林恬逸 周 認(rèn) 柴明良

(浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院園藝系,浙江杭州 310058)

胚性愈傷組織是禾本科植物分子育種的重要材料,應(yīng)用體細(xì)胞無性系變異技術(shù)是暖季型草坪草改良的有效途徑。利用愈傷組織進(jìn)行突變體篩選的前提條件是建立長期維持再生頻率高的細(xì)胞培養(yǎng)系。在結(jié)縷草(Zoysia.japonicaSieb.et Zucc.)的研究中只有形態(tài)特征為黃色、緊實、非常疏松的愈傷組織類型才具有較高的再生頻率[1]。從長期維持的愈傷組織培養(yǎng)體系中獲得高頻率再生能力的愈傷組織具有重要的價值,能高效、持續(xù)、經(jīng)濟(jì)地為植物生物技術(shù)研究提供材料[2-5]。

溝葉結(jié)縷草[Zoysiamatrella(L.)Merr.],又名馬尼拉草,為禾本科多年生暖季型草坪草,是我國自然分布的5個結(jié)縷草屬草種之一[6]。由于其具有質(zhì)地細(xì)密、坪觀質(zhì)量好、生長勢強(qiáng)、綠期長、傳播快、耐鹽、耐蔭性強(qiáng)和養(yǎng)分需求低等優(yōu)點(diǎn)[7],在我國海南、廣東、臺灣等熱帶地區(qū)及長江以南等亞熱帶地區(qū)廣泛應(yīng)用。溝葉結(jié)縷草主要通過根狀莖和匍匐莖進(jìn)行營養(yǎng)繁殖,相較于傳統(tǒng)的雜交育種,溝葉結(jié)縷草主要利用體細(xì)胞無性系變異和基因工程等新的生物技術(shù)手段進(jìn)行品種的選育[8]。盡管部分研究對結(jié)縷草屬植物離體培養(yǎng)和再生進(jìn)行了報道[9-11],但利用營養(yǎng)器官誘導(dǎo)愈傷組織難度大、周期長,誘導(dǎo)獲得胚性愈傷組織效率低,在實際研究中培養(yǎng)具有高再生能力的可快速生長的結(jié)縷草胚性愈傷組織仍存在較大的困難[12]。經(jīng)過多年的研究,浙江大學(xué)觀賞植物組織培養(yǎng)實驗室建立了一套高效的溝葉結(jié)縷草愈傷組織誘導(dǎo)、胚性愈傷組織分離及長期維持胚性愈傷組織的方法[13],為溝葉結(jié)縷草生物育種奠定了基礎(chǔ)。但研究發(fā)現(xiàn),愈傷組織的長期繼代培養(yǎng)通常會導(dǎo)致其再生能力降低[14],而轉(zhuǎn)基因玉米(Zea maysLinn.)抗性愈傷組織再生的研究中發(fā)現(xiàn),繼代4次時,分化率從80%降至20%[15];在蕪萍[Wolffia arrhiza(L.)Horkelexwimm]愈傷組織誘導(dǎo)中,利用二步法愈傷組織離體培養(yǎng)僅能維持約一年的時間[16];小麥(TriticumaestivumL.)幼胚愈傷組織隨著誘導(dǎo)和繼代間隔時間的延長,愈傷組織分化率迅速下降[17]。隨著培養(yǎng)時間的延長,繼代次數(shù)的增加,溝葉結(jié)縷草的胚性愈傷組織的再生率呈現(xiàn)下降趨勢,繼代6年、8年、10年的愈傷組織再生率約分別為80%、70%和40%[18-20]。在植物組織培養(yǎng)過程中,植物生長調(diào)節(jié)劑對促進(jìn)離體植物組織的生長具有很好的效果[21],因此利用植物生長調(diào)節(jié)劑不斷優(yōu)化完善長期離體的愈傷組織培養(yǎng)體系,對維持其高效的再生能力具有重要的意義。因此,許多研究通過添加不同濃度生長素[2,4-dichlorophenoxyacetic acid(2,4-D)、吲哚乙酸(indole-3-acetic acid,IAA)、萘乙酸(1-naphthylacetic acid,NAA)]、脫落酸(abscisic acid,ABA)、酪蛋白氨基酸、脯氨酸、山梨醇和甘露醇等植物生長調(diào)節(jié)劑和添加劑,恢復(fù)并提高長期培養(yǎng)的禾本科植物如小米[Eleusine coracana(L.)Gaertn][22]、柳枝稷(PanicumvirgatumL.)[23]、玉米[24]等和其他具有經(jīng)濟(jì)效益的植物如苜蓿(MedicagosativaL.)[25]、牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)[26]、草莓(FragariaananassaDuch.)[27]、火龍果(HylocereusundatusBritt.)[28]等植物愈傷組織的再生能力,以此建立愈傷組織長期維持并高效再生的培養(yǎng)體系。

