王 韜 費(fèi)建東 聶雙發(fā) 李 磊

河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院胃腸外科，河北張家口 075000

薏苡仁油，是從薏苡仁中提取出的一種活性成分，在中醫(yī)上具有益氣養(yǎng)陰、消癥散結(jié)的功效。中藥的藥效與腸道菌群存在著密切的聯(lián)系，進(jìn)入消化道的中藥不可避免與腸道菌群接觸，會(huì)對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用或其他影響[1]。有些補(bǔ)益類中藥會(huì)促進(jìn)腸道內(nèi)某些益生菌的生長(zhǎng)、繁殖，而某些清熱解毒類中藥會(huì)抑制一些有害菌的生長(zhǎng)、繁殖及炎癥因子的表達(dá)[2]。近年來，腸道菌群的相關(guān)研究一直是熱點(diǎn)[3-5]，但還未有相關(guān)研究對(duì)薏苡仁油是否對(duì)腸道菌群有調(diào)整作用進(jìn)行驗(yàn)證。因此，本文旨在探討薏苡仁油對(duì)小鼠腸道菌群失衡的調(diào)控研究，以及其對(duì)腸道炎癥因子表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

3 月齡SPF 級(jí)健康雄性昆明小鼠75 只，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，體重（20±2） g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均已通過倫理委員會(huì)審批。

1.2 主要試劑

薏苡仁油（批號(hào)：1503163-1）購于浙江康萊特藥業(yè)公司；鹽酸林可霉素（批號(hào)：L0166-201408）購于百靈威科技有限公司；Qiagen RNeasy Mini Kit 試劑盒（貨號(hào)：74104）購于北京碧橙藍(lán)生物科技有限責(zé)任公司；cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 （TOYOBO）（貨號(hào)：fsq-101）購于上海松雷生物科技有限公司；SYBR Green 染料（TOYOBO）（貨號(hào)：QPK-201）購于北京索萊寶科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模與分組 按照隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為5 組，即空白對(duì)照組、造模組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組15 只。造模使用林可霉素灌胃干擾小鼠腸道菌群，0.3 mL/次，2 次/d，連續(xù)灌胃3 d，小鼠出現(xiàn)腹瀉現(xiàn)象，氣相色譜法檢測(cè)小鼠糞便中的短鏈脂肪酸乙酸、丙酸、丁酸，對(duì)應(yīng)的出峰時(shí)間沒有出峰，即建模完成?？瞻讓?duì)照組采用等劑量的生理鹽水進(jìn)行灌胃，0.3 mL/次，2 次/d，連續(xù)灌胃3 d。造模過程中無模型的脫落。

造模后，造模組和空白對(duì)照組給予0.33 g/（kg·d）生理鹽水，低、中、高劑量組分別給予0.17、0.33、1.00 g/（kg·d）薏苡仁油進(jìn)行灌胃30 d，實(shí)驗(yàn)完成后頸椎脫臼處死小鼠，稱其體重。嚴(yán)格按照無菌操作規(guī)范，取出實(shí)驗(yàn)所需結(jié)腸，行后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。

1.3.2 蘇木精-伊紅（HE）染色 取一部分結(jié)腸，用甲醛固定，固定好的組織沖洗過夜后，分別用70%、80%、90%、95%、95%、100%、100%乙醇進(jìn)行脫水各1 h，石蠟包埋，切成4 μm 切片，HE 染色，封片。顯微鏡觀察。

1.3.3 腸道菌群的測(cè)定 在無菌條件下，在結(jié)腸樣本中各刮出0.2 g 腸道內(nèi)容物，1 mL 無菌水稀釋，轉(zhuǎn)入滅菌eppendorf（EP）管中。隨后震蕩30 min 充分混勻后，吸取0.5 mL 轉(zhuǎn)入另一EP 管內(nèi)，繼續(xù)震蕩10 min。稀釋到10-6mmol/L 后，將最后的樣品吸取50 μL 涂布到無菌選擇性培養(yǎng)基中，每個(gè)稀釋度做3 個(gè)重復(fù)樣本。在37℃條件下，雙歧桿菌、乳酸桿菌在無菌厭氧環(huán)境下培養(yǎng)24 h，腸球菌、腸桿菌在普通環(huán)境下培養(yǎng)24 h進(jìn)行計(jì)數(shù)，取其平均值。參考《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范（2003 年版）》[6]要求培養(yǎng)后統(tǒng)計(jì)其菌落總數(shù)，結(jié)果以常用對(duì)數(shù)值logCFU/g 表示。

