Zabihullah Sherzad 楊 娜 張 靜 張 蕓 周 恒 唐燦明

(南京農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院,江蘇 南京 210095)

黃萎病是危害棉花產(chǎn)量和品質的主要真菌病害,由土壤傳播的大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)引起[1],該病菌能形成休眠的微菌核在土壤中存活多年,很難得到有效的防治[2]?？剐云贩N的選擇是控制黃萎病最有效、最經(jīng)濟、最直接的方式,但在實際研究中缺乏高抗性陸地棉品種[3]。輪作的種植方式對防治黃萎病較為有效,但因勞動力需求大,在實際栽培中無法進行大規(guī)模推廣,且在棉花中鮮有適合防治黃萎病的選擇性殺菌劑[4]。目前生物防治已經(jīng)成為重要的防治方法之一。內生細菌天然存在于植物體內,對環(huán)境友好[5]。因此,內生菌生物制劑的使用可能是控制大麗輪枝菌的有效途徑之一[6]。棉花植株內部存在內生菌中,部分菌株對黃萎病菌具有抑菌活性,從中篩選逆境耐受性強、防效穩(wěn)定的生防菌是控制棉花黃萎病的重要途徑之一[7-8]。

前期在南京市六合區(qū)農(nóng)業(yè)研究農(nóng)場獲取冀棉11根系,從中分離得到一株對大麗輪枝菌抗性明顯的內生細菌菌株489-2-2。為鑒定棉花內生細菌489-2-2對棉花黃萎病的防效及研究該菌株抗性機理,本研究以489-2-2及冀棉11為研究對象,通過平板擴散法、分子鑒定、浸種法、灌根法及防御酶活性檢測,旨在為該菌株的利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

大麗輪枝菌菌株Vd080由作物遺傳與種質創(chuàng)新國家重點實驗室提供,并保存在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基上;489-2-2菌株(冀棉11根系中分離得到),棉花種子(品種:冀棉11)由作物遺傳與種質創(chuàng)新國家重點實驗室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 489-2-2菌株體外抑制黃萎病菌Vd080的效應檢測 參考Han等[9]的平板擴散法。用無菌打孔器在培養(yǎng)基對立側等距離打兩個孔,處理孔加入10 μL 489-2-2菌株在37℃培養(yǎng)箱中的過夜培養(yǎng)物,對照孔加入10μL無菌LB(Luria-Bertani)溶液,每處理設3次重復,平板置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d。挑取抑菌圈邊緣大麗輪枝菌Vd080菌絲,在BX53 Olympus顯微鏡(日本Olympus公司)下觀察形態(tài)變化。培養(yǎng)皿上Vd080無489-2-2菌株互作區(qū)挑取菌絲作對照。鑒定489-2-2菌株發(fā)酵液的拮抗活性,將489-2-2菌株的發(fā)酵液涂布在PDA培養(yǎng)基上,在培養(yǎng)基中央放置直徑0.6 cm的Vd080分生孢子菌塊,加LB溶液作為對照,7 d后測量Vd080的菌落直徑。

1.2.2 489-2-2菌株分子鑒定和生理功能分析 將489-2-2菌株置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h,取2 mL菌液8 000 r·min-1離心2min,收集菌體,參考Long等[10]的方法提取該菌株基因組DNA。用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R(5′-GGTTAC CTTGTTACGACTT-3′)通過PCR擴增16S rDNA基因區(qū)域[11]。提取的DNA送北京華大基因技術有限公司進行測序。將序列與NCBI中的其他序列進行比較[12],使用ClastalX 2.0對多個序列進行比對,并使用MAGE 7.2軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹,確定菌株的分類地位。