油菜素甾醇(brassinosteroid,BR)是一種調(diào)節(jié)植物發(fā)育和生理過程的類固醇激素,在細(xì)胞分裂、植物莖和根的伸長、光形態(tài)建成、生殖發(fā)育、葉片衰老、脅迫響應(yīng)等方面有著重要作用[29]。目前,生長素[如2,4-D、IAA、NAA、吲哚丁酸(indole-3-butytric acid,IBA)等]和細(xì)胞分裂素[如6-芐基腺漂呤(6-benzyladenine,BA)、噻苯隆(thidiazuron,TDZ)、激動素(kinetin,KIN)、玉米素(zeatin,ZEA)等]是植物組織培養(yǎng)應(yīng)用中最主要的兩類生長調(diào)節(jié)劑[30]。在前期對溝葉結(jié)縷草離體培養(yǎng)和再生體系構(gòu)建和優(yōu)化的過程中發(fā)現(xiàn),生長素和細(xì)胞分裂素對促進(jìn)愈傷組織生長和提高再生效率起到了關(guān)鍵作用[26,31]。而BR作為一類重要的植物激素,在植物組織培養(yǎng)和體細(xì)胞無性系變異中也發(fā)揮著重要功能。油菜素內(nèi)酯(brassinolide,BL)、高油菜素內(nèi)酯(homobrassinolide,HBL)和表油菜素內(nèi)酯(epibrassinolide,EBL)是植物生理研究中應(yīng)用最廣泛的3種油菜素甾醇類物質(zhì)[32]。研究表明,外源BL能促進(jìn)針葉樹和水稻(OryzasativaL.)的胚性組織的形成[33],促進(jìn)甘蔗(Saccharumspp.)嫩芽的離體培養(yǎng)并提高其馴化成活率[34],促進(jìn)花椰菜(Brassicaoleraceavar.boturytis L.)下胚軸不定芽再生[35],促進(jìn)狐米草(Spartinapatens)[36]愈傷組織增殖、生長和再生。外源施用EBL能促進(jìn)高叢藍(lán)莓(VacciniumcorymbosumL.Brigitta blue)[37]再生,對小麥[38]、水稻[39]愈傷組織細(xì)胞伸長和分裂也具有明顯的促進(jìn)作用。

目前,BR對植物組織培養(yǎng)的研究主要集中在其對愈傷組織生長和再生的作用上,對BR參與愈傷組織生長和再生過程的生理變化及其對抗氧化系統(tǒng)的影響研究較少。因此,本研究以EBL為外源植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì),探究不同濃度EBL對溝葉結(jié)縷草愈傷組織生長和再生的影響,研究其對抗氧化系統(tǒng)的作用機(jī)理,旨在選出最優(yōu)EBL濃度,提高長期離體培養(yǎng)的愈傷組織生長及再生的效率,為優(yōu)化溝葉結(jié)縷草繼代和再生體系提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為溝葉結(jié)縷草匍匐莖誘導(dǎo)的胚性愈傷組織,在浙江大學(xué)觀賞植物組培實驗室中繼代培養(yǎng)15年。以MS+2.0 mg·L-12,4-D+1.15 g·L-1脯氨酸+40 g·L-1蔗糖+3.0 g·L-1植物凝膠(Phytagel)為繼代培養(yǎng)基,每4周繼代培養(yǎng)1次。

