李戌彥 楊忠義 紀(jì) 薇 楊明霞

(1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院,山西 太谷 030801;2山西農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹研究所,山西 太谷 030801;3農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山西太原 030031;4果樹種質(zhì)創(chuàng)制和利用山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山西太原 030031)

山楂(Crataegusspp.)屬于薔薇科山楂屬落葉果樹,其果實(shí)含有大量的有機(jī)酸、黃酮類、甾體、有機(jī)胺及低聚黃烷類物質(zhì),營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高[1]。山楂主要分布于東亞、歐洲、北美洲等北溫帶地區(qū)[2],由于我國(guó)地形氣候變化多樣,山楂種質(zhì)資源也較為豐富,現(xiàn)存的主要?dú)W亞種山楂均與我國(guó)山楂有著直接或間接的聯(lián)系?；ㄉ侵参锘ㄆ鞴俜诸愖钪匾男誀钪籟3],也是植物花器官發(fā)育階段界定的主要性狀之一。山楂的花色主要為純白色或紅色,差異極明顯[4]。經(jīng)前期調(diào)查和研究,在開放白色花朵的山楂樹上發(fā)現(xiàn)了芽變產(chǎn)生的粉紅色花朵,該花在完全開放后顏色會(huì)轉(zhuǎn)為粉色,通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、基因注釋、花青素含量測(cè)定等研究,發(fā)現(xiàn)一些基因的表達(dá)可能對(duì)花青苷的含量產(chǎn)生影響,其中包括一個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄家族基因[5]。

MYB類轉(zhuǎn)錄因子,作為綠色植物中影響最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一,可以響應(yīng)外界環(huán)境變化、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、影響物質(zhì)代謝,參與多種生理生化過(guò)程,是目前基因家族研究的重點(diǎn)之一[6]。MYB類轉(zhuǎn)錄因子家族均含一個(gè)或多個(gè)保守度較高的MYB結(jié)構(gòu)域,即MYB DNA-binding結(jié)構(gòu)域,每個(gè)結(jié)構(gòu)域包含1～3個(gè)串聯(lián)且不重復(fù)的、由51～53個(gè)氨基酸組成的R基序[7]。在R基序中,每間隔18個(gè)氨基酸存在一個(gè)起疏水核心作用的色氨酸殘基,每個(gè)R基序中含有3個(gè)色氨酸殘基,其對(duì)維持螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)具有重要意義[8],可以使得形成的高級(jí)結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合DNA大溝[9]。MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白參與多種生理生化反應(yīng)。目前,MYB轉(zhuǎn)錄因子已在芒果[10]、白樺[11]、黑果枸杞[12]、青蒿[13]等植物中進(jìn)行了克隆表達(dá)。楊捷等[14]研究發(fā)現(xiàn)Lhsor MYB12轉(zhuǎn)錄因子可能對(duì)花器官的分化具有調(diào)節(jié)作用。趙佳等[15]研究發(fā)現(xiàn)R2R3-MYB的表達(dá)影響了月季花青苷的合成;Shang等[16]研究發(fā)現(xiàn)MYB轉(zhuǎn)錄因子與bHLH轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)影響了金魚草花色苷的含量,從而導(dǎo)致金魚草脈序和花色的不同。陳哲等[6]發(fā)現(xiàn)菠蘿中的MYB基因可能受到外界乙烯利的調(diào)控,并影響菠蘿的生長(zhǎng)發(fā)育。

植物中調(diào)控花青素生物合成的轉(zhuǎn)錄因子主要有MYB、bHLH和WD40基因家族成員[17]。本研究以前期獲得的不同時(shí)期和顏色的山楂花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ),利用生物信息學(xué)手段,基于山楂轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選、鑒定,從而對(duì)MYB轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行深入挖掘,以期為研究山楂MYB轉(zhuǎn)錄因子對(duì)植物花青苷含量的影響及后期相關(guān)基因功能的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 山楂轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的獲取

