李一晗　莊文化　曾玥　譚霄　譚博

摘 要：木霉對(duì)促進(jìn)植物的生長發(fā)育具有重要作用，對(duì)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)至關(guān)重要，但植物的營養(yǎng)吸收和代謝過程對(duì)木霉的響應(yīng)機(jī)制尚缺乏深入研究。為探究哈茨木霉對(duì)植物的促生作用及生理生化特性的影響，采用木霉孢子懸浮液灌根的方法進(jìn)行本氏煙草盆栽試驗(yàn)，測(cè)算煙草株高、葉面積、葉片氮磷含量、葉綠素含量、抗氧化酶（POD和SOD）活性。結(jié)果表明，相比于對(duì)照組，木霉處理后的煙草株高、葉面積和地上干重分別增加47.06%、46.67%和26.23%;植物葉片氮、磷含量分別增加18.57%、34.94%;葉綠素a和葉綠素b含量分別增加19.86%、39.01%;過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）的活性顯著上升。因此，木霉通過促進(jìn)土壤礦化，有利于植物營養(yǎng)吸收，顯著增加植物的株高、葉面積，進(jìn)而提高了光合速率和抗氧化酶的活性，提高了植物的抗逆性，最終提高了地上部分的干物質(zhì)量積累。

關(guān)鍵詞：本氏煙草;哈茨木霉;灌根;促生效果;生理生化特性

中圖分類號(hào) S435.72 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2022）07-0036-04

隨著農(nóng)田土壤質(zhì)量降低、化肥利用率低下等問題的日漸突出，使用生物技術(shù)來促進(jìn)植物營養(yǎng)吸收并增加作物產(chǎn)量成為研究人員重點(diǎn)關(guān)注的方向[1]。木霉是一種在植物根部定殖的根系促生菌（Plant Growth-Promoting Fungi），其通過分泌有機(jī)物和小分子化合物可以促進(jìn)土壤礦化，調(diào)節(jié)植物激素濃度，促進(jìn)植物根系發(fā)育，提高植物吸收水分和養(yǎng)分的能力，并提高植物的抗逆性，對(duì)促進(jìn)植物的生長發(fā)育具有重要作用[2-4]。研究發(fā)現(xiàn)，木霉菌劑的施用顯著提高了黃瓜幼苗葉片保護(hù)酶活性，顯著促進(jìn)了黃瓜幼苗根系的生長，提高了黃瓜幼苗的株高、莖粗和干重[5，6]，同樣有效的植物還有蕨菜、番茄、茉莉等[3，7，8]。木霉接種技術(shù)雖然在某些傳統(tǒng)農(nóng)作物上已有了初步的實(shí)踐，但由于不同作物的生長特性差別較大，對(duì)木霉影響下植物的營養(yǎng)代謝和生理反應(yīng)認(rèn)識(shí)不足，特別是接種后植物的葉綠素含量、抗氧化酶活性、營養(yǎng)吸收和代謝過程對(duì)促生效果的響應(yīng)等，不利于相關(guān)生物技術(shù)的推廣和使用。為此，本研究采用模式植物——本氏煙草（N. benthamiana）開展盆栽試驗(yàn)，旨在為根系促生菌的研究和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料 供試植物為本氏煙草（N. benthamiana），供試菌種為哈茨木霉（TRA1-16）。

1.2 試驗(yàn)方法 將100g土壤（泥炭土與蛭石按3∶1比例混合）裝入盆中（10cm×10cm×9cm），浸泡土壤至飽和，然后將消毒后的本氏煙草種子播種在盆中。14d后，取生長較為一致的煙苗，進(jìn)行移栽，共8盆，每盆1株。在PDA平板上接種木霉菌，28℃下避光培養(yǎng)7d，用無菌水沖洗孢子得到懸浮液，并在顯微鏡下計(jì)算孢子濃度為6×107（CFU/mL）。當(dāng)煙草幼苗長出2片真葉時(shí)，用木霉孢子懸浮液每隔2d進(jìn)行1次灌根處理，對(duì)照組用無菌水灌根。即2種處理，每個(gè)處理4次重復(fù)。所有的植物都在受控條件下生長，溫度為25℃～26℃，光周期為16/8h（光/暗），光照強(qiáng)度為150μmol·m?2 s?1，相對(duì)濕度為70%～80%。

