李艷梅，王乃輝，孫小燕，張學紅

(1.蘭州大學第一醫(yī)院，蘭州 730000；2.蘭州大學第一臨床醫(yī)學院，蘭州 730000；3.甘肅省生殖醫(yī)學與胚胎重點實驗室，蘭州 730000)

近年來，真核生物中發(fā)現(xiàn)的RNA修飾已超過150多種，其中N6-甲基腺苷(m6A)是最常見、最豐富和最保守的修飾方式，并且以一種動態(tài)、可逆的方式調(diào)節(jié)細胞內(nèi)mRNA的甲基化水平[1]。甲基轉移酶、去甲基酶和甲基結合蛋白共同調(diào)節(jié)m6A的動態(tài)可逆修飾。其中，m6A甲基轉移酶包括：甲基轉移酶樣蛋白3(METTL3)、甲基轉移酶樣蛋白14(METTL14)、Wilms腫瘤抑制因子(WT1)相關蛋白(WTAP)、RNA結合基序蛋白15(RBM15)、類病毒m6A甲基轉移酶(VIRMA/KIAA1429)，稱為“寫入者”(Writer)；去甲基化酶包括：脂肪量和肥胖相關蛋白(FTO)、ALKB同源物5(ALKBH5)，稱為“擦除器”(Eraser)；m6A甲基結合蛋白包括：YTH結構域家族蛋白(YTHDC1/2、YTHDF1/2/3)、胰島素樣生長因子mRNA結合蛋白(IGF2BP1/2/3)，稱為“解讀器”(Reader)。越來越多的證據(jù)表明，m6A修飾通過影響RNA的正常代謝過程，如剪接[2]、翻譯[3]、穩(wěn)定[4]和降解[5]等，從而參與調(diào)控多種疾病的發(fā)生發(fā)展[6-8]。

卵母細胞發(fā)育過程分為生長、成熟和排卵3個不同的階段。生發(fā)泡破裂(GVBD)通常被認為是卵母細胞成熟的一個標志。在哺乳動物中，卵母細胞停滯在減數(shù)分裂前期直到青春期，然后，在神經(jīng)、激素和分子信號的聯(lián)合調(diào)控下，發(fā)育成熟的生發(fā)囊泡卵母細胞(GV)恢復減數(shù)分裂并發(fā)生GVBD；隨后，同源染色體配對，微管在減數(shù)分裂中期Ⅰ(MI)組裝成雙極紡錘體，同源染色體附著于紡錘體并在紡錘絲的牽拉下作為第1極體從卵母細胞排出，完成第1個減數(shù)分裂周期；之后，卵母細胞進入第2個減數(shù)分裂周期，并在減數(shù)分裂中期Ⅱ(MⅡ)再次停止；經(jīng)過精子受精或孤雌激活后，卵母細胞再次恢復并完成第2次減數(shù)分裂，繼續(xù)早期胚胎發(fā)育。既往研究顯示，正常甲基化參與細胞的減數(shù)分裂過程，甲基化發(fā)生改變可影響減數(shù)分裂過程并改變細胞命運[9-10]。卵母細胞作為雌性生殖細胞，其發(fā)生和成熟過程的順利進行對后續(xù)合子、胚胎和子代發(fā)育都有重大意義。

