付 琳 任航行 王高富 周 鵬 張 麗 李 杰 董賢文 蔣 婧

(重慶市畜牧科學(xué)院/重慶市山羊工程技術(shù)研究中心,重慶 402460)

黑素皮質(zhì)素1受體(melanocortin 1 receptor,MC1R)屬于有7個跨膜功能域的G蛋白偶聯(lián)受體超家族成員,在哺乳動物中由extension位點編碼,其天然配體為促黑素激素(melanin stimulating hormone,MSH),當(dāng)MCIR被a-MSH激活后,通過活化腺營酸環(huán)化酶,胞內(nèi)的環(huán)腺苷酸 (cyclic adenosine monophosphate,cAMP)水平增加,導(dǎo)致酪氨酸酶的水平增加,最終導(dǎo)致真黑素的產(chǎn)生。Agouti蛋白是其拮抗劑,通過一系列的級聯(lián)反應(yīng),Agouti信號蛋白(Agouti Sigroling protein,ASIP)完全阻斷或是抑制a-MSH與MCIR的結(jié)合,最終產(chǎn)生偽黑素,導(dǎo)致相應(yīng)表型的出現(xiàn)。近年來,MC1R基因的研究多集中于毛色和膚色方面,小鼠[1-2]、豬[3]、牛[4]、馬[5-6]、羊[7]、駱駝[8]、雞[9]、狐貍[10]等物種的毛色變異都與MC1R的多態(tài)性有關(guān)。有關(guān)在皮膚色素沉積的研究主要集中于人上。研究表明,MC1R是人類皮膚最具特征性的變異決定基因,也是與人類皮膚癌相關(guān)的低顯性易感基因,MC1R基因的多態(tài)性與人的皮膚顏色、雀斑情況等還具有顯著的相關(guān)性[11-14]。目前,關(guān)于山羊皮膚黑色素基因的研究較少,且主要集中在不同膚色山羊的皮膚組織形態(tài)學(xué)[15],黑色素生成相關(guān)的miRNA[16]、lncRNA[17]、mRNA[18]的篩選及鑒定方面。

酉州烏羊是我國珍貴的地方特色遺傳資源,是一種全身具烏皮表型的哺乳動物。這種烏皮表型是一類罕見的纖維色素增生現(xiàn)象,此前僅在家禽中出現(xiàn)。酉州烏羊不但具有良好的食、藥兼用性,還可以作為研究人類多種黑變病的自然突變模型。因此,酉州烏羊的烏皮表型是目前研究皮膚黑色素沉積的良好素材,亟需進行深入開發(fā)。本研究對酉州烏羊皮膚MC1R基因進行克隆、生物信息學(xué)及多態(tài)性分析,旨在初步揭示酉州烏羊MC1R的序列特征和蛋白結(jié)構(gòu),為后期酉州烏羊MC1R影響皮膚色素沉積的分子機制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在重慶市酉陽縣酉州烏羊國家級保種場,挑選8只成年酉州烏羊,采集其皮膚組織,液氮保存帶回實驗室后,-80℃冰箱保存。

1.2 MC1R基因克隆試驗方法

使用寶生物工程(大連)有限公司的RNAiso Plus總RNA提取試劑(D9108A)提取組織樣品的總RNA,利用NANODROP 2000超微量分光光度計(Thermo,美國)測定其濃度,凝膠結(jié)果中28 s和18 s條帶的亮度和寬度比例為2∶1的RNA進行反轉(zhuǎn)錄,具體步驟參照cDNA Amplification Kit試劑盒(TaKaRa,大連)說明書操作步驟進行,將合成的cDNA置于-20℃保存?zhèn)溆?。擴增目的基因的PCR體系為25μL,包括50μg·μL-1cDNA 2.5μL、10×Taq DNA polymerase buffer(Mg2+Plus)2.5 μL、2.5 mmol·L-1dNTPs mixed(TaKaRa,大連)2.0 μL、10μmol·L-1上下游引物各0.75μL、5 U·μL-1Ex Taq DNA polymerase(TaKaRa,大連)0.25μL,加水補足。以NCBI的山羊序列KT247426為參考,采用Prime 5.0軟件設(shè)計引物,其中克隆引物序列為F:5′-CCTGAG AGCAAGCACCCTTTCC-3′;R:5′-GAGCGGGACTTCCCA CAGCT-3′。目的基因PCR反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,65℃退火30 s,72℃延伸1min,35個循環(huán);72℃延伸5min終止反應(yīng)。目的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠檢測后,將擴增效果良好的特異性PCR產(chǎn)物原液送至上海生工生物技術(shù)公司測序。