1.3.4 炎癥因子的測(cè)定 用液氮研磨法將冷凍小鼠回腸組織勻漿，用不含EDTA 的胰酶消化收集，收集總數(shù)約為1×106個(gè)細(xì)胞。取5×105個(gè)/mL 接種于6 孔板中，每孔2 mL 培養(yǎng)液，用trizol 法提取總RNA。棄去培養(yǎng)液，取總RNA（根據(jù)濃度計(jì)算體積）1 μg，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。PCR 反應(yīng)體系（20 μL）為cDNA 第一鏈產(chǎn)物1 μL，DreamTaq Green PCR Master Mix（2×） 10 μL，10 μmol/L 上游引物0.2 μL，10 μmol/L 下游引物0.2 μL，ddH2O 為8.6 μL。上述反應(yīng)體系振蕩混勻后置于PCR 儀中進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性3 min，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，持續(xù)30 個(gè)循環(huán)。取每組PCR 產(chǎn)物各5 μL 在瓊脂糖凝膠（1.5%）電泳30 min 后，用凝膠成像系統(tǒng)掃描、分析，以白細(xì)胞介素（IL）-6、趨化因子2（CCL2）、IL-1α、IL-1β 與內(nèi)參β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）積分吸光度IA 比值進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。具體引物序列如表1。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較用采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q 法。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 各組基因引物序列

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)觀察

空白對(duì)照組小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，腸絨毛正常，無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；造模組小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)破壞，層次不清，彌漫炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；低劑量組小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)基本完整，腸絨毛減少，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)于腸絨毛內(nèi)及上皮全層；中劑量組小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)基本完整，腸絨毛減少，炎癥細(xì)胞較少，只浸潤(rùn)于腸絨毛內(nèi)；高劑量組小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，腸絨毛正常，基本無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。見圖1。

圖1 各組小鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)（HE，400×）

2.2 各組小鼠結(jié)腸菌群結(jié)果比較

造模組小鼠結(jié)腸中腸球菌、腸桿菌計(jì)數(shù)高于空白對(duì)照組；雙歧桿菌、乳酸桿菌計(jì)數(shù)低于空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。低、中、高劑量組小鼠結(jié)腸中腸球菌、腸桿菌低于造模組；雙歧桿菌、乳酸桿菌高于造模組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。各劑量組間各結(jié)腸菌群結(jié)果比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。見表2。

表2 各組小鼠結(jié)腸菌群結(jié)果比較（logCFU/g，）

表2 各組小鼠結(jié)腸菌群結(jié)果比較（logCFU/g，）

注：與空白對(duì)照組比較，aP < 0.05；與造模組比較，bP < 0.05；與低劑量組比較，cP < 0.05；與中劑量組比較，dP < 0.05

2.3 各組小鼠體重比較

第0、15、30 天，造模組小鼠體重低于空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。第15 天，中、高劑量組小鼠體重高于造模組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。第30 天，低、中、高劑量組小鼠體重高于造模組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。第15、30天，各濟(jì)量組間小鼠體重比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05）。見表3。

表3 各組小鼠體重比較（g，）

表3 各組小鼠體重比較（g，）

注：與空白對(duì)照組比較，aP < 0.05；與造模組比較，bP < 0.05；與低劑量組比較，cP < 0.05；與中劑量組比較，dP < 0.05

2.4 各組小鼠炎癥因子比較

造模組IL-6、CCL2、IL-1α、IL-1β 水平高于空白對(duì)照組；低、中、高劑量組IL-6、CCL2、IL-1α、IL-1β水平低于造模組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。各劑量組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表4。