m6A甲基轉移酶、去甲基酶和甲基結合蛋白的相關成員在卵母細胞的生長、成熟過程中所起的作用機制有很多研究進展，現(xiàn)綜述如下。

一、m6A甲基轉移酶對卵母細胞發(fā)生的影響

1.METTL3：是第1個被鑒定的m6A甲基轉移酶，其在酵母和人類中高度保守。METTL3在各個發(fā)育階段的卵母細胞的細胞核和細胞質(zhì)中均可被檢測到，GV期卵母細胞中METTL3主要定位于細胞核。METTL3通過影響性激素合成和紡錘體形成過程中的關鍵基因表達來影響卵母細胞的成熟。敲除小鼠胚胎干細胞中的Mettl3后會阻礙胚胎干細胞分化，并導致早期胚胎致死[11]。將Mettl3 siRNA微注射到小鼠GV期卵母細胞后，雖然卵母細胞減數(shù)分裂正常，但是后續(xù)第1極體排出率顯著降低，卵母細胞中Cltc、Pcnt、Spdl-1和Msy2的mRNA相對表達量均顯著升高，而Western blot卻顯示各蛋白豐度降低[12]，表明Mettl3 siRNA處理后GV期卵母細胞內(nèi)Cltc、Pcnt、Spdl-1和Msy2的翻譯效率降低。有研究發(fā)現(xiàn)，Cltc、Pcnt、Spdl-1和Msy2在小鼠卵母細胞紡錘體形成和染色體重組過程中起到了重要調(diào)控作用[13-14]。成年雌性Mettl3突變(Zmettl3m/m)斑馬魚的m6A水平降低，卵泡中Npr、Igf3、Star、3βhsd和Cyp19a1a的表達量顯著降低，垂體中Lh、Npr和Igf3的表達量顯著降低[15]。Tang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，Lh、Npr和Igf3對雌性斑馬魚卵母細胞的成熟和排卵有刺激作用。Fsta可抑制HCG誘導的卵母細胞成熟，Zmettl3m/m斑馬魚卵泡中Fsta的表達水平顯著增加[15]。由此可見，卵母細胞的成熟由多個環(huán)節(jié)協(xié)同作用，而METTL3在體內(nèi)通過多個途徑影響卵母細胞的生長、成熟，一旦功能缺失就會導致卵母細胞早期發(fā)育停滯。

2.METTL14：與METTL3一樣，METTL14也是甲基轉移酶的核心成員。在“寫入”甲基的過程中，METTL3起催化作用，METTL14則促進甲基轉移酶復合物與RNA結合。有報道發(fā)現(xiàn)，在豬卵母細胞中抗壞血酸可能通過抑制METTL14的表達而降低MII期m6A的整體水平，進而影響細胞周期和細胞發(fā)育[17]。然而，METTL14對卵母細胞生長發(fā)育具體的作用機制還有待今后進一步深入研究。

3.WTAP：是一種與剪接因子共定位的核蛋白，可與WT1特異性結合，在細胞功能和癌癥(如上皮性卵巢癌)進展中發(fā)揮重要作用[18]。WTAP作為m6A甲基轉移酶復合物的重要成員，WTAP和RBM15均為依賴于METTL3和METTL14的調(diào)節(jié)蛋白。環(huán)亮氨酸是一種蛋氨酸腺苷轉移酶抑制劑，可通過降低S-腺苷蛋氨酸的濃度而降低整體m6A水平。有研究發(fā)現(xiàn)，將豬的卵丘復合體(COCs)在環(huán)亮氨酸中暴露24 h后，卵丘細胞的擴張受到抑制、GVBD率顯著下降、阻滯減數(shù)分裂過程使MI期細胞增加，同時，WTAP表達也顯著增加[19]。

4.KIAA1429：KIAA1429是一種新鑒定出的m6A甲基轉移酶，通過調(diào)節(jié)選擇性剪接參與卵母細胞的發(fā)育和減數(shù)分裂。在引導m6A在mRNA的區(qū)域選擇性沉積中發(fā)揮關鍵作用[20]。據(jù)BioGPS數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計，Kiaa1429在小鼠卵母細胞中高表達[21]，表明它可能是卵母細胞某一特定功能的關鍵因子。Hu等[22]研究發(fā)現(xiàn)，當小鼠卵母細胞特異性缺失Kiaa1429(Kiaa1429Zp3cKO)后，小鼠卵泡發(fā)育停滯在初級卵泡期，卵母細胞GVBD失敗。在卵母細胞中KIAA1429定位于核斑，核斑中富含pre-mRNA處理因子和參與選擇性剪接的因子[23]。當卵母細胞中Kiaa1429缺失后，YTHDC1位點數(shù)量顯著減少，說明卵母細胞中KIAA1429對核斑中特定mRNA處理因子的定位具有重要作用。