1.2.3 體內定殖檢測 將表面滅菌的棉花種子浸入用0.5%羧甲基纖維素溶液(carboxymethyl cellulose,CMC)重懸的489-2-2菌懸液(OD600=0.2)中3 h,再將種子浸入2.5%戊二醛溶液中固定,以僅浸泡在0.2%CMC中的種子作對照,播種在含有滅菌蛭石培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中(所有操作均在無菌工作臺進行)。25℃培養(yǎng)7 d后,收獲棉花幼苗,保存在2.5%戊二醛溶液中,用透射電子顯微鏡觀察棉花主根系3～4 cm處,確定489-2-2在棉花幼苗根系中的定殖[13]。1.2.4 489-2-2菌株對棉花黃萎病菌Vd080的防效測定 按照Han等[9]的方法制備細菌懸浮液。將489-2-2菌株接種到LB培養(yǎng)液中,170 r·min-1、37℃振蕩培養(yǎng)12 h,然后10 000 r·min-1離心5 min,保留沉淀,并將沉淀重懸于0.5%CMC溶液中用作浸種處理劑(將沉淀重新懸浮在無菌蒸餾水中用作灌根處理劑)。

植株采用種子浸泡法和灌根法進行處理[14]。種子浸泡法:將滅菌的種子置于無菌蒸餾水浸泡12 h,再用0.5%CMC重懸的489-2-2菌懸液(OD600=0.2)浸泡3 h,將無菌蒸餾水浸泡的種子再浸入與重懸菌液相同體積的滅菌的0.5%CMC溶液中作為對照,將處理后的種子播種在裝有無菌蛭石培養(yǎng)基的塑料杯中,在25℃、相對濕度80%、光照強度10 000 Lx的溫室中培養(yǎng)兩周后觀察植株生長狀況。灌根法:在塑料杯中播種棉花種子,25℃條件下培養(yǎng)14 d(光周期為14 h光照/10 h黑暗)后,在每株幼苗的根部(以無菌蒸餾水為對照)接種20 mL 489-2-2細菌懸浮液(OD600=0.2)。在棉花6片真葉期,用大麗輪枝菌Vd080孢子液接種浸泡法和灌根法處理的棉花植物。接種后10 d,按病害嚴重程度分級調查。

根據(jù)黃化、葉壞死或落葉的比例將病害分為四級,用0～4表示病害嚴重程度,其中0級為無癥狀,1級為輕度邊緣黃化,2級為中度邊緣黃化,3級為中度枯萎和可見壞死,4級為嚴重枯萎和落葉。病情指數(shù)(leaf wilt index,LWI)和生物防治效力計算公式如下:

1.2.5 棉花植株H2O2檢測和胼胝質沉積測定 參照吳穎靜等[16]的3,3-二氨基聯(lián)苯胺(3,3-diaminobenzine,DAB)組織染色法,檢測內生菌誘導棉花葉片細胞中H2O2的產(chǎn)生和積累。分別取Vd080分生孢子懸浮液(OD600=0.2)和489-2-2細菌懸浮液(OD600=0.2)與Vd080相互作用區(qū)的分生孢子發(fā)酵液(OD600=0.2)涂抹處理棉花葉片24 h,放入1mg·mL-1DAB染色液中染色8 h(25℃),加入無水乙醇脫色至無綠色,用蒸餾水重新懸浮后進行鏡檢。以無菌蒸餾水處理的葉片為對照。

取長勢一致、有3～4片真葉的棉花幼苗,用灌根法分別接種Vd080孢子懸浮液(OD600=0.2)和489-2-2孢子懸液(OD600=0.2)與Vd080相互作用區(qū)的分生孢子發(fā)酵液10 mL,接種48 h后取真葉,參照陸燕等[17]的方法進行葉片胼胝質含量測定。在乙醇∶乙酸為3∶1的固定液中固定2～3 h,脫去葉綠素,然后取出葉片放入70%乙醇中脫水2 h,再于50%乙醇中復水2 h后,蒸餾水中過夜;用水漂洗葉片2～3次后,放在10%NaOH溶液中,37℃恒溫處理1～2 h直至透明,然后用蒸餾水漂洗葉片3～4次,于0.01%苯胺藍中黑暗培養(yǎng)3～4 h,待染色結束后,將葉片放在載玻片上,在熒光體視顯微鏡下用紫外激發(fā)光觀察胼胝質的含量。對照組接種10 mL無菌水。