表4 各組小鼠炎癥因子比較（pg/mL，）

表4 各組小鼠炎癥因子比較（pg/mL，）

注：與空白對(duì)照組比較，aP < 0.05；與造模組比較，bP < 0.05；與低劑量組比較，cP < 0.05；與中劑量組比較，dP < 0.05

3 討論

禾本植物薏苡的成熟種仁主要含蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化物[7]?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》[8]里提到其種仁可以清熱解毒、健脾止瀉、鎮(zhèn)痛、可供食用，在中醫(yī)中用于治療水腫、腳氣、小便不利、脾虛泄瀉、濕痹拘攣、肺癰、腸癰、贅疣、癌腫。薏苡仁油是從薏苡仁中提取得到的脂肪油。研究發(fā)現(xiàn)[9-11]，薏苡仁油中的主要成分有薏苡仁酯、薏苡內(nèi)酯、棕櫚酸、硬脂酸、十八碳一烯酸、十八碳二烯酸、肉豆蔻酸、甾醇類、角鯊烯和維生素E等。以薏苡仁油為主要成分的抗腫瘤藥物康萊特注射液已經(jīng)在臨床上廣泛應(yīng)用[12-13]，但薏苡仁油藥理方面的研究不僅僅局限于抗腫瘤，也能夠改善菌群失衡、抑制炎癥因子的功能。

微生物與健康的關(guān)系一直是人們關(guān)注的話題，但長(zhǎng)期以來對(duì)腸道微生物與健康關(guān)系的了解卻非常有限。隨著新的研究方法的不斷出現(xiàn)，腸道微生物對(duì)人類健康的影響重新引起重視，成為當(dāng)前生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)[14-18]。腸道微生物又被認(rèn)為是人體的第二基因組，與人體基因組一起，通過與環(huán)境因素的相互作用，通過不同方式影響健康[19]。腸道就是免疫系統(tǒng)的最前線的基地。體內(nèi)約70%的免疫細(xì)胞集中在腸黏膜，而且使這些免疫細(xì)胞活化的，正是腸道細(xì)菌[20-21]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低、中、高劑量組小鼠結(jié)腸中腸球菌、腸桿菌低于造模組；雙歧桿菌、乳酸桿菌高于造模組（均P < 0.05）。提示薏苡仁油對(duì)林可霉素小鼠模型的腸道菌群失衡具有很好的調(diào)節(jié)作用。此外，薏苡仁油還能夠增加菌群失衡小鼠的體重，間接說明小鼠各臟器蛋白合成能力提高。

研究顯示[22-24]，炎癥性腸病被認(rèn)為是腸道微生物失衡產(chǎn)生的刺激，引發(fā)遺傳易感個(gè)體對(duì)腸道共生菌的異常免疫應(yīng)答，進(jìn)而造成腸道損傷。許多中藥都有調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡的作用[25-27]。通過各組小鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)觀察可見，菌群失衡小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)破壞、層次不清、彌漫炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，薏苡仁油能夠改善結(jié)腸黏膜直至接近正常。

IL-6、CCL2、IL-1α、IL-1β 為人體的前炎癥因子，對(duì)于炎癥反應(yīng)有很大的預(yù)示作用，因此本研究測(cè)量了這些前炎癥因子，反映了小鼠整體的炎癥情況[28-32]。其中IL-1、IL-6 是由一組單核巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，具有激活T、B 細(xì)胞分化，增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞，促進(jìn)吞噬功能，也是機(jī)體炎癥反應(yīng)和一系列病理生理過程的重要炎癥介質(zhì)。CCL2 在感染或損傷過程中產(chǎn)生高濃度，并決定炎癥性白細(xì)胞向受損區(qū)域的遷移。對(duì)腸道炎癥因子的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，薏苡仁油有效地抑制了林可霉素小鼠模型腸道炎癥因子IL-6、CCL2、IL-1α、IL-1β 的表達(dá)。因此，薏苡仁油的應(yīng)用不應(yīng)僅僅局限于癌癥治療，還可以擴(kuò)展到炎癥性腸病的治療中。

綜上所述，薏苡仁油可改善小鼠的腸道菌群失衡，并抑制腸道炎癥因子表達(dá)。隨著科學(xué)的進(jìn)步，人類將更深入地從細(xì)胞、分子、基因水平對(duì)薏苡仁油的功效與臨床應(yīng)用進(jìn)行更深入的研究。