試驗(yàn)材料采自山西省太谷縣山西農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所(112.58°E,37.43°N,833 m±4 m),品種為大金星山楂。根據(jù)前期研究,選擇花色苷含量具有顯著差異的時(shí)期進(jìn)行采樣,常規(guī)大金星品種花朵開放初始階段(BB-1)和花朵完全開放后(BB-2)均為白色;大金星芽變品種花朵開放初始階段(BF-1)為白色,花朵完全開放后(BF-2)為粉色[5]。采集后的樣品在液氮環(huán)境中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行RNA提取,并送至北京百邁客生物科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和組裝。

1.2 山楂MYB蛋白序列的獲取

從Pfam(http://pfam.xfam.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)中下載MYB保守結(jié)構(gòu)域的隱馬爾科夫模型文件PF00249,并利用Hmmer軟件在轉(zhuǎn)錄組蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)中進(jìn)行檢索。利用本地BLAST軟件(ncbi-blast-2.10.0+-win64)將檢索結(jié)果構(gòu)建成本地山楂轉(zhuǎn)錄組MYB蛋白二級(jí)數(shù)據(jù)庫(kù),并從Plant Transcription Factor Database(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)下載擬南芥168條MYB轉(zhuǎn)錄因子序列進(jìn)行本地BLAST搜索,將BLAST結(jié)果建成山楂轉(zhuǎn)錄組MYB蛋白三級(jí)數(shù)據(jù)庫(kù)。利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站的Conserved Domain Search功能依次對(duì)結(jié)構(gòu)域種類及數(shù)量進(jìn)行預(yù)測(cè),排除假陽(yáng)性。

1.3 山楂MYB蛋白理化信息分析及motif結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用ExPASy-ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam/)對(duì)山楂MYB蛋白序列的氨基酸數(shù)、理論等電點(diǎn)(protein isoelectric,pI)、分子量、親水性、不穩(wěn)定性進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用WoLF PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)對(duì)MYB基因編碼的蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。利用MEME(http://meme.nbcr.net/meme/cgi-bin/meme.cgi)分別對(duì)篩選出的不同種類的山楂MYB蛋白序列進(jìn)行motif結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

1.4 山楂MYB蛋白序統(tǒng)進(jìn)化樹分析

利用MEGA X對(duì)篩選出的2R-MYB序列及125個(gè)已有研究基礎(chǔ)的擬南芥2R-MYB序列進(jìn)行多序列比對(duì),并采用鄰接法(neighbor-joining)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。1R-MYB系統(tǒng)進(jìn)化樹僅利用篩選出的山楂1R-MYB進(jìn)行構(gòu)建。

1.5 山楂MYB轉(zhuǎn)錄家族基因表達(dá)量分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果,將各個(gè)基因片段的表達(dá)量利用RPKM(reads per kilobasc per million mapped reads)法進(jìn)行計(jì)算,得到表達(dá)量的RPKM值,利用R對(duì)不同品種、時(shí)期MYB蛋白序列的表達(dá)量繪制熱圖進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 山楂MYB基因家族蛋白篩選結(jié)果

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后共得到34.28 Gb有效數(shù)據(jù),經(jīng)過(guò)計(jì)算、處理后共得到18 313條蛋白質(zhì)序列。利用隱馬爾科夫模型文件PF00249進(jìn)行搜索,并將所得序列建立本地BLAST數(shù)據(jù)庫(kù),進(jìn)一步利用擬南芥MYB蛋白序列作為查詢文件進(jìn)行本地BLAST,共得到80條序列。利用NCBI進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)后手動(dòng)篩選,共得到73條山楂MYB家族蛋白序列,其中共含有MYB結(jié)構(gòu)域113個(gè)。根據(jù)Dubos等[7]和Stracke等[18]的分類規(guī)則對(duì)其進(jìn)行分類,最終獲得35條1R-MYB蛋白、36條2R-MYB蛋白、2條3R-MYB蛋白(圖1)。由于3RMYB蛋白數(shù)量較少,因此本試驗(yàn)主要研究1R-MYB蛋白和2R-MYB蛋白。