1.3 指標(biāo)測(cè)定 在生長期間測(cè)量煙草的株高、莖粗和葉面積。葉面積由系數(shù)法確定（k=0.75）[9]。收獲植物后用分析天平測(cè)量地上部分的干重。植物葉片的氮含量用凱氏定氮法測(cè)定[10]，葉片的磷含量用鉬銻抗分光光度法測(cè)定[11]。葉綠素含量的測(cè)定：使用乙醇提取法提取葉片中的色素，用分光光度計(jì)測(cè)定[12]。利用南京建成生物工程研究所的過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒測(cè)定煙草葉片中的酶活性，按試劑盒中步驟進(jìn)行。利用Microsoft Excel 2016軟件進(jìn)行圖表制作，利用IBM SPSS Statistics 19軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草氮、磷元素含量 從圖1可以看出，接種木霉處理顯著增加了煙草的氮、磷元素的含量（p<0.05），相比于對(duì)照組分別增加18.57%、34.94%。可見木霉通過改善土壤肥力，提高植物對(duì)氮、磷的吸收，進(jìn)而促進(jìn)生長。這種促生現(xiàn)象與先前在茉莉花、鳳仙花等植物種植研究中的結(jié)果類似[8，13]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)接種木霉處理顯著增加了煙草的氮、磷元素的含量。這可能是由于木霉的定殖改善了土壤環(huán)境，當(dāng)木霉在植物根系定殖后，其分泌的物質(zhì)可以溶解土壤中的復(fù)雜化合物，提高土壤肥力[14]。木霉與植物互作后釋放乳酸、檸檬酸等有機(jī)酸，在溶解磷素及微量元素中發(fā)揮了重要作用[3]。此外，木霉通過影響植物根系的生長，進(jìn)而引起土壤微生物區(qū)系的變化，以提高土壤銨態(tài)氮、硝態(tài)氮的含量[15]。木霉為植物的生長提供更多的營養(yǎng)，進(jìn)而提高了植物的營養(yǎng)元素含量。之前的研究發(fā)現(xiàn)，施用木霉菌劑后，土壤堿性氮、有效磷含量對(duì)比對(duì)照組增加36.25%、26.01%[16]。木霉侵染后，黃瓜幼苗的硝態(tài)氮含量相較于對(duì)照組增加54.45%[17]。

2.2 煙草生長指標(biāo)及干物質(zhì)量 從圖2可以看出，接種木霉處理顯著增加了煙草的株高、葉面積和地上干重（p<0.05），相比于對(duì)照組分別增加47.06%、46.67%和26.23%;接種處理煙草的莖粗也有相對(duì)增加趨勢(shì)。由此可見，木霉對(duì)煙草株高、葉面積、地上干重等重要指標(biāo)的提高都有明顯效果，這與之前相關(guān)研究結(jié)果一致：木霉處理后的辣椒幼苗株高、干重分別較對(duì)照組提高3.27%、14.88%[18];木霉菌可顯著提高黃瓜幼苗的株高、葉面積和全株質(zhì)量[19]。這是由于木霉通過改變土壤理化性質(zhì)提高了植物的營養(yǎng)吸收效率，促進(jìn)了根系發(fā)育[20]、葉片生長[21]和光合速率，促進(jìn)植物株高增長、生物量的累積[22]。

2.3 煙草葉綠素含量 從圖3可以看出，接種木霉處理顯著增加了煙草的葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量（p<0.05），相比于對(duì)照組分別增加19.86%、39.01%和24.69%。但接種處理對(duì)類胡蘿卜素含量則無顯著影響。光合作用是植物生長中能量供應(yīng)的重要過程，其速率可通過葉綠素濃度來反應(yīng)。在本研究中，木霉顯著提高了煙草葉片的葉綠素a和葉綠素b含量，進(jìn)而提高葉片的光合作用，促進(jìn)植物生長發(fā)育。在對(duì)辣椒和馬鈴薯的研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果[23]。在對(duì)棉花和小麥?zhǔn)┯媚久咕?，發(fā)現(xiàn)葉綠素含量相比于對(duì)照組提高63.76%、26.51%，并且木霉都表現(xiàn)出了顯著的促生效果[24，25]。木霉侵染植物后，葉片葉綠素含量的提高可能與氮、磷的吸收有關(guān)。這是因?yàn)榈侨~綠素的重要組成元素[26]，而磷是葉綠體膜的構(gòu)成成分[27]，木霉通過促進(jìn)植物吸收營養(yǎng)元素，從而有利于葉綠體的形成[28]。此外，葉綠素含量的提高還可能與木霉有效緩解植物的膜脂過氧化有關(guān)[29]。

