi(NO3)3和BiCl3為前驅(qū)體制備的兩種硫化鉍材料均呈現(xiàn)了相同的衍射峰。所有的衍射峰均可以歸屬于斜方晶相Bi2S3的衍射峰[28]。

2/(°)

2.2 SEM

(1) 不同生物模板AgBiS2的SEM

圖4為用掃描電鏡觀察下不同生物模板制備的AgBiS2樣品的形貌SEM。可以看出，不同生物模板合成的AgBiS2形貌不一，顆粒大小不均一。使用大豆粉為模板合成的AgBiS2(圖4a)，呈現(xiàn)顆粒狀結(jié)構(gòu)；使用苝醌提取物為模板合成的AgBiS2(圖4b)，其結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出雪花狀；使用三七粉為模板合成的AgBiS2(圖4c)，其結(jié)構(gòu)為層狀堆積的多角星形狀；使用橡膠乳為模板合成的AgBiS2(圖4d)，主要為顆粒狀結(jié)構(gòu)，同時(shí)伴有部分須狀形貌的產(chǎn)生；以菠菜提取物為模板合成的AgBiS2(圖4e)，其形貌為團(tuán)聚的顆粒狀結(jié)構(gòu)。

圖4(a)大豆粉；(b)苝醌提取物；(c)三七粉；(d)橡膠乳；(e)菠菜提取物為模板合成的AgBiS2的SEM圖

(2) 不同生物模板Cu3BiS3的SEM

圖5為用掃描電鏡觀察下不同生物模板制備的Cu3BiS3樣品的形貌SEM圖。以大豆模板合成材料的材料(圖5a)，其形貌主要為表面不光滑的不規(guī)則球狀結(jié)構(gòu)；以三七粉為模板合成材料的形貌為由球狀、棒狀和少量塊狀組成結(jié)構(gòu)(圖5b)；以橡膠乳為模板合成的Cu3BiS3的形貌(圖5c)也有多種結(jié)構(gòu)(球狀、片狀和棒狀)的存在；以菠菜提取物模板制備的材料(圖5d)，其形貌主要呈現(xiàn)為片狀、表面長有毛刺的球狀和少量棒狀結(jié)構(gòu) 。

圖5(a)大豆粉；(b)三七粉；(c)橡膠乳；(d)菠菜提取物為模板合成的Cu3BiS3的SEM圖

(3) 不同前驅(qū)體合成的Bi2S3的SEM

圖6是分別以硝酸鉍(a和b)和氯化鉍(c和d)為前驅(qū)體制備的硫化鉍的SEM。根據(jù)XRD的結(jié)果，這兩種前驅(qū)體均可以成功合成Bi2S3材料，但是其形貌卻不同，以硝酸鉍為前驅(qū)體合成的材料呈細(xì)長的棒結(jié)構(gòu)，而以氯化鉍為前驅(qū)體合成的材料為由短粗的棒狀組成的球狀結(jié)構(gòu)。

圖6不同前驅(qū)體(Bi(NO3)3 (a； b)和BiCl3 (c； d))合成的Bi2S3的SEM圖

2.3 抑菌活性

表1總結(jié)出了Bi2S3和Co3+/Bi2S3以及不同生物模板合成的AgBiS2和Cu3BiS3材料的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果。其中Bi2S3和Co3+/Bi2S3均有抑菌圈的產(chǎn)生；對于AgBiS2材料，只有以苝醌提取物為模板的AgBiS2有抑菌圈產(chǎn)生；對于Cu3BiS3材料，5種生物模板合成的材料均有抑菌圈產(chǎn)生，其中苝醌提取物模板的Cu3BiS3產(chǎn)生的抑菌圈較大。

2.4 抑菌實(shí)驗(yàn)的TEM檢測

圖7為不同材料的抑菌作用的TEM，用戊二醛固定作用后的細(xì)菌，以便于觀察。圖7a是抑菌前的枯草芽孢桿菌的TEM，可以看到該細(xì)菌具有完整的細(xì)胞壁。圖7b～7e分別為加入Bi2S3， Co3+/Bi2S3，苝醌提取物/Cu3BiS3和苝醌提取物/AgBiS2材料后抑制枯草芽孢桿菌生長的TEM。

表1 材料的抑菌效果

圖7不同材料的抑菌作用的TEM圖:(a)完整的枯草芽孢桿菌； (b)Bi2S3;(c)Co3+/Bi2S3；(d)苝醌提取物/Cu3BiS3； (e)苝醌提取物/AgBiS2

可以看出在加入棒狀Bi2S3和雪花狀苝醌提取物/AgBiS2抑菌材料后，細(xì)菌的芽孢壁開始收縮變形，表面開始出現(xiàn)凹凸不平的現(xiàn)象；而苝醌提取物/Cu3BiS3抑菌材料后，芽孢壁的一角已經(jīng)破裂，同時(shí)伴有細(xì)胞質(zhì)液體的流出，加入Co3+/Bi2S3抑菌材料后，細(xì)菌的芽孢壁完全破裂，已經(jīng)無法觀察到細(xì)菌原有的結(jié)構(gòu)形貌。該結(jié)果與抑菌圈的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合，進(jìn)一步表明，這些材料對枯草芽孢桿菌有較好的抑菌作用。

2.5 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

通過MTT法測試了硫化物材料對正常細(xì)胞BABL-3T3的細(xì)胞毒性。測試結(jié)果表明：即使在濃度高達(dá)100 μg mL-1的情況下，用硫化物材料培養(yǎng)的BABL-3T3細(xì)胞的細(xì)胞存活率仍高于79%(表2)，表明該材料對于正常細(xì)胞的毒性很低甚至沒有。

表2 細(xì)胞存活率

分別以橡膠乳、大豆粉、三七粉、菠菜提取物、苝醌提取物作為模板劑，采用溶劑熱合成法，制備了具有不同形貌的三元硫化物(AgBiS2和Cu3BiS3)。通過平板抑菌實(shí)驗(yàn)和TEM表征檢測了不同形貌材料對枯草芽孢桿菌的抑制作用，并利用MTT法測試了三元硫化物對正常細(xì)胞的毒性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：具有特殊形貌的Bi2S3(棒狀)、苝醌提取物/AgBiS2(雪花狀)、苝醌提取物/Cu3BiS3(棒狀)等對該細(xì)菌表現(xiàn)出較好的抑菌作用，該材料對正常細(xì)胞BABL-3T3的影響很小甚至沒有，這種特殊形貌材料的抑菌作用體現(xiàn)在抑菌過程的初始階段，即利用其尖銳的結(jié)構(gòu)刺破芽孢表面的細(xì)胞壁而進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)。同時(shí)，硫化物表面游離的金屬離子通過靜電作用進(jìn)一步與芽孢內(nèi)細(xì)胞膜表面的蛋白質(zhì)基團(tuán)結(jié)合，阻礙細(xì)菌進(jìn)行正常的能量代謝，導(dǎo)致芽孢細(xì)菌死亡，最終起到抑菌作用。