1.3 多態(tài)性檢測

1.3.1 試驗材料 采集196只山羊血樣,包括合川白山羊43只,巫溪白山羊19只,重慶市酉陽縣本地白山羊66只、酉州烏羊68只,每只山羊靜脈采血2 mL,-80℃冰箱保存。

1.3.2 基因組DNA的制備 采用TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]從山羊全血中提取基因組DNA,利用核酸定量儀(NANODROP 2000,美國Thermo)和瓊脂糖凝膠電泳方法對已提取DNA進行濃度檢測,用TE緩沖液(Tris-EDTA bufler solution)稀釋至50 ng·μL-1濃度,4℃冰箱保存。

1.3.3 引物設(shè)計及酶切反應(yīng) 以NCBI上山羊MC1R基因組序列NC_022310為參考,采用Prime 5.0軟件設(shè)計引物,酶切引物序列為F:5′-AGTGCCTGGAGGTG TCCATCC-3′;R:5′-CTGACGCTCACCAGCAGGT-3′。PCR擴增體系為25μL,包含2×Master Mix Taq酶12.5μL、上下游引物各0.4μL(10μmol·L-1)、DNA模板1.0μL(50 ng·μL-1),加入ddH2O補足。PCR反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸90 s,35個循環(huán);72℃后延伸5 min,4℃終止反應(yīng)。

MC1R基因酶切體系為10μL,包含Hpy188III限制性外切酶2μL、DNA擴增產(chǎn)物5μL、10×NEBuffer 1 μL,加入ddH2O補足至10μL。37℃水浴1 h。PCR產(chǎn)物先用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測,將特異性的只有目的條帶的產(chǎn)物進行酶切,酶切產(chǎn)物用5.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測,記錄帶型與相應(yīng)的個體。

1.4 生物信息學(xué)分析

克隆結(jié)果分析:以NCBI數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的山羊序列為基礎(chǔ),用DNAStar軟件包對酉州烏羊MC1R基因序列進行校正和編輯。運用開放閱讀框(open reading frame,ORF)軟件對本研究山羊序列的ORF進行查找,確定目的基因編碼序列(coding sequence,CDS)的范圍。在NCBI數(shù)據(jù)庫中同源搜索,根據(jù)酉州烏羊MC1R基因與其他物種的CDS序列的一致性,確定所獲序列是否為目的基因序列;利用Clustal X(1.83)進行序列比對,Mega 5.0進行變異位點輸出、分析酉州烏羊與各物種MC1R的進化關(guān)系。酉州烏羊MC1R蛋白的理化性質(zhì)分析采用ExPASy服務(wù)器軟件(http://web.expasy.org/protparam/),保守結(jié)構(gòu)域采用BLAST程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)分析,疏水性分析和跨膜結(jié)構(gòu)分析分別采用ExPASy服務(wù)器軟件(http://web.expasy.org/protparam/)和TMHMM server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0)。蛋白質(zhì)功能位點采用ExPASy服務(wù)器軟件(http://expasy.org/prosite/)進行分析。二級結(jié)構(gòu)用在線軟件 SOPMA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa)。三級結(jié)構(gòu)利用同源建模預(yù)測(http://www.expasy.org/swissmod/SWISSMODEL.html)。

多態(tài)性檢測結(jié)果分析:利用凝膠成像系統(tǒng)結(jié)合人工判讀,進行基因分型。在此基礎(chǔ)上,利用PopGen32軟件(version 4.2)估算等位基因頻率、等位基因數(shù)和期望雜合度。運用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行χ2獨立性檢驗,并進行關(guān)聯(lián)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的鑒定

擴增酉州烏羊的MC1R基因,得到長度為1 273 bp的特異性清晰條帶(圖1),其包含酉州烏羊MC1R基因954 bp的CDS序列,共編碼317個氨基酸(圖2),酉州烏羊MC1R基因編碼區(qū)還存在唯一的異義替換c.676A＞G,其編碼的氨基酸在226位由賴氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝彼?氨基酸由堿性轉(zhuǎn)變?yōu)樗嵝浴?/p>

在NCBI數(shù)據(jù)庫中對酉州烏羊的MC1R基因進行BLAST搜索比對,結(jié)果顯示,酉州烏羊的MC1R基因與黑山羊(KT247426.1)、綿羊(NM_001282528.1)、藏羚羊(XM_005956360.1)、普通牛(KP182074.1)、瘤牛(XM_019979538.1)、牦牛(XM_005892429.1)、美洲野牛(XM_010843928.1)等物種MC1R基因的同源性分別高達99%、99%、98%、96%、96%、96%和96%,揭示該基因確為酉州烏羊MC1R基因。