2.4 煙草抗氧化酶活性 從圖4可以看出，接種木霉處理顯著增加了煙草的POD和SOD活性（p<0.05），相比于對(duì)照組分別增加35.38%、31.92%?？寡趸赶到y(tǒng)是植物的重要防御體系，植物通過合成酶性抗氧化劑（如POD、SOD等）來減輕活性氧引起的氧化損傷，進(jìn)而保證其正常的生長發(fā)育[30，31]，抗氧化酶活性的高低可以反映植物抗逆能力的強(qiáng)弱[32]。在本實(shí)驗(yàn)中，相較于對(duì)照組，木霉顯著提高了煙草組織的SOD、POD活性，在對(duì)白楊[33]、允芥[34]、藜[35]的研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。這可能是因?yàn)槟久咕ㄟ^一系列復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)來誘導(dǎo)抗氧化基因表達(dá)產(chǎn)生變化[36]。有研究認(rèn)為，木霉通過刺激植物產(chǎn)生信號(hào)分子（如茉莉酸甲酯），進(jìn)而誘導(dǎo)編碼抗氧化酶基因的表達(dá)[37]。此外，木霉接種會(huì)顯著提高葉綠體和細(xì)胞膜酶的表達(dá)，進(jìn)而提高POD、SOD的活性[38]。

3 結(jié)論與討論

木霉作為一種無毒性根系促生菌，對(duì)植物生長和發(fā)育有重要影響，對(duì)綠色農(nóng)業(yè)生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展至關(guān)重要。本文通過盆栽試驗(yàn)，用木霉孢子懸浮液對(duì)本氏煙草進(jìn)行灌根處理，揭示了木霉接種后煙草的營養(yǎng)吸收和代謝過程對(duì)木霉的響應(yīng)機(jī)制。結(jié)果表明，木霉在本氏煙草根系定殖后，通過分泌有機(jī)物、小分子物質(zhì)來溶解土壤復(fù)雜化合物，并改善土壤微生物環(huán)境，促進(jìn)土壤礦化，進(jìn)而促進(jìn)植物吸收氮磷等營養(yǎng)物質(zhì)。氮、磷的供給有利于煙草葉綠體的形成，提高了植物光合速率。進(jìn)一步的，木霉通過提高葉綠體和細(xì)胞膜酶的表達(dá)，提高了植物抗氧化酶的活性。木霉通過吸收營養(yǎng)、提高光合速率、提高抗氧化酶活性，促進(jìn)植物的生長，植物的株高、葉面積等顯著提高，促進(jìn)了植物生物量的積累。綜上所述，木霉參與調(diào)控的生防促生機(jī)制是多維度的，包括增加營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)、促進(jìn)光合速率、增加抗氧化酶活性等。然而，木霉與植物互作的機(jī)制是十分復(fù)雜的，仍需要進(jìn)一步的研究和驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)

[1]付嚴(yán)松，李宇聰，徐志輝，等.根際促生菌調(diào)控植物根系發(fā)育的信號(hào)與分子機(jī)制研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào)，2020，36（09）：42-48.

[2]鄧俊杰，Abdul Majeed Baloch，侯雪月，等.木霉對(duì)月季幼苗生長的影響[J].植物研究，2020，40（05）：666-672.

[3]李瑞霞.貴州木霉NJAU 4742對(duì)礦質(zhì)元素的活化及對(duì)番茄的促生效果研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

[4]張典利，孟臻，亓文哲，等.植物根際促生菌的研究與應(yīng)用現(xiàn)狀[J].世界農(nóng)藥，2018，40（06）：37-43.

[5]齊娟，劉蕾慶，任金立，等.哈茨木霉菌使用方式對(duì)黃瓜砧木出苗及幼苗生長的的影響[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2021，27（04）：46-48.

[6]宿暢，廉華，馬光恕，等.木霉不同施用方式對(duì)黃瓜膜脂過氧化作用、保護(hù)性酶活性及枯萎病防效的影響[J].植物保護(hù)，2021，47（02）：142-149.

[7]夏可心，于亞楠，張建，等.2種木霉生物有機(jī)肥對(duì)蕹菜產(chǎn)量和品質(zhì)的影響[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2020，43（02）：284-291.

