周 穎 侯 征 薛小燕 魏 明 李 汾 姚 佳 張 曄 汪 洋

1.西安醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，陜西西安 710021；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)藥理學(xué)教研室，陜西西安 710032；3.西安醫(yī)學(xué)院分子病毒與病毒免疫學(xué)實驗室，陜西西安 710021

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的群體感應(yīng)系統(tǒng)-附屬基因調(diào)節(jié)（agr）系統(tǒng)，調(diào)控多種毒力因子表達(dá)[1-3]，其中最重要的一類毒力因子是葡萄球菌溶素[4-6]。MRSA 還能夠表達(dá)一些黏附蛋白，促進(jìn)細(xì)菌生物膜的形成。這些毒力因子在MRSA 侵襲性感染過程中發(fā)揮重要作用[7-8]。RNAⅢ抑制肽（RIP）是agr 系統(tǒng)抑制劑。本研究設(shè)計合成了新的RIP 衍生物RIP1183，檢測其對MRSA 的生長和生物膜形成的影響，以及在不同時相對重要毒力因子表達(dá)的影響，探討RIP1183 抗菌、抗生物膜的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

ELx800 酶標(biāo)儀（美國Bio-tek 公司）；AL204 電子天平（梅特勒-托利多）；ZHWY-200D 恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智誠分析儀器制造有限公司）；MX3005P1 實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）儀（美國安捷倫）。微量RNA 提取試劑盒RNeasy Mini Kit（QIAGEN），細(xì)菌RNA 提取試劑盒RNAprep pure Bacteria Kit，反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript Kit，Premix Taq RT-PCR 系統(tǒng)（TaKaRa）。異硫氰酸熒光素（FITC）、葡萄糖均購自Sigma 公司；胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 菌株和藥品

MRSA（USA300）由美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）的Michael Otto 教授友情惠贈。RIP1183 由本課題組設(shè)計，委托空軍軍醫(yī)大學(xué)生物制藥教研室合成，白色疏松粉末，批號：20141001，含量：99.41%，保存條件：-20℃低溫保存。

1.3 細(xì)菌培養(yǎng)

按照1∶100 的比例接種MRSA（USA300）至5 mL的培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)14 h，將過夜培養(yǎng)的細(xì)菌分別轉(zhuǎn)接至10 mL TSB 培養(yǎng)基 （含0.5%的葡萄糖），將細(xì)菌濃度調(diào)整至1×108CFU/mL。RIP 組加入RIP1183使其終濃度為50 μg/mL。對照組加入無菌磷酸鹽緩沖液。37℃振蕩培養(yǎng)，每隔2 h 測定1 次吸光度（OD）630值，監(jiān)測12 h 內(nèi)細(xì)菌生長情況，實驗重復(fù)3 次。

收集菌體，細(xì)菌培養(yǎng)操作同上，每隔2 h 吸取100 μL 菌液，12 000 r/min，4℃，離心10 min，棄去上清，收集沉淀（細(xì)菌），保存至-80℃冰箱中。

1.4 細(xì)菌生物膜

細(xì)菌過夜培養(yǎng)，用含有0.5%葡萄糖的TSB 培養(yǎng)液將菌液稀釋至1×106CFU/mL，接種于48 孔培養(yǎng)板中。RIP 組加入RIP1183，使藥物終濃度為50 μg/mL，對照組加入無菌磷酸鹽緩沖液。37℃濕盒中孵育48 h后，棄上清，無菌磷酸鹽洗掉浮游菌和雜質(zhì)。然后用FITC（0.1 mg/mL）標(biāo)記貼壁細(xì)菌，無菌磷酸鹽清洗3 次，避光4℃保存，熒光顯微鏡（Olympus，CKX41）觀察貼壁細(xì)菌并拍照。使用Image J 軟件定量分析熒光強(qiáng)度。

1.5 qRT-PCR

為了探討金黃色葡萄球菌不同生長時相，agr 系統(tǒng)的激活情況，以及RIP1183 對細(xì)菌葡萄球菌溶素和生物膜形成的影響，分別檢測細(xì)菌遲緩期（2 h）、對數(shù)期（6 h）和穩(wěn)定期（10 h）16S rRNA、RNAⅢ、人類白細(xì)胞抗原（HLA）、icaA 和fnbA 基因的表達(dá)水平。

收集的細(xì)菌，按照微量RNA 提取試劑盒RNeasy Mini Kit 說明書，提取細(xì)菌總RNA。將RNA 溶于30 μL的DEPC 水，然后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit 獲得cDNA。qRT-PCR 反應(yīng)：反應(yīng)體系20 μL，包括cDNA 2 μL，2×SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ10 μL，上游引物（10 μm）1 μL，下游引物（10 μm）1 μL，無菌ddH2O 6 μL。反應(yīng)條件：segment 1：95℃、5 min；segment 2：95℃、10 s，55℃、30 s，40 個循環(huán)；segment 3：95℃、15 s，55℃、60 s，95℃、15 s；每個反應(yīng)重復(fù)3 次。用2-ΔΔCT法計算分析各組基因相對于內(nèi)參基因16S rRNA的表達(dá)量。用于檢測基因表達(dá)水平的引物序列，見表1。

表1 用于檢測基因表達(dá)水平的引物序列

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism Version 5.0 統(tǒng)計軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用獨(dú)立樣本t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RIP1183 對MRSA（USA300）生長曲線的影響

