鄧禹，黃禾，金鴻雁

(北京大學(xué)第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 100034)

隨著人口老齡化的到來，我國有1.2億女性正在經(jīng)歷向更年期的過渡，這約占世界更年期女性人口的23%[1]。更年期女性在絕經(jīng)時(shí)，由于雌激素缺乏引起許多健康問題，如骨密度(BMD)降低、關(guān)節(jié)疼痛、潮熱、睡眠障礙等癥狀，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量[2]。據(jù)報(bào)道，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(PMOP)的發(fā)生率為30%～55%[3]，預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松(OP)對避免PMOP的發(fā)生至關(guān)重要[4]。盡管已有研究分析了影響OP進(jìn)展的關(guān)鍵分子，但是我們對影響PMOP發(fā)生和進(jìn)展相關(guān)基因的了解仍不詳盡，需要深入研究[5]。

骨的發(fā)育和維持是一個(gè)動態(tài)平衡的過程，這一過程受到骨破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的共同影響[6]。外周血單核細(xì)胞(PBMs)是一個(gè)研究OP的合適細(xì)胞模型[7]。對于成人外周骨骼(如股骨)來說，PBMs是破骨細(xì)胞前體的唯一來源[8]。PBMs被招募到骨重塑部位后，在接受特定刺激后形成破骨細(xì)胞[9]。研究表明，PBMs可以通過分泌一些細(xì)胞因子影響破骨細(xì)胞分化、活化和凋亡[10]。PBMs可以通過轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成[11]。PBMs的異常與OP密切相關(guān)[12]。因此，本研究利用NCBI中的GEO基因芯片公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，選擇芯片數(shù)據(jù)(GSE56815)作為分析對象，篩選差異表達(dá)基因，并對上調(diào)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析，利用String數(shù)據(jù)庫分析關(guān)鍵上調(diào)差異表達(dá)基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)，深入了解關(guān)鍵差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能，以期篩選出影響PMOP發(fā)生和進(jìn)展的關(guān)鍵分子。

材料與方法

一、研究對象及分組

利用NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)中的高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(gene expression omnibus，GEO)公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行芯片數(shù)據(jù)搜索[13]。檢索詞為“Postmenopause”或“Bone mineral density”。選擇40例樣品芯片數(shù)據(jù)(GSE56815)為研究對象，其中包含了絕經(jīng)后20例髖部高BMD和20例低BMD女性PBMs的RNA微陣列數(shù)據(jù)?；虮磉_(dá)譜中髖部高BMD組患者平均年齡為(57.2±1.9)歲，髖部BMD的平均Z值為(1.58±0.66)；髖部低BMD組患者平均年齡為(57.6±1.5)歲，髖部BMD的平均Z值為(-1.04±0.38)。為方便描述，我們將絕經(jīng)后髖部高BMD組患者的PBMs數(shù)據(jù)命名為高BMD組，將絕經(jīng)后髖部低BMD組患者的PBMs數(shù)據(jù)命名為低BMD組。

二、方法

1.差異表達(dá)基因的篩選：本研究使用R軟件(3.6.1版)中的Limma程序包對GSE56815數(shù)據(jù)庫中高BMD組和低BMD組的差異基因進(jìn)行篩選，篩選標(biāo)準(zhǔn)為：|log2 FC|>0.379，錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)<0.05。

2.GO和KEGG富集分析：本研究使用R軟件(3.6.1版)中的ClusterProfiler程序包對篩選出的上調(diào)差異基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析，得到P<0.05的功能富集和KEGG通路。為進(jìn)一步探究關(guān)鍵差異基因的功能和參與的信號通路，我們使用Metascape數(shù)據(jù)庫(http：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1)對PPI網(wǎng)絡(luò)分析中的關(guān)鍵差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析[14]。