1.2 試驗方法

1.2.1 EBL對愈傷組織繼代生長的影響 以上述繼代培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基,分別添加不同濃度(0、0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50μmol·L-1)的EBL,以0 μmol·L-1EBL為對照。調(diào)節(jié)pH值至5.8,培養(yǎng)基在121℃下滅菌20 min,備用。選取直徑約3 mm旺盛生長的淡黃色顆粒狀的致密胚性愈傷組織作為外植體,每皿接種20(5×4)塊,稱量初始鮮重,每個濃度梯度設(shè)置5個生物學(xué)重復(fù)。在25±2℃的培養(yǎng)室暗培養(yǎng)4周后測定胚性愈傷組織的直徑(mm)和鮮重(g),計算直徑增長率、鮮重增長率,觀察記錄愈傷組織生長情況并統(tǒng)計褐化率[39]:

1.2.2 EBL對愈傷組織再生的影響 以再生培養(yǎng)基1/2MS+30 g·L-1蔗糖+3.0 g·L-1Phytagel為基本培養(yǎng)基,分別添加不同濃度(0、0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 μmol·L-1)的EBL,以0 μmol·L-1EBL為對照,調(diào)節(jié)pH值至5.8,培養(yǎng)基在121℃下滅菌20 min,備用。愈傷組織在繼代培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)2周后,選取直徑3 mm大小均勻、生長旺盛的愈傷組織,接種至再生培養(yǎng)瓶中,每瓶接種16(4×4)塊,每個濃度梯度設(shè)置5個生物學(xué)重復(fù)。在溫度25±2℃,光照16 h·d-1,光強(qiáng)約為40μmol·m-2·s-1的培養(yǎng)室中進(jìn)行再生。6周后觀察記錄胚性愈傷組織的根、芽的生長情況,分別統(tǒng)計直徑、鮮重增長率、褐化率和再生率:

1.2.3 EBL對愈傷組織繼代和再生過程中生理的影響 分別取繼代培養(yǎng)4周的愈傷組織和再生培養(yǎng)6周的再生植株葉片0.1 g,每個處理重復(fù)3次。取樣后置于4℃預(yù)冷的研缽中,依次加入3mL 50mmol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH值7.8,0.2 mmol·L-1EDTA,1%PVP)進(jìn)行研磨,充分研磨后在4℃、12 000 r·min-1條件下離心20 min,回收上清液。用UV-2550型分光光度計(日本SHIMADZU公司)測定抗氧化酶活性等生理指標(biāo)[40]。由于過氧化氫酶(catalase,CAT)活性在愈傷組織的測定中不穩(wěn)定,不具備統(tǒng)計學(xué)意義,因此繼代培養(yǎng)的愈傷組織測定過氧化物酶(peroxidase,POD),超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量;再生植株葉片測定CAT、POD、SOD活性及MDA含量。CAT活性測定參照Liang等[41]的方法,POD活性測定采用愈創(chuàng)木酚法[42],SOD活性測定采用NBT(氮藍(lán)四唑)光還原法[43],MDA含量采用硫代巴比妥酸法[44]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗結(jié)果均為3或5次重復(fù)的平均值,使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和Duncan’s多重比較(P＜0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度EBL對溝葉結(jié)縷草愈傷組織生長的影響