2.2 山楂MYB基因家族蛋白理化性質(zhì)分析

由表1可知,1R-MYB蛋白序列平均長(zhǎng)度為303.03個(gè)氨基酸,且主要分布在50～350個(gè)氨基酸之間,長(zhǎng)度大于700個(gè)氨基酸的僅2個(gè),最大為786個(gè)氨基酸(CpMYB61),最小為50個(gè)氨基酸(CpMYB53)。而2R-MYB蛋白序列平均長(zhǎng)度為328.14個(gè)氨基酸,長(zhǎng)度主要分布在188～388個(gè)氨基酸之間,長(zhǎng)度小于200個(gè)氨基酸的僅有3條,最大為979個(gè)氨基酸(CpMYB36),最小為88個(gè)氨基酸(CpMYB12)。相較長(zhǎng)度而言,山楂2R-MYB蛋白長(zhǎng)度較1R-MYB蛋白長(zhǎng)。相對(duì)分子質(zhì)量的變化情況與氨基酸長(zhǎng)度變化情況相似。山楂1R-MYB蛋白中有16個(gè)蛋白pI值大于7.5,15個(gè)蛋白pI值小于6.5,4個(gè)蛋白pI值介于6.5～7.5之間;而2R-MYB蛋白中有16個(gè)蛋白pI值大于7.5,16個(gè)蛋白p I值小于6.5,4個(gè)蛋白p I值介于6.5～7.5之間。2R-MYB蛋白中僅CpMYB21(不穩(wěn)定性指數(shù)為38.91)不穩(wěn)定性指數(shù)小于40,屬于穩(wěn)定蛋白,1R-MYB蛋白中只有CpMYB40(28.59)、CpMYB62(34.51)2個(gè)為穩(wěn)定蛋白,其余蛋白均為不穩(wěn)定蛋白。

根據(jù)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)的結(jié)果,篩選出的所有2RMYB蛋白都分布于細(xì)胞核中,1R-MYB蛋白除CpMYB41、CpMYB55、CpMYB62、CpMYB70、CpMYB71主要分布于葉綠體中,CpMYB66主要分布在線粒體中,其余都分布在細(xì)胞核中(表1)。

表1 山楂MYB蛋白理化性質(zhì)及類型Table1 Physicochemical properties and types of MYB protein in haw thorn

表1(續(xù))

3R-MYB蛋白僅篩選出2個(gè),氨基酸數(shù)量分別為592(CpMYB1)和1 033(CpMYB2),3R-MYB蛋白數(shù)量較少,無(wú)法與1R-MYB、2R-MYB進(jìn)行比較,1 033個(gè)氨基酸長(zhǎng)度是本研究中最長(zhǎng)的蛋白。3R-MYB蛋白不穩(wěn)定性指數(shù)均大于40,為不穩(wěn)定蛋白。

2.3 山楂MYB基因家族蛋白motif結(jié)構(gòu)分析

圖2分別為1R-MYB與2R-MYB的motif結(jié)構(gòu),且2R-MYB得到的序列長(zhǎng)度相對(duì)較長(zhǎng)。SMATR進(jìn)一步分析表明,2R motif 4為AT hook結(jié)構(gòu),2R motif 1、2R motif 2、2R motif 3、2R motif 4、2R motif 5、1R motif 1、1R motif 2、1R motif 3均含有SANT結(jié)構(gòu),其中2R motif 5和1R motif 3同時(shí)具有MYB DNA-binding結(jié)構(gòu)。

2.4 山楂MYB基因家族蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

利用125個(gè)擬南芥2R-MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白與篩選的36個(gè)2R-MYB轉(zhuǎn)錄因子共同構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)。根據(jù)Dubos等[7]針對(duì)擬南芥2R-MYB轉(zhuǎn)錄因子家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果對(duì)研究已相對(duì)明確的亞組進(jìn)行編號(hào),共找到23組,其中,共有19個(gè)山楂2RMYB轉(zhuǎn)錄因子匹配到了14個(gè)亞組中。同時(shí),根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹,發(fā)現(xiàn)7個(gè)山楂2R-MYB轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn),且具有一定的聚集性,根據(jù)距離遠(yuǎn)近,將其分為3個(gè)新的亞組,分別為NS1(CpMYB16、CpMYB34、AtMYB91)、NS2(CpMYB29、CpMYB32、CpMYB35、CpMYB36)和NS3(CpMYB5),其中NS1包含一個(gè)擬南芥MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白AtMYB91。