2.2 物種間氨基酸序列比對

將酉州烏羊MC1R基因編碼的氨基酸序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列進行比對,由圖3可知,?？莆锓NMC1R氨基酸序列分為一枝,其與其他哺乳動物同源性較低,這一結(jié)果與動物進化規(guī)律較為一致。此外,酉州烏羊與其他物種MC1R氨基酸序列的第226位氨基酸上,酉州烏羊表現(xiàn)為谷氨酸,其他物種全部為賴氨酸,氨基酸由堿性轉(zhuǎn)變?yōu)樗嵝?位于MC1R蛋白結(jié)構(gòu)第3個細(xì)胞內(nèi)環(huán)上。

2.3 MC1R蛋白質(zhì)分析

對蛋白理化性質(zhì)進行分析,結(jié)果顯示,酉州烏羊MC1R蛋白質(zhì)的分子式為C1603H2565N411O410S22,原子總數(shù)為5 011,蛋白分子質(zhì)量為34 860.83,理論等電點為8.78。MC1R的氨基酸組成中,亮氨酸(Leu,L)數(shù)量最多,總數(shù)為55個,占17.4%;丙氨酸(Ala,A)數(shù)量其次,總數(shù)為31個,占9.8%;賴氨酸(Lys,K)和色氨酸(Trp,W)數(shù)量最少,各有4個,占1.3%。總的帶負(fù)電殘基(Asp+Glu)為13,總的帶正電殘基(Arg+Lys)為20。其消光系數(shù)在280 nm波長時為36 285,不穩(wěn)定系數(shù)為38.03,說明該蛋白是穩(wěn)定蛋白。MC1R的整個肽鏈中,共有241個親水性氨基酸殘基,68個疏水性氨基酸殘基,且在第191位氨基酸處具有疏水最大值3.211,在第229位氨基酸處具有疏水最小值-2.589,總平均親水性為0.894,是一個疏水蛋白,推斷MC1R是一種不可溶性蛋白(圖5)。TMHMM在線預(yù)測顯示,MC1R有7個跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域,其N端在細(xì)胞外伸展,C端在細(xì)胞內(nèi)伸展,在兩者之間有許多環(huán)結(jié)構(gòu),跨膜結(jié)構(gòu)域的氨基酸組成分別是44-63AA、76-98AA、118-140AA、161-183AA、187-209AA、245-267AA、282-300AA(圖6)。用NCBIConserved Domain Search預(yù)測酉州烏羊MC1R蛋白功能域,結(jié)果顯示(圖7):MC1R蛋白有3個保守結(jié)構(gòu)域,7tm_4結(jié)構(gòu)域由45-174AA組成,屬于跨膜受體;7tm_1結(jié)構(gòu)域由55-298AA組成,屬于GCPRs受體,主要接受光刺激和G蛋白激活;PHA03087由130-314AA組成,屬于臨時的G蛋白受體。酉州烏羊第226位氨基酸的異義替換位于其7tm_1結(jié)構(gòu)域上,可能影響MC1R G蛋白激活,進而影響皮膚黑色素的形成。

對酉州烏羊MC1R進行蛋白質(zhì)功能位點預(yù)測顯示,其有4個功能位點,分別是1個蛋白激酶C磷酸化位點,2個N端糖基化位點,3個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點,4個N端豆蔻酰化位點(表1)。酉州烏羊第226位氨基酸的異義替換位于其酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點上,可能影響MC1R蛋白的磷酸化。

2.4 MC1R編碼蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析

酉州烏羊MC1R蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果見圖8,其中構(gòu)建α-螺旋的氨基酸為189AA(59.62%),構(gòu)建延伸鏈的氨基酸為48AA(15.14%),構(gòu)建β轉(zhuǎn)角的氨基酸為61AA(19.24%),氨基酸序列大部分都用于構(gòu)成α-螺旋。

2.5 MC1R編碼蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)分析

用Swiss-model在線軟件進行蛋白三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測,酉州烏羊MC1R第226位氨基酸顯示為谷氨酸(E)的為突變型,顯示為賴氨酸(K)的為野生型,構(gòu)建出的突變型與野生型在其226位氨基酸的氫鍵構(gòu)成上有較大差異,空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化(圖9)。