二、m6A去甲基酶對卵母細胞發(fā)生的影響

1.FTO：FTO是第1個被報道的m6A去甲基酶[24]，在卵母細胞內(nèi)定位于核斑和細胞質(zhì)。與對照組相比較，卵巢功能不全(POI)患者的卵巢組織和卵巢顆粒細胞中FTO的轉錄和翻譯水平均顯著降低，細胞增殖顯著降低而凋亡顯著增加[25]。Sun等[26]研究發(fā)現(xiàn)，不孕癥患者卵泡液和顆粒細胞中FTO的表達水平隨著患者卵巢衰老程度增加而逐漸降低，m6A水平增加。由于人卵母細胞受倫理等的限制，缺少直接對人卵母細胞進行FTO基因干預的研究。盡管如此，由于顆粒細胞承擔著卵母細胞物質(zhì)運輸和信號傳遞等重要作用，我們可以推測，當顆粒細胞的增殖和凋亡改變時，必然會影響到卵母細胞的正常生長。FTO與卵母細胞的直接聯(lián)系還需要更多后續(xù)研究來揭示。

2.ALKBH5：ALKBH5和FTO同屬于ALKB家族，然而ALKBH5對卵巢顆粒細胞的影響并未表現(xiàn)出與FTO類似的現(xiàn)象[25]。有趣的是，盡管ALKBH5在卵巢中的作用尚不明確，與卵母細胞發(fā)生關系的研究更是少見，但是卻在小鼠睪丸中高表達，ALKBH5缺失會導致小鼠精子成熟停滯，最終導致不育[27]。這也體現(xiàn)了同一家族不同成員之間對作用細胞種類的特異性。

三、m6A甲基結合蛋白對卵母細胞發(fā)生的影響

m6A的甲基結合蛋白優(yōu)先與mRNA上的m6A結合，通過調(diào)控mRNA剪接和輸出以誘導其下游基因。

1.YTHDF1/2/3：通過調(diào)控卵母細胞成熟過程中的基因轉錄，保證卵母細胞具備維持早期合子正常發(fā)育的能力。在卵泡發(fā)育的各個階段，YTHDF2在卵母細胞和顆粒細胞中均有表達[28]。卵母細胞特異性缺失Ythdf2的雌性小鼠(Ythdf2mCKO)能夠正常排卵并形成黃體，當使用孕馬血清(PMSG)和HCG促排卵后也可產(chǎn)生與野生型數(shù)量相當?shù)腗II卵母細胞，然而，Ythdf2mCKO小鼠受精后正常的兩細胞期胚胎數(shù)量減少且胚胎內(nèi)還會出現(xiàn)微核或去核等胞質(zhì)分裂缺陷的情況[28]。相似的情況在Zhao等[29]對斑馬魚的研究中也有報道，缺失Ythdf2的斑馬魚會嚴重損害其胚胎的正常發(fā)育。深入分析Ythdf2mCKO小鼠發(fā)現(xiàn)，MII期卵母細胞轉錄組內(nèi)的基因表達失調(diào)，而GV期卵母細胞轉錄組內(nèi)的基因表達卻接近正常，說明在卵母細胞成熟過程中YTHDF2調(diào)控正常的基因轉錄，從而保證卵母細胞維持早期合子的正常發(fā)育[28]。Ivanova等[28]研究發(fā)現(xiàn)，缺失Ythdf2的小鼠在減數(shù)分裂和卵母細胞成熟過程中，導致YTHDF2調(diào)控的基因表達上調(diào)，從而擾亂了卵母細胞的正常成熟過程。

YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3協(xié)同合作，通過影響m6A修飾mRNAs的翻譯和衰變，促進細胞質(zhì)中mRNAs的代謝過程[28，30]，調(diào)節(jié)卵母細胞的m6A水平。