由圖4可知,山楂1R-MYB轉(zhuǎn)錄因子可分為6個(gè)亞組,其中R1S5亞組包含的蛋白數(shù)量最少,僅有2條;R1S6亞組包含的轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量最多,包含13條。

2.5 山楂MYB基因家族表達(dá)分析

根據(jù)山楂轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析(圖5),發(fā)現(xiàn)CpMYB73只在BF-1中表達(dá),其余轉(zhuǎn)錄因子在2種花完全開放前后均有表達(dá)。在白色花分組BB-1 vs BB-2中,有42個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在BB-2時(shí)期的表達(dá)量高于BB-1時(shí)期,30個(gè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量低于BB-1時(shí)期。在花色芽變分組BF-1 vs BF-2中,共有34個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在BF-2時(shí)期表達(dá)量高于BF-1時(shí)期,39個(gè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量低于BF-1時(shí)期。在山楂花完全開放前的分組BB-1 vs BF-1中,有36個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在BF-1時(shí)期的表達(dá)量高于BB-1時(shí)期,37個(gè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量低于BB-1時(shí)期。在山楂花完全開放后的BB-2 vs BF-2中,有28個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在BF-2時(shí)期的表達(dá)量高于BB-2時(shí)期,45個(gè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量低于BB-2時(shí)期。

將山楂轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)按不同分組進(jìn)行差異表達(dá)分析,共找到16個(gè)具有表達(dá)差異的MYB轉(zhuǎn)錄因子(圖6)。4個(gè)分組中,BB-1 vs BB-2中具有10個(gè)差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子,在4個(gè)分組中最多;BF-1 vs BF-2中只有4個(gè)具有差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。僅CpMYB5在4個(gè)分組中都具有差異表達(dá),且在BB-1 vs BB-2和BB-1 vs BF-1兩組中均上調(diào)表達(dá),在BF-1 vs BF-2和BB-2 vs BF-2兩組中均下調(diào)表達(dá)。只在BB-2 vs BF-2中出現(xiàn)的差異表達(dá)基因數(shù)為3個(gè),分別為CpMYB6、CpMYB41、CpMYB45,且 均 上 調(diào) 表 達(dá)。CpMYB42和CpMYB58只在BB-2 vs BF-2和BF-1 vs BF-2中出現(xiàn),且這2個(gè)基因均在BF-2中上調(diào)表達(dá)。

3 討論

研究表明,MYB轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控植物花青苷的生物合成,影響植物花、果、葉等多種器官的顏色[19]。曹雨薇等[20]研究發(fā)現(xiàn)LhMYB12和LhMYB6基因可以調(diào)控百合花被片花青素苷的含量,從而使百合花被片呈現(xiàn)不同的顏色。Liu等[21]發(fā)現(xiàn)在光誘導(dǎo)基因的調(diào)節(jié)下,蘋果MdMYB16和MdMYB308啟動(dòng)子活性被抑制,調(diào)節(jié)了蘋果中的花色苷積累。本研究前期也發(fā)現(xiàn),MYB家族的表達(dá)可以調(diào)控花青苷的積累[5],但未對(duì)MYB家族成員進(jìn)行深度挖掘。本研究通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的深度挖掘,共發(fā)掘出73個(gè)MYB基因家族成員,其中35個(gè)1R-MYB,占比47.95%;36個(gè)2R-MYB,占比49.32%;2個(gè)3R-MYB,占比2.74%。其中1R-MYB占比明顯高于前人對(duì)亞洲百合[22]、小蘭嶼蝴蝶蘭[23]的研究結(jié)果,且在具有差異表達(dá)的MYB轉(zhuǎn)錄因子中也以1R-MYB為主,因此推測(cè)這些1R-MYB轉(zhuǎn)錄因子可能在花青苷的生物合成中具有一定的調(diào)控作用。