2.6 MC1R多態(tài)性分析

2.6.1MC1R酶切結(jié)果 以酶切引物擴增山羊MC1R基因片段,PCR片段長度為190 bp,經(jīng)酶切反應(yīng)后,酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖10所示。酶切反應(yīng)共顯示3種基因型,分別為AA型72 bp+118 bp,AG型190 bp+118 bp+72 bp,GG型190 bp。

2.6.2MC1R群體遺傳分析 以酉州烏羊MC1R基因的CDS為參考序列(核苷酸差異位點的定位以山羊CDS起始密碼子的第一位核苷酸為+1),將參考序列與本研究所測得的序列進行比對分析。由表2單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)檢測結(jié)果可知,MC1R基因c.676A＞G變異位點在合川白山羊、巫溪白山羊、本地白山羊、酉州烏羊中共享,且在4個品種的山羊中雜合度均較低。Hardy-Weinberg平衡檢驗結(jié)果表明,SNP676位點都處于平衡狀態(tài)(P＞0.05)。

表1 MC1R蛋白功能位點預(yù)測Table1 The prediction of MC1R protein functional sites

2.6.3MC1R多肽性與膚色性狀關(guān)聯(lián)性分析 對合川白山羊、巫溪白山羊、本地白山羊、酉州烏羊MC1R基因的基因型進行統(tǒng)計并列聯(lián)表獨立性檢驗,由表3可知,c.676A＞G位點的各基因型在皮膚白色和烏色山羊群體中的分布差異不顯著(P＞0.05)。

表2 MC1R基因編碼區(qū)的遺傳多樣性Table2 The genetic variations for coding region of MC1R

表3 MC1R基因的SNP基因型與皮膚烏質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析Table3 Correlation analysis between goat skin melanin traits and SNP genotypes on MC1R gene

3 討論

生物信息學(xué)技術(shù)可以分析基因序列所含的遺傳信息,研究基因所控制形成的蛋白產(chǎn)物,并揭示其表達的生物學(xué)意義[19]。本研究從酉州烏羊皮膚中成功擴增出MC1R基因的cDNA序列,其CDS為954 bp,共編碼317個氨基酸,基因序列同源性比較和進化樹分析都顯示了酉州烏羊與各物種MC1R的較高同源性。與其他G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors,GPCRS)一樣,酉州烏羊MC1R有7個α-螺旋組成的跨膜結(jié)構(gòu)域,細(xì)胞內(nèi)C-末端具有?；稽c,細(xì)胞外N末端連接糖基化位點[20]。MC1R的C末端通常將蛋白質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運輸?shù)窖獫{,還負(fù)責(zé)質(zhì)膜上G蛋白受體的相互作用[21-22],細(xì)胞外N末端負(fù)責(zé)配體親和力和信號錨的作用[23-24]。本研究結(jié)果表明,MC1R基因可在酉州烏羊皮膚組織表達,主要于細(xì)胞膜上發(fā)揮作用,這與其存在于黑色素細(xì)胞表面,接受α-MSH信號,進而調(diào)控膚色的功能相一致。此外,酉州烏羊MC1R(c.676A＞G)突變還導(dǎo)致其226位氨基酸上發(fā)生了賴氨酸與谷氨酸的異義替換,氨基酸由堿性轉(zhuǎn)變?yōu)樗嵝?異義替換同時位于其跨膜結(jié)構(gòu)的第三個細(xì)胞內(nèi)環(huán)和負(fù)責(zé)接收光刺激和G蛋白激活的7tm_1結(jié)構(gòu)域上。此外,在MC1R第226位氨基酸上,其他物種都十分保守,氨基酸都為賴氨酸。前人研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)MC1R環(huán)狀結(jié)構(gòu)上的突變發(fā)生在關(guān)鍵位點時,可能會降低其受體的功能、降低與MSH的偶聯(lián)程度以及cAMP信號的傳導(dǎo)水平,使真黑素與偽黑素的合成發(fā)生轉(zhuǎn)換,并導(dǎo)致潛在誘變[25]。因此,研究初步推測酉州烏羊MC1R(c.676A＞G)突變可能對酉州烏羊皮膚黑色素的沉淀有影響。對酉州烏羊MC1R突變型與野生型三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果還顯示出其226位氨基酸的氫鍵構(gòu)成有較大差異,空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,這一預(yù)測結(jié)果進一步為本研究的初步論斷提供了佐證。