[8]杜嬋娟，張晉，劉銅，等.木霉菌劑對(duì)根際微生物及茉莉植株生長的作用[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2021，37（10）：60-64.

[9]Koubouris G，Bouranis D，Vogiatzis E，et al.Leaf area estimation by considering leaf dimensions in olive tree[J].Scientia Horticulturae，2018，240：440-445.

[10]Dl S，Al P，Pa H，et al.Methods of Soil Analysis.Part 3.Chemical Methods[Z].Madison，USA：Soil Science Society of America，1996.

[11]Bao S D.Soil agricultural chemical analysis[Z].3rd edn ed.Beijing：China Agricultural Press，2000176-185.

[12]昌夢(mèng)雨，魏曉楠，王秋悅，等.植物葉綠素含量不同提取方法的比較研究[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2016，32（27）：177-180.

[13]楊興堂.3株木霉菌的鑒定、生物學(xué)特性和抑菌能力及其對(duì)鳳仙花的促生作用[D].哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2016.

[14]Singh B N，Dwivedi P，Sarma B K，et al.A novel function of N-signaling in plants with special reference to Trichoderma interaction influencing plant growth，nitrogen use efficiency，and cross talk with plant hormones[J].3 Biotech，2019，9（3）：440-445.

[15]趙政，陳巍，王歡，等.木霉微生物肥與減量化肥配施對(duì)番茄產(chǎn)量、品質(zhì)及土壤肥力的影響[J].土壤學(xué)報(bào)，2018，55（05）：1243-1253.

[16]劉峰，阮盈盈.哈茨木霉菌劑對(duì)玉米苗期生長和土壤肥力的影響[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2021，62（8）：1507-1510.

[17]王依純，廉華，馬光恕，等.木霉不同施用方式對(duì)黃瓜幼苗質(zhì)量特性及枯萎病防效的影響[J].中國生物防治學(xué)報(bào)，2019，35（03）：416-425.

[18]李紅，陳鑫，許藝，等.木霉復(fù)合菌劑對(duì)辣椒幼苗生長的影響研究[J].技術(shù)與市場，2021，28（01）：106-107.

[19]廉華，馬光恕，靳亞忠，等.木霉分生孢子和厚垣孢子對(duì)黃瓜葉片抗氧化系統(tǒng)及枯萎病防效的影響[J].干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究，2021，39（04）：71-79.

[20]李強(qiáng)，黃迎新，周道瑋，等.土壤氮磷添加下豆科草本植物生物固氮與磷獲取策略的權(quán)衡機(jī)制[J].植物生態(tài)學(xué)報(bào)，2021，45（03）：286-297.

[21]商娜，任愛芝，趙培寶.木霉菌在園林園藝植物上的應(yīng)用及研究進(jìn)展[J].北方園藝，2021（03）：149-154.

[22]張樹武，徐秉良，程玲娟，等.深綠木霉對(duì)白三葉草促生作用及生理生化特性的影響[J].草業(yè)學(xué)報(bào)，2015，24（02）：161-167.

[23]姚彥坡.防治馬鈴薯晚疫病和辣椒疫病木霉菌的篩選及生防機(jī)制研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

[24]李小紅，陸寧海，徐瑞富，等.哈茨木霉對(duì)小麥和玉米幼苗生長的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2005（03）：238-240.

[25]聲焦，琮路炳.康氏木霉制劑對(duì)棉花和菜豆幼苗幾個(gè)生理生化指標(biāo)的影響[J].中國生物防治，1995（01）：31-33.

[26]Daughtry C.Estimating Corn Leaf Chlorophyll Concentration from Leaf and Canopy Reflectance[J].Remote Sensing of Environment，2000，74（2）：229-239.

[27]Bononi L，Chiaramonte J B，Pansa C C，et al.Phosphorus-solubilizing Trichoderma spp.from Amazon soils improve soybean plant growth[J].Scientific Reports，2020，10（1）：1-3.

[28]付健.木霉菌提高玉米耐鹽堿機(jī)理及其對(duì)根際土壤微生物多樣性的影響[D].大慶：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，2017.

[29]Brotman Y，Landau U，Cuadros-Inostroza á，et al.Trichoderma-Plant Root Colonization：Escaping Early Plant Defense Responses and Activation of the Antioxidant Machinery for Saline Stress Tolerance[J].PLoS Pathogens，2013，9（3）：e1003221.