目前,擬南芥MYB轉(zhuǎn)錄因子功能的研究較為明晰。為了探究山楂2R-MYB轉(zhuǎn)錄因子的生物學(xué)功能,以擬南芥2R-MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白為參考進(jìn)行研究,系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn),36個(gè)2R-MYB蛋白中僅有19個(gè)進(jìn)入了擬南芥中已被確定功能的14個(gè)亞組。一些亞組的主要作用是利于植物響應(yīng)外界生物與非生物脅迫,如CpMYB23所在的S1可以響應(yīng)脫落酸信號(hào)調(diào)控,并激活細(xì)胞程序化死亡[24];CpMYB24、CpMYB30所在的S11可以應(yīng)對(duì)昆蟲咬傷,在傷后防止脫水[25];CpMYB22所在的S20可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的電解質(zhì)平衡;CpMYB19、CpMYB15所在的S22可在脫落酸的調(diào)節(jié)下影響氣孔的關(guān)閉[26]。還有一些亞組主要用于調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)育,如CpMYB37所在的S9和CpMYB17所屬的S14,可以控制花瓣、花序以及種子的發(fā)育[27];CpMYB12所屬的S4,CpMYB20、CpMYB27所屬的S13,以及CpMYB26、CpMYB31、CpMYB38所在的S21,都具有調(diào)節(jié)木質(zhì)素或纖維素生物合成的功能,影響植物細(xì)胞壁的發(fā)育[28-30]。還有諸如CpMYB13所屬的S2、CpMYB3所屬的S5以及CpMYB4所屬的S7具有影響植物原花青素、多酚及類黃酮物質(zhì)生物合成的功能,協(xié)助調(diào)控植物的次生代謝[31-33]。同時(shí),本研究還發(fā)現(xiàn)了3個(gè)與其他亞組關(guān)系較遠(yuǎn),且進(jìn)化相對(duì)保守的新亞組。新亞組NS1中包含一個(gè)擬南芥MYB轉(zhuǎn)錄因子AtMYB91與兩個(gè)山楂MYB轉(zhuǎn)錄因子,根據(jù)Liu等[34]的研究,AtMYB91對(duì)細(xì)胞中KNOX表達(dá)具有負(fù)調(diào)節(jié)作用,因此NS1亞組的功能可能與其相關(guān)。關(guān)于MYB轉(zhuǎn)錄因子的研究目前主要集中于2R-MYB轉(zhuǎn)錄因子上,對(duì)1R-MYB的研究相對(duì)較少。本研究發(fā)現(xiàn)山楂花朵內(nèi)1R-MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白占所有MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白的比例較高,且在菠蘿[6]、馬纓杜鵑[35]等物種中也存在類似現(xiàn)象,因此將1R-MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白單獨(dú)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。本研究發(fā)現(xiàn),35個(gè)山楂1RMYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白可分為6個(gè)亞組,其中數(shù)量最少的亞組(R1S5)與數(shù)量最多的亞組(R1S6)可能具有相同的來(lái)源,但R1S6內(nèi)進(jìn)化程度更為復(fù)雜,因而推測(cè)R1S6內(nèi)的MYB轉(zhuǎn)錄因子具有更豐富的生物功能。