1.2.6 棉花植株防御酶的測定 采用灌根法對2周齡棉花幼苗進行處理,分別于處理0、24、72、96、168 h時采集根系樣本,在液氮中研磨后保存于-70℃。

多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)活性的測定參考楚博等[18]的方法。取0.2 g液氮研磨均勻的根系樣本,加入1 mL 0.05 mol·L-1磷酸緩沖液(pH值5.5),震蕩混勻后于4℃、12 000 r·min-1條件下離心15 min,保留上清液;取0.5 mL上清液,加入1.0 mL 0.1mol·L-1鄰苯二酚溶液和1.5mL 0.05mol·L-1磷酸緩沖液(pH值5.5),立即計時,于420 nm波長處每隔1 min測定其吸光度值,測定3次。以0.5 mL 0.05 mol·L-1pH值5.5的磷酸緩沖液為對照。按照公式計算PPO活性:

式中,W表示樣品重量;Δt表示反應時間;Vt表示提取酶溶液的總體積;Vs表示光密度測量時取的酶液體積。

過氧化物酶(peroxidase,POD)活性的測定參照李安優(yōu)等[19]的方法。取0.2 g液氮研磨均勻的根系樣本,加入1mL 0.1mol·L-1磷酸緩沖液(pH值5.5),震蕩混勻后于4℃、12 000 r·min-1條件下離心15 min,保留上清液;取0.1 mL上清液,加入2.9 mL 0.05 mol·L-1磷酸緩沖液、1 mL 0.05 mol·L-1愈創(chuàng)木酚和1 mL 2%H2O2,混合后立即在470 nm波長下測定其吸光度值,每隔1 min讀數(shù)一次,共測3次。按照公式計算POD活性:

式中,Vt表示提取酶溶液的總體積;W表示樣品重量;t表示反應時間;Vs表示測量時取的酶液體積。

苯丙氨酸解氨酶(L-phenylalanine ammonia-lyase,PAL)活性的測定參照馮建雄等[20]的方法并略作修改。取1 g根系樣本,加入5 mL 0.1 mol·L-1磷酸緩沖液[含1%聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone,PVP)]和少量石英砂在含有液氮的研缽內充分研磨,研磨液于4℃、12 000 r·min-1條件下離心15 min,收集的上清液即為酶粗提液。取1 mL酶粗提液,加入1 mL 0.02 mol·L-1苯丙氨酸測定液和2 mL ddH2O,于30℃水浴30 min后立即加入0.1 mL 5 mol·L-1HCl終止反應。用infinite M2000酶標儀(瑞士TECAN公司)測量其在290 nm波長處的吸光度值。對照組以ddH2O代替0.02 mol·L-1苯丙氨酸。按照公式計算PAL活性:

式中,Vt表示酶液總體積;FW表示樣品鮮重;Vs表示測定時取酶液的量;t表示反應時間。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用MicrosoftOffice Excel2007整理試驗數(shù)據(jù),應用IBM SPSSStatystic 22軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析。各試驗均設3次重復。

2 結果與分析

2.1 489-2-2菌株發(fā)酵液對黃萎病菌Vd080的抑菌效應

平板擴散試驗中,在489-2-2發(fā)酵液周圍觀察到明顯的抑菌圈,而對照LB溶液周圍無抑菌圈(圖1-A)。用顯微鏡觀察內生菌株附近的Vd080菌絲,菌絲表現(xiàn)出形態(tài)的變化,包括卷曲、膨大、變黑和腫脹等,細胞質濃縮,在腫脹的菌絲體中觀察到隔膜(圖1-C),而對照LB溶液周圍的大麗輪枝菌Vd080菌絲形態(tài)正常(圖1-B)。由于發(fā)酵液的作用,培養(yǎng)皿中心Vd080菌圈的平均直徑為0.65 cm,幾乎所有的分生孢子都未萌發(fā)(圖1-D),而對照LB溶液培養(yǎng)皿中Vd080菌圈平均直徑可達2.81 cm,大部分分生孢子萌發(fā)形成萌發(fā)管(圖1-E)。以上結果表明,489-2-2菌株對大麗輪枝菌Vd080菌絲體的生長具有抑制作用。