3.蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)分析：采用String數(shù)據(jù)庫(http：//string-db.org)構(gòu)建差異表達(dá)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)的分析圖。首先，將所有上調(diào)的差異基因輸入String數(shù)據(jù)庫，在“Minimum required interaction score”的選項(xiàng)中選擇“High confidence(0.700)”生成蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)圖，然后使用Cytoscape軟件(3.8.2版)進(jìn)行可視化分析。

結(jié) 果

一、差異表達(dá)基因的篩選

通過對GSE56815數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，數(shù)據(jù)庫中40例樣本的大部分基因表達(dá)量基本保持一致，說明該數(shù)據(jù)適合進(jìn)行下一步分析(圖1)。

圖1 GSE56815基因表達(dá)箱線圖

對GSE56815數(shù)據(jù)集進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，共得到40個(gè)表達(dá)差異基因，其中上調(diào)基因34個(gè)(表1)和下調(diào)基因6個(gè)；并繪制火山圖，其中紅點(diǎn)示上調(diào)基因，藍(lán)點(diǎn)示下調(diào)基因(圖2)。

圖2 火山圖

表1 表達(dá)上調(diào)的差異基因

二、GO和KEGG富集分析

為了解顯著表達(dá)上調(diào)的差異基因的功能，本研究對34個(gè)表達(dá)上調(diào)差異表達(dá)基因進(jìn)行了GO和KEGG富集分析。

上調(diào)差異表達(dá)基因GO分析發(fā)現(xiàn)，主要富集在中性粒細(xì)胞脫顆粒、免疫反應(yīng)的中性粒細(xì)胞激活、對細(xì)菌來源的分子反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)和細(xì)胞對生物刺激的反應(yīng)等功能(圖3)。

圖3 表達(dá)上調(diào)差異基因的GO富集分析

上調(diào)差異表達(dá)基因KEGG分析發(fā)現(xiàn)，主要富集在NOD樣受體信號通路、金黃色葡萄球菌感染、成骨細(xì)胞的分化、糖類降解和精氨酸的生物合成等信號通路(圖4)。

圖4 表達(dá)上調(diào)差異基因的KEGG分析

三、上調(diào)差異表達(dá)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)及重要基因

采用String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了上調(diào)差異表達(dá)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)，其中CEACAM8、LTF、CRISP3、CAMP、LCN2、DEFA4、MMP8、ARG1、HP、BPI、CEACAM6、TCN1和ELANE存在著互作關(guān)系(圖5)。

圖5 表達(dá)上調(diào)差異表達(dá)基因PPI網(wǎng)絡(luò)

四、關(guān)鍵差異表達(dá)基因GO富集分析

采用Metascape分析工具對PPI分析結(jié)果中的關(guān)鍵差異表達(dá)基因(CEACAM8、LTF、CRISP3、CAMP、LCN2、DEFA4、MMP8、ARG1、HP、BPI、CEACAM6、TCN1和ELANE)進(jìn)行GO富集分析發(fā)現(xiàn)，關(guān)鍵差異表達(dá)基因主要富集在中性粒細(xì)胞脫顆粒、抗菌肽、細(xì)胞外基質(zhì)組織以及對脂多糖的反應(yīng)(表2)。

表2 關(guān)鍵差異表達(dá)基因的GO富集分析

討 論

OP是老年人常見的全身性骨病，其特征是骨質(zhì)減少和骨組織微結(jié)構(gòu)破壞，骨脆性和骨折的風(fēng)險(xiǎn)增加[15]。OP可分為原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥(POP)和繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥(SOP)兩大類。POP包括PMOP、老年性O(shè)P和特發(fā)性O(shè)P[16]。在絕經(jīng)期婦女中，雌激素的缺乏會增加OP的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[17]。據(jù)報(bào)道PMOP是最常見的POP，影響了超過一半的絕經(jīng)后女性[18]。目前，我們尚未完全了解影響PMOP發(fā)生和進(jìn)展的關(guān)鍵分子[5]。因此，進(jìn)一步探究影響PMOP發(fā)生和進(jìn)展的機(jī)制具有重要的社會意義。