溝葉結(jié)縷草愈傷組織在含不同濃度的EBL培養(yǎng)基中繼代生長4周后,其直徑、鮮重(表1)及生長狀況(圖1)在各處理間存在明顯差異。當(dāng)EBL濃度為0.02μmol·L-1時,愈傷組織的直徑達(dá)到最大值(6.93 mm),直徑增長率為131.11%;當(dāng)EBL濃度為0.20 μmol·L-1時,愈傷組織鮮重增長量最高,達(dá)到1.24 g,鮮重增長率是對照組的2.9倍;EBL濃度為0.50 μmol·L-1時愈傷組織鮮重增長率是對照組的1.7倍。0.20μmol·L-1濃度的EBL對促進(jìn)愈傷組織鮮重增長明顯,但實際生長情況表明,0.20和0.50μmol·L-1EBL處理組的愈傷組織呈現(xiàn)明顯的白色水漬狀,愈傷組織明顯失去胚性(圖1-f、g)。而0.01和0.02 μmol·L-1EBL對鮮重的增長也有較好的促進(jìn)作用,且愈傷組織胚性維持良好,在繼代過程中始終保持淡黃色、緊致的顆粒狀(圖1-c)。從愈傷組織的褐化率來看,當(dāng)EBL濃度為0.01～0.20μmol·L-1時,愈傷組織褐化率均低于對照,當(dāng)EBL濃度為0.5μmol·L-1時,愈傷組織的褐化率高達(dá)50.0%。綜上表明,適宜濃度的EBL能促進(jìn)愈傷組織的生長,減少褐化發(fā)生,保持愈傷胚性和生長活性,0.02μmol·L-1EBL是促進(jìn)愈傷組織生長的最佳濃度。

2.2 不同濃度EBL對溝葉結(jié)縷草愈傷組織再生的影響

不同濃度的EBL處理后,溝葉結(jié)縷草愈傷組織再生過程表現(xiàn)出明顯差異(表2、圖2)。再生6周后,所有濃度處理組的愈傷組織直徑增長率與對照組均無顯著差異。而從愈傷組織的鮮重增長率和再生率看,0.02μmol·L-1EBL處理組的鮮重增長率和再生率分別達(dá)到了對照組的1.1倍和2.1倍。0.05μmol·L-1EBL處理組的鮮重增長率僅次于0.02μmol·L-1EBL處理組,是對照組的1.11倍,但其再生率高于對照(圖2-d)。從愈傷組織的褐化程度看,再生培養(yǎng)6周后,0～1.00μmol·L-1EBL濃度處理組均有不同程度褐化,且不同組合之間褐化程度差異不顯著,只有在EBL濃度高達(dá)2.00μmol·L-1時,愈傷組織出現(xiàn)明顯褐化(圖2-i)。綜合分析,0.02μmol·L-1EBL處理能提升溝葉結(jié)縷草再生能力,更好地促進(jìn)胚性愈傷組織的再生,而EBL濃度過高則抑制愈傷組織的再生。

2.3 不同濃度EBL對溝葉結(jié)縷草愈傷組織和再生植株生理的影響

2.3.1 不同濃度EBL對繼代過程中愈傷組織生理的影響 不同濃度EBL處理對溝葉結(jié)縷草愈傷組織繼代過程中POD、SOD活性和MDA含量有不同程度影響,但不同濃度的EBL處理對POD、SOD活性和MDA含量的影響的程度存在差異。由圖3-A可知,隨著EBL濃度的增加,POD活性表現(xiàn)出先下降后上升再下降的趨勢,0.01、0.02、0.05和0.10μmol·L-1處理組POD活性均顯著低于對照,說明低濃度EBL抑制POD活性,0.20μmol·L-1EBL處理組POD活性顯著高于對照組,是對照組的1.28倍,該濃度EBL處理對溝葉結(jié)縷草愈傷組織繼代過程中POD的活性具有促進(jìn)作用。由圖3-B可知,當(dāng)EBL濃度達(dá)到0.50μmol·L-1時SOD活性較對照顯著降低了76.76%,說明該濃度EBL對SOD活性有抑制作用;其余濃度處理組SOD活性與對照組差異不顯著,但整體隨EBL濃度增加呈先上升后下降的趨勢。由圖3-C可知,不同濃度EBL對MDA含量也有較大影響,EBL處理組均顯著低于對照組,其中0.02μmol·L-1EBL處理組MDA含量最低,較對照降低了42.78%。

表1 EBL對溝葉結(jié)縷草愈傷組織繼代生長的影響Table1 Effects of EBL on the growth of embryogenic callus in Z.matrella

表2 EBL對溝葉結(jié)縷草愈傷組織再生的影響Table2 Effects of EBL on the growth of embryogenic callus in Z.matrella