2.YTHDC1/2：YTHDC1/2通過阻止卵母細胞中出現(xiàn)選擇性聚腺苷酸化來維持pre-mRNA 3’UTR長度的穩(wěn)定，從而利于卵母細胞成熟。YTHDC1定位于含有活性轉錄位點的核斑，最初稱為YT521-B。YTHDC1為減數(shù)分裂染色質(zhì)相關蛋白，可影響RNA核輸出等功能[31]。從GV期到MII期的小鼠卵母細胞中YTHDC1蛋白水平逐漸增加，表明YTHDC1由休眠的母體mRNA編碼，在卵母細胞成熟過程中被招募[32]。當雌性小鼠Ythdc1基因失活，卵巢上表現(xiàn)為次級卵泡或竇狀卵泡缺乏，卵母細胞發(fā)育阻滯在初級卵泡階段[32]。Ythdc1缺失導致卵母細胞細胞核中原本與YTHDC1結合的pre-mRNA轉錄產(chǎn)物在加工過程中出現(xiàn)大量選擇性剪接缺陷，卵母細胞中選擇性聚腺苷酸化增加，pre-mRNA的3’UTR長度改變[32]。pre-mRNA 3’UTR包含許多microRNA及RNA結合蛋白的靶點，3’UTR延長或縮短將對翻譯效率、轉錄穩(wěn)定性和亞細胞轉錄本定位產(chǎn)生影響[33-34]。因此，卵母細胞中YTHDC1對于防止選擇性聚腺苷酸化、維持pre-mRNA 3’UTR長度的穩(wěn)定、達到精確調(diào)節(jié)卵母細胞成熟起著重要作用。

YTHDC2主要在哺乳動物的睪丸組織中高度特異性表達，參與精子的減數(shù)分裂，對精子發(fā)生起著重要調(diào)控作用[35]。目前，尚不清楚YTHDC2與卵母細胞發(fā)育的關系。

3.IGF2BP3：通過調(diào)節(jié)與染色體配對和同源重組相關分子的表達進而影響初級卵母細胞的發(fā)育。Igf2bp3在魚類和哺乳動物中高度保守。研究發(fā)現(xiàn)，青鳉魚卵巢內(nèi)IGF2BP3高表達，當青鳉魚卵巢缺失性腺體細胞衍生因子(Gsdf)時，卵巢中IGF2BP3的表達顯著增加，表現(xiàn)為卵巢內(nèi)過量的初級卵母細胞不規(guī)則積累、呈現(xiàn)囊性[36]。Vg1RBP/Vera是Igf2bp3的同源基因。據(jù)報道，Vg1RBP/Vera對非洲爪蟾卵母細胞發(fā)生中的mRNA定位至關重要[37]。Igf2bp3在青鳉魚和非洲爪蟾中的表達模式類似，表明Igf2bp3也可能在卵母細胞mRNA的準確定位上起重要作用，但具體的調(diào)控方式目前尚不清楚。

綜上所述，無論是m6A甲基轉移酶、去甲基化酶還是甲基結合蛋白都可能對卵母細胞的生長、成熟有影響。在卵母細胞減數(shù)分裂過程中，卵母細胞mRNA甲基化狀態(tài)調(diào)節(jié)了細胞翻譯和細胞分裂過程[19]。在此期間，甲基轉移酶、去甲基化酶及結合蛋白作為不可分割的整體共同調(diào)控了卵母細胞內(nèi)mRNA的甲基化狀態(tài)。

四、展望

異常的m6A修飾水平可導致RNA功能失調(diào)，影響基礎生物學過程，進而引發(fā)癌癥、卵母細胞發(fā)育障礙和代謝性疾病等[6，38]。女性在自然衰老或病理衰老后，卵巢內(nèi)m6A甲基化水平增高[25-26，39]。因此，深入研究m6A甲基化酶、去甲基化酶和結合蛋白各相關分子與卵母細胞生長、成熟的關系，有可能尋找到臨床干預POI和治療卵巢早衰(POF)的分子靶標，進而達到改善生育能力、提高生活質(zhì)量的目的。