本研究中,山楂轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的差異表達(dá)分析表明,達(dá)到差異表達(dá)水平的轉(zhuǎn)錄因子共有16個(gè),其中有1個(gè)3R-MYB轉(zhuǎn)錄因子,7個(gè)2R-MYB轉(zhuǎn)錄因子,8個(gè)1RMYB轉(zhuǎn)錄因子。CpMYB2和CpMYB4僅在BB-1 vs BB-2組中差異表達(dá),BB-1與BB-2為白色花的不同時(shí)期,且均在第二時(shí)期上調(diào)表達(dá),因而考慮其主要功能可能是調(diào)控白色花的表達(dá)或控制花的發(fā)育。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),CpMYB4屬于2R-MYB轉(zhuǎn)錄因子,而與其系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系較近的AtMYB11[36]、AtMYB12[37]均可以調(diào)控?cái)M南芥類黃酮生物合成,影響黃酮醇積累的作用,因此推測(cè)CpMYB4轉(zhuǎn)錄因子具有相同的生物學(xué)功能,促進(jìn)了白色花的表達(dá)。CpMYB6、CpMYB41、CpMYB45三個(gè)轉(zhuǎn)錄因子只單獨(dú)出現(xiàn)在BB-2 vs BF-2組中,且上調(diào)表達(dá),由于該分組為芽變品種花朵完全開放前后兩個(gè)時(shí)期的對(duì)比,且在完全開放前后花朵顏色發(fā)生了變化,因此這三個(gè)轉(zhuǎn)錄因子極有可能在山楂花色表達(dá)過(guò)程中起到調(diào)控作用。通過(guò)前人研究,AtMYB26、AtMYB103在花藥發(fā)育、細(xì)胞壁合成和分解、木質(zhì)素生物合成等方面具有調(diào)控作用[38-39],而CpMYB6在系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系上與其相近,因而推測(cè)CpMYB6與其具有類似的生物功能。研究發(fā)現(xiàn),CpMYB56僅在BB-1 vs BF-1組中具有表達(dá)差異,該組為正常山楂和芽變山楂花朵開放初始階段,雖然并無(wú)明顯顏色變化,但其可能參與花朵顏色變化前期的生理過(guò)程,調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步研究確認(rèn)。本研究未發(fā)現(xiàn)單獨(dú)在BF-1 vs BF-2組中差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子,但是發(fā)現(xiàn)了2個(gè)只在BB-2 vs BF-2組和BF-1 vs BF-2組的交集中差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子,分別是CpMYB42、CpMYB58,且均在BF-2中上調(diào)表達(dá),因此CpMYB42和CpMYB58也極有可能調(diào)控山楂花色的形成。CpMYB29僅在BB-1 vs BB-2組和BF-1 vs BF-2組中差異表達(dá),由于這兩組均能體現(xiàn)山楂花開放的過(guò)程,因而猜測(cè)該轉(zhuǎn)錄因子可能與花的生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)。CpMYB22、CpMYB48、CpMYB64均在BB-1 vs BB-2組中下調(diào)表達(dá),在BB-2 vs BF-2組中上調(diào)表達(dá),與CpMYB22系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系交近的AtMYB2主要可以增強(qiáng)植物細(xì)胞的分裂與分化[40],因此推測(cè)CpMYB22可能也具有相同的生物學(xué)功能。CpMYB11、CpMYB12和CpMYB65均在BB-1 vs BB-2組與BB-1 vs BF-1組中下調(diào)表達(dá),由于CpMYB12與AtMYB4系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系較近,而AtMYB4可能參與抑制木質(zhì)素合成,調(diào)控黃酮類化合物合成的功能[41],因而CpMYB12可能也具有相同的生物學(xué)功能,而CpMYB11的功能還有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

本研究利用生物信息學(xué)方法深度挖掘了山楂轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的MYB基因家族成員,共篩選出73個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子,其中35個(gè)為1R-MYB成員,36個(gè)為2RMYB成員,2個(gè)為3R-MYB成員。通過(guò)進(jìn)一步分析,將篩選出的2R-MYB轉(zhuǎn)錄因子按照擬南芥已有的研究基礎(chǔ)進(jìn)行分類,其中有19個(gè)山楂2R-MYB蛋白被匹配到14個(gè)在擬南芥已具有一定研究基礎(chǔ)的亞組中,同時(shí)還利用系統(tǒng)進(jìn)化樹分析的手段,將篩選出的1R-MYB轉(zhuǎn)錄因子分為了6個(gè)亞組。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)分析,發(fā)現(xiàn)CpMYB4、CpMYB6、CpMYB12、CpMYB41、CpMYB42、CpMYB45、CpMYB56、CpMYB58等8個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可能具有調(diào)控山楂花色的功能。本研究為進(jìn)一步研究影響山楂花色的MYB轉(zhuǎn)錄因子提供了參考。