綜合分析,在愈傷組織生長過程中低濃度的EBL能降低愈傷組織POD活性,EBL高于一定濃度后能顯著增加愈傷組織的POD活性,而高濃度的EBL對SOD活性具有抑制作用。EBL處理可降低愈傷組織MDA含量,0.02μmol·L-1EBL作用最強(qiáng)。

2.3.2 不同濃度EBL對再生植株生理的影響 不同濃度EBL處理對溝葉結(jié)縷草愈傷組織再生過程中CAT、POD、SOD活性和MDA含量有不同程度影響(圖4)。0.20μmol·L-1EBL處理組未獲得再生植株,以愈傷組織進(jìn)行生理測定,與再生植株葉片生理不能在同一水平進(jìn)行比較,因此在結(jié)果分析中不包含此項數(shù)據(jù)。不同濃度EBL處理組的CAT活性均顯著高于對照組,其中1.00μmol·L-1EBL處理組CAT活性最高,是對照組的5.96倍;相對其他濃度處理組,0.05μmol·L-1EBL處理組CAT活性最低,是對照組的3.70倍。POD活性與CAT一樣均有不同程度的增加。0.50 μmol·L-1EBL處理組POD活性最高,是對照組的2.11倍。SOD活性則隨著EBL濃度增加表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢,0.10μmol·L-1EBL處理組SOD活性顯著高于對照組,其余濃度處理組與對照組差異不顯著。因此,不同濃度的EBL可能通過影響不同的抗氧化反應(yīng)從而對植物再生產(chǎn)生不同影響。再生植株MDA含量變化趨勢與愈傷組織基本相同。不同濃度EBL處理組的MDA含量均低于對照組,0.02、0.05和2.00μmol·L-1EBL處理組與對照差異顯著,其中0.02μmol·L-1處理組MDA含量最低,比對照降低了30.15%。綜合分析表明,EBL對愈傷組織再生過程中CAT、POD、SOD活性具有不同程度的促進(jìn)作用,表明EBL可通過抗氧化反應(yīng)體系調(diào)控溝葉結(jié)縷草愈傷組織再生。

3 討論

BR是具有廣泛生物活性的一類植物激素,研究表明,BR通過與生長素、赤霉素和細(xì)胞分裂素等植物激素的協(xié)調(diào)作用對植物生長進(jìn)行調(diào)控,通過刺激植物的伸長、細(xì)胞分裂和維管發(fā)育而對植物產(chǎn)生生理影響[45]。在各種生物測定中,油菜素內(nèi)酯的活性較生長素如IAA或NAA高10～1 000倍,或與生長素協(xié)同作用[46-47]。Pullman等[33]研究發(fā)現(xiàn)BR刺激體細(xì)胞胚胎發(fā)生,顯著提高了針葉樹和水稻的誘導(dǎo)率;Chavan等[34]發(fā)現(xiàn)BR可能直接或通過刺激生長素和細(xì)胞分裂素來促進(jìn)甘蔗生長;Sasaki[35]在油菜素內(nèi)酯增加花椰菜下胚軸不定芽產(chǎn)生的研究中發(fā)現(xiàn),當(dāng)BR與細(xì)胞分裂素同時作用時,再生率顯著提高,表明BR在誘導(dǎo)分化過程中的部分作用是增加細(xì)胞分裂素的效力。浙江大學(xué)觀賞植物組培實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)施加適宜濃度的細(xì)胞分裂素能促進(jìn)溝葉結(jié)縷草愈傷組織的生長、再生,并加強(qiáng)抗氧化酶的活性。本試驗結(jié)果表明,0.02 μmol·L-1EBL處理的溝葉結(jié)縷草愈傷組織生長及再生能力得到明顯提升,因此,BR對溝葉結(jié)縷草愈傷組織的生長和再生有顯著的促進(jìn)作用,可能通過與細(xì)胞分裂素或生長素等其他激素途徑的協(xié)同作用從而影響其生長和再生。而0.02μmol·L-1EBL處理在試驗期內(nèi)未觀察到肉眼可見的再生芽,可能由于經(jīng)過長期繼代培養(yǎng)的愈傷組織通常再生能力下降,同時形成再生植株需要的時間較長。雖存在上述愈傷組織的特性及肉眼觀察帶來的誤差,但EBL處理的總體趨勢是低濃度EBL促進(jìn)愈傷組織再生,高濃度EBL的促進(jìn)作用下降。