PBMs作為破骨細(xì)胞的前體[8]，PBMs的異常與OP密切相關(guān)[12]。因此，本研究通過分析GSE56815基因表達(dá)譜中40例絕經(jīng)后不同BMD患者的PBMs微陣列數(shù)據(jù)，篩選出了高BMD組表達(dá)上調(diào)差異基因34個(gè)和下調(diào)差異基因6個(gè)。PPI網(wǎng)絡(luò)分析顯示，CEACAM8、LTF、CRISP3、CAMP、LCN2、DEFA4、MMP8、ARG1、HP、BPI、CEACAM6、TCN1和ELANE存在著互作關(guān)系。進(jìn)一步對上述關(guān)鍵差異基因進(jìn)行GO分析發(fā)現(xiàn)，這些關(guān)鍵差異基因主要富集在中性粒細(xì)胞脫顆粒、抗菌肽、對脂多糖的反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)組織，其中LTF、CEACAM8、CAMP、LCN2、MMP8和ARG1與骨代謝的聯(lián)系密切。

乳鐵蛋白(LF)，曾稱LTF，是一種鐵結(jié)合的球狀糖蛋白，屬于轉(zhuǎn)鐵蛋白超家族，主要存在于中性粒細(xì)胞分泌小泡、上皮分泌物和乳汁中[19]。LF具有重要的免疫調(diào)節(jié)功能[20]，能減少腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)等多種溶骨細(xì)胞因子的分泌[21]。LF存在于中性粒細(xì)胞的分泌顆粒中，它的產(chǎn)生受到炎癥刺激的影響[22]。LF具有多種生物學(xué)效應(yīng)，除了參與抗菌和免疫調(diào)節(jié)外，它可以誘導(dǎo)成骨細(xì)胞增殖和分化，同時(shí)抑制成骨細(xì)胞凋亡和破骨細(xì)胞的形成，在體內(nèi)促進(jìn)局部骨的形成[22-23]。有研究報(bào)道，LF能促進(jìn)成骨細(xì)胞系(Saos-2)的成骨分化，以及增強(qiáng)骨再生[24-25]。Hou等[26]研究發(fā)現(xiàn)，切除卵巢可顯著降低大鼠股骨以及腰2～4椎體的骨量、骨小梁厚度和骨小梁數(shù)，并增加骨小梁分離，LF或雌激素治療可以保護(hù)去卵巢大鼠骨量、維持骨小梁厚度和防止骨小梁的丟失。骨保護(hù)素(OPG)和核因子激活因子-κB配體(RANKL)是調(diào)節(jié)骨形成和骨吸收所必需的細(xì)胞因子，RANKL/OPG比值是調(diào)節(jié)骨形成和骨吸收平衡的關(guān)鍵因素。如果缺乏雌激素，將導(dǎo)致這一比值失衡。Hou等[26]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在切除了卵巢的大鼠的骨小梁中，LF可以下調(diào)RANKL/OPG比值，從而防止骨丟失。凌冰等[27]發(fā)現(xiàn)，大鼠去除卵巢后，血清LF含量會降低，而且血清LF含量與大鼠的左股骨和腰椎的BMD呈正相關(guān)。綜上所述，LF在骨代謝中具有重要的作用，血清LF含量與BMD的變化有相關(guān)性，LF能否作為預(yù)測PMOP變化的指標(biāo)需要進(jìn)一步研究。

CEACAMs是免疫球蛋白超家族的成員，參與調(diào)節(jié)各種細(xì)胞功能，如增殖、凋亡和分化等[28]。CEACAM8是CEACAMs的成員之一，又稱CD66b，編碼糖基磷脂酰肌醇(GPI)連接的糖蛋白，這種糖蛋白僅在人類粒細(xì)胞中表達(dá)。當(dāng)中性粒細(xì)胞被激活時(shí)，中性粒細(xì)胞中的CD66b表達(dá)上調(diào)[29]。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)中性粒細(xì)胞受到強(qiáng)烈刺激活化后可能會引起顆粒細(xì)胞中部分特定基因表達(dá)增加，如CD66b和LF，且CD66b的表達(dá)水平與LF水平呈正相關(guān)[30]。但是，CD66b的功能很大程度上還是未知的，它與LF的相關(guān)性以及BMD的關(guān)系還需要進(jìn)一步研究。