本研究對山羊MC1R基因多態(tài)性檢測發(fā)現(xiàn),c.676A＞G變異位點在重慶合川白山羊、巫溪白山羊、本地白山羊、酉州烏羊中共享,且c.676A＞G位點的各基因型在皮膚白色和烏色山羊群體中的分布差異不顯著(P＞0.05),這一結(jié)果與Pe?agaricano等[26]的研究結(jié)果一致。Pe?agaricano等[26]發(fā)現(xiàn)MC1R在皮膚中的表達量與考力代綿羊的白色皮膚和黑色斑點無關(guān),并且提出了一些可能與皮膚黑色斑點沉積性狀有關(guān)的新的候選基因(C-FOS基因和KLF4基因)。但Ren等[17]對酉州烏羊和渝東白山羊不同膚色山羊的100 d胎兒皮膚進行轉(zhuǎn)錄組水平分析以及差異表達基因分析發(fā)現(xiàn),ASIP-MC1R的相互作用可能在胎兒山羊皮膚色素沉著的測定中發(fā)揮重要作用。Hepp等[27]研究還發(fā)現(xiàn),MC1R和ASIP基因多態(tài)性與毛色分離極顯著相關(guān),所有的白色個體都是MC1R隱性等位基因(E+)且攜帶多拷貝的ASIP等位基因,顯示兩個基因的互作是克里奧爾羊毛色變異的主要原因。以上結(jié)果都預(yù)示著MC1R基因在影響羊皮膚黑色素沉積過程中的作用機制可能存在基因互作關(guān)系。目前,MC1R基因已發(fā)現(xiàn)有100多個非同義突變位點,MC1R基因多態(tài)性與皮膚相關(guān)性的研究多集中在人上。對歐美人群的研究發(fā)現(xiàn),人MC1R變異體R151C、R160W、D294H與白皮膚、雀斑有一定的關(guān)系,這些變異體不僅可以降低受體功能,降低對MSH的反應(yīng),在體外降低與cAMP的功能,還與特定的表型相關(guān),且MC1R等位基因變異的強弱可直接或間接反映信號傳導(dǎo)通路受損的程度,最終導(dǎo)致黑素趨向于偽黑素的合成[28-31]。中國漢族人群MC1R多態(tài)性與膚色變異的關(guān)聯(lián)研究共發(fā)現(xiàn)了2個較為重要的SNP位點,其中SNP274與皮膚顏色及雀斑有相關(guān)性,SNP421與皮膚顏色、對陽光的敏感性、雀斑等具有一定的相關(guān)性[32-33]。諸多研究結(jié)果顯示,MC1R基因確實可影響皮膚黑色素的沉積,但其作用機制較為復(fù)雜,可能與基因的互作、等位基因變異的強弱、信號通路、皮膚顏色、對陽光的敏感性等有關(guān)。本研究中,SNP676在皮膚白色和烏色山羊群體中的分布差異不顯著,但其突變的位置在接收光刺激和G蛋白激活的7tm_1結(jié)構(gòu)域上,其是否影響受體的功能、降低與MSH的偶聯(lián)程度以及cAMP信號的傳導(dǎo)水平、通過與ASIP等黑色素沉積的關(guān)鍵候選基因互作影響皮膚的黑色素沉積等問題還需要進一步深入研究。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)酉州烏羊MC1R基因CDS序列c.676A＞G突變,導(dǎo)致226位氨基酸上發(fā)生了賴氨酸與谷氨酸的異義替換,突變位于其跨膜結(jié)構(gòu)的第三個細(xì)胞內(nèi)環(huán)和負(fù)責(zé)接收光刺激和G蛋白激活的7tm_1結(jié)構(gòu)域上,還位于其酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點上,氨基酸的異義替換于造成了酉州烏羊MC1R空間構(gòu)象的差異,推測c.676A＞G可能影響MC1R G蛋白激活,進而影響酉州烏羊皮膚黑色素的沉淀。群體變異檢測發(fā)現(xiàn),c.676A＞G變異位點在重慶合川白山羊、巫溪白山羊、本地白山羊、酉州烏羊中共享,但各基因型在皮膚白色和烏色山羊群體中的分布差異不顯著(P＞0.05)。綜上所述,MC1R基因可能影響酉州烏羊皮膚黑色素沉積,但其突變影響黑色素沉積的作用機制較為復(fù)雜,c.676A＞G突變并不是酉州烏羊皮膚黑色素沉積的直接影響因素,其還可能通過與ASIP基因的互作、激活下游G蛋白受體等影響黑色素的沉淀,具體機制還需進一步研究。