2.2 489-2-2菌株主要特征特性

根據(jù)16S rDNA基因序列分析,分離的棉花內生菌489-2-2與芽孢桿菌屬密切相關,與NCBI中的序列進行比對,與解淀粉芽孢桿菌的基因序列有97%相似。經(jīng)鑒定,此內生菌呈棒狀,為革蘭氏陽性菌。根據(jù)構建系統(tǒng)發(fā)育樹分析,該內生菌株為解淀粉芽孢桿菌489-2-2(圖2)。對489-2-2菌種生理生化特性進行測定,發(fā)現(xiàn)其在不同的pH值、NaCl濃度和溫度下活性不同,其中,pH值為5.0～8.0時促進其生長,pH值低于5.0抑制生長;該菌株能夠在3.5%NaCl下生長,NaCl濃度高于3.5%時其生長受到抑制;20～40℃能促進其生長,低于20℃抑制期生長(表1)。此外,簡單碳源生長試驗、各種化合物的利用試驗大部分表現(xiàn)為陽性,少數(shù)為陰性反應(表2)。

表1 489-2-2菌株的生理特性Table1 Physiological characterization of 489-2-2 strain

2.3 棉花根中489-2-2菌株的定殖

根據(jù)透射電鏡結果,活細胞可以通過棉花根系進入植株,主要定殖在細胞間隙,特別是皮層組織(圖3-A)、靠近根表皮部位(圖3-B)。對照植株(種子僅浸泡在0.2%CMC中)和僅戊二醛固定細胞處理的植株(圖3-C)的超薄切片未觀察到內生菌的定殖,表明解淀粉芽孢桿菌489-2-2能穿透棉花根系,定殖于棉花根系內部。

2.4 489-2-2菌株在溫室條件下的生物防治效果

由表3可知,用解淀粉芽孢桿菌489-2-2發(fā)酵液浸泡冀棉11種子,對照組病情指數(shù)(LWI)為62.03%,而種子浸泡法處理組中的LWI降低至27.92%;灌根法處理的棉花植株LWI為24.81%,對照組LWI為62.51%。用489-2-2發(fā)酵液浸泡棉花種子,其生物防效為54.99%;灌根法處理的棉花植株生防效果為60.31%。灌根法接種489-2-2能夠明顯提高植株對Vd080的抗性。上述結果表明,489-2-2菌株可顯著減少棉花植株的黃化、壞死和落葉,對棉花黃萎病有明顯防效。

表3 489-2-2菌株在溫室條件下的生物防治效果Table3 Biological control effect of 489-2-2 strain in greenhouse

用Vd080分生孢子液涂抹棉花葉片,能夠使葉片產(chǎn)生斑點,且3 d后受損葉片斑點區(qū)域變黑,新的菌絲形成并進入葉片組織內,引起組織內部大量過氧化氫和胼胝質的沉積(圖4-A)。489-2-2與Vd080相互作用區(qū)的分生孢子毒性較小,幾乎不擴散繁殖,不能形成新的菌絲,過氧化氫濃度和胼胝質的沉積也不高(圖4-B)。綜上表明,489-2-2菌株能夠降低Vd080的毒性,降低其致病力。