CAMP基因位于人3p21.31號染色體上，編碼18-kDa的前體蛋白hCAP-18。CAMP基因的表達(dá)是由1α，25-二羥維生素D3[1，25(OH)2D3]通過Toll樣受體通路調(diào)控[31]。有意思的是，1，25(OH)2D3會顯著增加破骨細(xì)胞中CAMP的表達(dá)，但是CAMP的過表達(dá)是否會影響破骨細(xì)胞的功能需要深入研究[31]。

LCN2也稱為中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂鈣蛋白(NGAL)，是脂蛋白家族的重要成員，是脂肪來源的細(xì)胞因子。在成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞中白細(xì)胞介素-17和腫瘤壞死因子-α?xí)黾覮CN2表達(dá)[32]。有研究發(fā)現(xiàn)，LCN2水平升高可能與老年人OP松性骨折的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[33]。

MMP8屬于基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)家族的一員，具有降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力，參與骨骼和軟骨的發(fā)育[34]。Li等[34]發(fā)現(xiàn)，在去除了卵巢的大鼠中，MMP13在mRNA水平和蛋白表達(dá)水平均顯著增加，而MMP8在mRNA和蛋白表達(dá)水平均無顯著變化；MMP13蛋白表達(dá)與骨小梁分離度呈正相關(guān)，與骨小梁數(shù)目呈負(fù)相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，17β-雌二醇可以顯著增加成骨細(xì)胞中雌激素受體和Sirtuin-1(Sirt1)的表達(dá)水平，降低NF-κB和MMP8的表達(dá)水平，即17β-雌二醇通過調(diào)節(jié) Sirt1/NF-κB/MMP8通路改善成骨細(xì)胞功能[35]。

精氨酸酶(ARG)是參與鳥氨酸循環(huán)的重要酶之一，它包括定位于細(xì)胞質(zhì)的ARG1和位于線粒體的ARG2兩種亞型[36]。ARG1過表達(dá)時(shí)，抑制破骨細(xì)胞分化、骨吸收和一氧化氮(NO)生成[37]。有研究表明，NO可能會刺激破骨細(xì)胞分化和活性，進(jìn)一步導(dǎo)致大鼠骨丟失[36]。ARG1可能通過調(diào)節(jié)NO來負(fù)向調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化[37]。骨代謝與CRISP3、DEFA4、HP、BPI、TCN1和ELANE之間的關(guān)系尚未見報(bào)道。

此外，本文也存在一些局限性，如本研究為了精確篩選PMOP與OP相關(guān)的差異基因，減少因數(shù)據(jù)集的不一致性造成的異質(zhì)性，我們對納入的GEO數(shù)據(jù)集進(jìn)行了嚴(yán)格篩選，因此最終納入的患者病例數(shù)較少，未來需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)行更深入的研究。

綜上所述，本研究通過生物信息學(xué)分析，篩選出了與絕經(jīng)后高BMD組患者表達(dá)上調(diào)差異表達(dá)基因34個(gè)，其中CEACAM8、LTF、CRISP3、CAMP、LCN2、DEFA4、MMP8、ARG1、HP、BPI、TCN1和ELANE存在相互作用，且CEACAM8、LTF、CAMP、LCN2、MMP8和ARG1與骨代謝的聯(lián)系密切，但CRISP3、DEFA4、HP、BPI、TCN1和ELANE與骨代謝的聯(lián)系還需要進(jìn)一步研究。本研究篩選出的差異表達(dá)基因?yàn)檠芯拷^經(jīng)后女性骨量的變化提供了一系列的生物標(biāo)記物，深入研究這些基因的生物學(xué)功能，將有助于我們了解PMOP發(fā)生和進(jìn)展的分子機(jī)制。