植物體在長期的進(jìn)化過程中形成了一套抗氧化酶系統(tǒng)來清除體內(nèi)的活性氧(reactive oxygen species,ROS),維持植物體內(nèi)正常的新陳代謝,植物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)主要由CAT、POD和SOD等組成。雖然促進(jìn)ROS氧化還原調(diào)節(jié)植物生長和脅迫耐受性的確切機(jī)制仍有待闡明,但是越來越多的證據(jù)支持ROS是激素信號傳導(dǎo)中至關(guān)重要的第二信使,該信號可協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)植物的發(fā)育和脅迫耐受性[48]。研究表明BR能誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生。因此,外源EBL的作用能夠刺激愈傷組織中ROS產(chǎn)生,從而激活植物體內(nèi)抗氧化酶活性。這與本研究EBL處理再生過程中抗氧化酶(CAT、POD、SOD)活性增強(qiáng)的結(jié)果一致。多項研究也表明,植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程與抗氧化酶系統(tǒng)有直接的聯(lián)系,SOD活性升高對早期胚胎發(fā)育和胚性細(xì)胞分化具有促進(jìn)作用,隨著體細(xì)胞胚胎發(fā)生的進(jìn)程,SOD活性表現(xiàn)出先上升后下降并趨于穩(wěn)定的現(xiàn)象,而較低水平的POD活性有利于細(xì)胞的分裂和增殖,當(dāng)胚性細(xì)胞大量形成后,POD活性升高[49-51]。本研究中,繼代過程各EBL處理組POD活性降低,SOD活性無顯著變化,但在較低濃度EBL處理下整體呈上升趨勢,有利于愈傷組織細(xì)胞分裂和增殖,再生過程中EBL處理組CAT、POD、SOD活性均升高,有效促進(jìn)了溝葉結(jié)縷草胚性細(xì)胞的分化和再生。而SOD活性升高但差異不顯著,可能是由于再生6周后,細(xì)胞生長進(jìn)入適應(yīng)期,SOD活性逐漸趨于穩(wěn)定。

MDA是膜脂過氧化的最終分解產(chǎn)物,其含量是反映細(xì)胞膜脂過氧化作用強(qiáng)弱和質(zhì)膜破壞程度的重要指標(biāo),激活抗氧化系統(tǒng)有助于植物去除體內(nèi)過量的ROS和抑制脂質(zhì)過氧化[52]。本研究中,EBL處理溝葉結(jié)縷草愈傷組織繼代和再生過程MDA含量均降低,可能是由于EBL通過BR途徑激活了植物體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng),抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)發(fā)生,從而抑制了MDA的產(chǎn)生和積累。在繼代和再生過程中,0.02μmol·L-1EBL處理組MDA含量最低,說明該濃度下EBL對抗氧化系統(tǒng)活性作用最強(qiáng)。本研究為探究BR調(diào)控溝葉結(jié)縷草體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中生理機(jī)制和分子機(jī)理提供基礎(chǔ)資料,為進(jìn)一步優(yōu)化溝葉結(jié)縷草組織培養(yǎng)體系及對溝葉結(jié)縷草愈傷組織生長與再生過程中關(guān)鍵酶及其相關(guān)的基因研究提供了理論依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明,BR對溝葉結(jié)縷草愈傷組織的生長和再生有明顯的促進(jìn)作用,0.02μmol·L-1EBL顯著提升愈傷組織的再生率,可用于改善體細(xì)胞無性系變異的擴(kuò)繁體系,具有廣泛的應(yīng)用前景。同時,EBL可能通過BR及其他相關(guān)激素途徑激活愈傷組織的抗氧化系統(tǒng)的響應(yīng),加強(qiáng)繼代和再生過程中的抗氧化反應(yīng),從而調(diào)控體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中的生理生化進(jìn)程。