2.5 489-2-2菌株對棉花根系中防御酶活性的影響

由圖5可知,經(jīng)過489-2-2灌根處理的棉花根系中的PAL、PPO活性皆顯著高于未經(jīng)細菌處理的棉花根系,POD活性在48 h后高于未經(jīng)細菌處理的棉花根系。灌根處理后,棉花根系PAL活性在0～24 h時逐漸升高并在24 h時達到峰值,顯著高于對照,24～48 h逐漸降低,48～168 h呈升高、降低又升高的趨勢,在96 h時誘導的PAL活性最低。灌根處理后,隨著時間的延長,處理組棉花根系的POD活性呈先升高后降低的趨勢,在接種489-2-2菌株后72 h時,處理組根系POD活性達到最大值;灌根處理后,處理組棉花根系的PPO活性整體呈升高趨勢,且各時間點PPO活性均高于對照,在168 h時處理組根系PPO活性達到最大值。上述結果表明,用解淀粉芽孢桿菌489-2-2(OD600=0.2)對兩周齡棉花植株進行灌根處理,能夠引起植株防御酶的活化,72 h時能夠誘導最強的防御酶活性,增強植株對黃萎病的系統(tǒng)防御反應。

3 討論

李紅信[21]研究發(fā)現(xiàn),用蝕敵(山東膠南市綠洲生物有限公司生產(chǎn))灌根和浸泡小麥種子對小麥全蝕病生物防治效果皆較為明顯,灌根和浸種的生物防治效果分別為45.9%和43.5%。本研究結果表明,解淀粉芽孢桿菌489-2-2菌液浸泡棉花種子或用其發(fā)酵液灌根處理棉花植株均可提高棉花植株對黃萎病的抗性,這可能與該菌株誘導植株產(chǎn)生的免疫反應有關。防御酶活性的提高能夠顯著增強植物對病蟲害的抗性[22]。Han等[9]研究發(fā)現(xiàn),芽孢桿菌處理棉花植株能誘導防御酶活性升高,增強棉花抗黃萎病能力。本研究中,用解淀粉芽孢桿菌489-2-2菌液灌根處理棉花植株,能夠促進棉花根系PAL、POD、PPO活性的升高,但誘導的酶活性趨勢差異較大。PAL活性升高迅速,整個測定期出現(xiàn)兩個峰值和兩個谷值,可能是由于在24～48 h時POD、PPO活性開始升高,使PAL活性受到影響而下降。在48～96 h PAL、POD、PPO活性升高及降低趨勢一致,說明489-2-2菌株誘導了棉花根系防御酶活性的提高,在48～96 h時誘導效果明顯,能使棉花產(chǎn)生最大且穩(wěn)定的免疫反應,提高了對大麗輪枝菌菌株Vd080的抗性。

內生菌進入植株體內,主要定殖于根莖表皮與細胞間隙[23-24]。本研究結果表明,解淀粉芽孢桿菌489-2-2能夠在不傷根的情況下在棉花植株內主動定殖和轉運,主要定殖在根系細胞間隙,特別是通氣組織,靠近根表皮,這與范玉剛等[25]和李春宏[26]的研究結果相類似。當內生菌進入到植株體內后,細菌會產(chǎn)生相應的防御機制[27]。本研究中,當解淀粉芽孢桿菌489-2-2定殖到植株體內后,出現(xiàn)類似樹脂狀的物質包裹在細菌周圍,這可能是489-2-2菌株對自身產(chǎn)生的一種保護機制。489-2-2菌株定殖到棉花根系及其他器官后,可能會阻止Vd080在植株內部的繁殖。解淀粉芽孢桿菌489-2-2與棉花的互作機制有待進一步研究。芽孢桿菌能夠有效防治植物病害,環(huán)境友好,對人畜安全,并且不易引起病原菌的進化與變異[28]。因此,解淀粉芽孢桿菌489-2-2可以作為生防菌控制棉花黃萎病。

4 結論

本研究結果表明,解淀粉芽孢桿菌489-2-2對大麗輪枝菌Vd080具有較高的抑制作用,導致棉花黃萎病菌Vd080的菌絲體失去致病力,同時解淀粉芽孢桿菌489-2-2通過激活大量防御相關酶活性來增強植物的系統(tǒng)抗性,誘導棉花植株產(chǎn)生較長時間的免疫反應。此外,解淀粉芽孢桿菌489-2-2能夠主動地定殖于棉花根系內,使用這種環(huán)保型拮抗細菌抵抗黃萎病,將在防治土傳病害方面發(fā)揮重要作用。