[30]Kapoor D，Singh S，Kumar V，et al.Antioxidant enzymes regulation in plants in reference to reactive oxygen species （ROS） and reactive nitrogen species （RNS）[J].Plant Gene，2019，19：100182.

[31]Kasote D M，Katyare S S，Hegde M V，et al.Significance of Antioxidant Potential of Plants and its Relevance to Therapeutic Applications[J].International Journal of Biological Sciences，2015，11（8）：982-991.

[32]劉連妹，錢雯霞，屈海泳.哈茨木霉孢子懸浮液對(duì)番茄幼苗生長及抗氧化酶活性的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（04）：96-98.

[33]Wang Y，Baloch A M，Deng J，et al.Influence of Trichoderma inoculation on four crucial defense-related enzymes and leaf soluble protein level of poplar[J].Pakistan Journal of Botany，2020，52（3）：11-15.

[34]侯雪月，鄧俊杰，姚志紅，等.木霉菌對(duì)蕓芥生長相關(guān)生理指標(biāo)的影響[J].植物研究，2020，40（03）：347-352.

[35]藺澤榮，朱海霞.多孢木霉HZ-31菌株對(duì)藜的生理生化特性的影響[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2021，56（04）：120-125.

[36]Shoresh M，Yedidia I，Chet I.Involvement of Jasmonic Acid/Ethylene Signaling Pathway in the Systemic Resistance Induced in Cucumber by Trichoderma asperellum T203[J].Phytopathology，2005，95（1）：76-84.

[37]Mastouri F，Bj?rkman T，Harman G E. Trichoderma harzianum Enhances Antioxidant Defense of Tomato Seedlings and Resistance to Water Deficit[J].Molecular Plant-Microbe Interactions，2012，25（9）：1264-1271.

[38]Bernal-Vicente A，Pascual J A，Tittarelli F，et al. Trichoderma harzianum T-78 supplementation of compost stimulates the antioxidant defence system in melon plants[J].Journal of the Science of Food and Agriculture，2015，95（11）：2208-2214.

（責(zé)編：張宏民）

Effect of Inoculation with Trichoderma on the Growth and Nutrient Uptake of N. benthamiana

LI Yihan? ?ZHUANG Wenhua? ?ZENG Yue? ?TAN Xiao? ?TAN Bo

（State Key Laboratory of Hydraulics and Mountain River Engineering， Chengdu 610065， China; College of Water Resource and Hydropower， Sichuan University， Chengdu 610065， China）

Abstract： Trichoderma has played an important role in promoting plant growth and development， which is crucial for agricultural production， yet the mechanisms of plant nutrient uptake and metabolic processes in response to Trichoderma are still lacking in-depth investigation. To explore the effect of Trichoderma harzianum on the plant′s growth-promoting effect and physiological and biochemical traits， this study was conducted by using Trichoderma spore suspension for root irrigation in a potted experiment of N. benthamiana. Plant height， leaf area， leaf nitrogen and phosphorus content， chlorophyll content， and antioxidant enzymes （POD and SOD） activities were measured. The results showed that the plant height， leaf area and above-ground dry weight of N. benthamiana with Trichoderma inoculation increased by 47.06%， 46.67% and 26.23%， respectively; the nitrogen and phosphorus contents of leaves increased by 18.57% and 34.94%， respectively; the chlorophyll a and chlorophyll b contents increased by 19.86% and 39.01%， respectively; the activities of peroxidase （POD） and superoxide dismutase （SOD） were significantly increased. This study demonstrated that Trichoderma facilitated plant nutrient uptake and significantly increased plant height and leaf area by promoting soil mineralization. As a result， the photosynthetic rate and antioxidant enzyme activity increased， which enhanced plant stress tolerance and ultimately promoted the accumulation of dry matter in above-ground parts.

Key words： N. benthamiana; Trichoderma harzianum; Root irrigation; Growth-promoting effect; Physiological and biochemical characteristics

基金項(xiàng)目：四川省科技廳重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（2019YFN0153）;高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)（2021SCU12037）。

作者簡介：李一晗（1996—），男，青海人，碩士研究生，研究方向：農(nóng)業(yè)水土環(huán)境與植物生理學(xué)。

通訊作者：譚博（1990—），男，助理研究員，博士，研究方向：農(nóng)業(yè)水土環(huán)境。? 收稿日期：2021-11-21