MRSA（USA300）培養(yǎng)在含葡萄糖的TSB 培養(yǎng)基中，2 h 后由遲緩期進(jìn)入對數(shù)期，8 h 后進(jìn)入穩(wěn)定期；RIP 組加入RIP1183（50 μg/mL），MRSA（USA300）同樣是在2 h 進(jìn)入對數(shù)期，8 h 后進(jìn)入穩(wěn)定期。與對照組比較，RIP1183 不影響細(xì)菌生長，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。見圖1。

圖1 RIP1183 對MRSA（USA300）生長曲線的影響

2.2 RIP1183 對細(xì)菌生物膜形成的影響

與對照組比較，RIP 組細(xì)菌生物膜形成顯著減少（P ＜0.01）。見圖2。

2.3 不同時相RIP1183 對RNAⅢ、HLA、icaA 和fnbA基因表達(dá)水平的影響

遲緩期（2 h），兩組RNAⅢ、HLA、icaA 和fnbA 總體表達(dá)水平都較低；對數(shù)期（6 h），RNAⅢ和HLA 表達(dá)水平快速升高；穩(wěn)定期（10 h），RNAⅢ和HLA 表達(dá)水平下降，但是生物膜形成的黏附相關(guān)基因（icaA 和fnbA）的表達(dá)水平升高。

遲緩期（2 h），與對照組比較，RIP 組RNAⅢ表達(dá)明顯降低（P ＜0.05）。對數(shù)期（6 h），與對照組比較，RIP 組RNAⅢ、HLA 表達(dá)顯著降低（P ＜0.01）；穩(wěn)定期（10 h），與對照組比較，RIP 組icaA、fnbA 和RNAⅢ表達(dá)顯著降低（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見表2。

圖2 RIP1183 對細(xì)菌生物膜形成的影響

表2 不同時相RIP1183 對RNAⅢ、HLA、icaA 和fnbA 基因表達(dá)水平的影響（，n=6）

表2 不同時相RIP1183 對RNAⅢ、HLA、icaA 和fnbA 基因表達(dá)水平的影響（，n=6）

注：與對照組同期比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；HLA：人類白細(xì)胞抗原；RIP：RNAⅢ抑制肽

3 討論

agr 群體感應(yīng)系統(tǒng)是金黃色葡萄球菌的重要調(diào)控系統(tǒng)，參與調(diào)節(jié)細(xì)菌多種生理活動，對于維持金黃色葡萄球菌生物膜結(jié)構(gòu)和細(xì)菌的致病性也是必不可少的[9-10]。RNAⅢ是agr 系統(tǒng)的效應(yīng)分子，agr 系統(tǒng)激活后，RNAⅢ表達(dá)水平升高，RNAⅢ通過與靶基因5’非翻譯區(qū)（5’UTR）反義堿基配對，形成RNA 雙鏈體，從而進(jìn)一步調(diào)控一系列靶基因的表達(dá)[11-12]。RNAⅢ調(diào)控多種毒力因子表達(dá)包括葡萄球菌溶素和細(xì)菌生物膜形成相關(guān)蛋白的表達(dá)。其中最重要的1 種葡萄球菌溶素是α-溶血素，由HLA 基因編碼，它可以破壞宿主多種細(xì)胞的細(xì)胞膜，改變細(xì)胞滲透壓，使宿主細(xì)胞溶解[4,13-14]。動物實驗[4-5]表明，敲除金黃色葡萄球菌HLA基因后，顯著降低了其對感染動物的致病性。纖連蛋白結(jié)合蛋白FnbA 是由fnbA 基因編碼的1 種多閾結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，它能夠吸引并黏附宿主的纖維蛋白原，介導(dǎo)金黃色葡萄球菌黏附于生物體表面，并使細(xì)菌逃離免疫系統(tǒng)的識別，是生物膜形成的黏附階段的重要調(diào)控蛋白[15-17]。icaA 基因編碼的蛋白是1 種普遍存在于金黃色葡萄球菌中的跨膜蛋白，具有N-乙酰葡萄糖氨基轉(zhuǎn)移酶活性，與細(xì)菌生物膜的形成有直接關(guān)系，也是生物膜形成的必要因素[15]。

據(jù)文獻(xiàn)[18]報道，在培養(yǎng)基中補(bǔ)充葡萄糖，可以促進(jìn)細(xì)菌生物膜的形成，因此本研究采用含有葡萄糖的TSB 培養(yǎng)基培養(yǎng)MRSA（USA300），發(fā)現(xiàn)RIP1183 不影響MRSA（USA300）的生長，結(jié)果與文獻(xiàn)報道的群體抑制劑不影響細(xì)菌生長的結(jié)論相一致[19]。但是體外生物膜形成實驗結(jié)果顯示，RIP1183 可以顯著抑制MRSA（USA300）生物膜的形成。為了探討金黃色葡萄球菌不同生長時相agr 系統(tǒng)的激活情況，以及RIP1183對葡萄球菌溶素和生物膜形成的影響，分別在細(xì)菌遲緩期（2 h）、對數(shù)期（6 h）和穩(wěn)定期（10 h），檢測了RNAⅢ、HLA、icaA 和fnbA 基因的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，遲緩期（2 h）是細(xì)菌轉(zhuǎn)接后對新環(huán)境的短暫適應(yīng)過程，4 種基因RNAⅢ、HLA、icaA 和fnbA 總體表達(dá)水平都較低；進(jìn)入對數(shù)期（6 h）后，細(xì)菌快速增殖，RNAⅢ表達(dá)水平快速升高，顯示agr 系統(tǒng)被激活，HLA表達(dá)也快速增高；進(jìn)入穩(wěn)定期（10 h）后，HLA 表達(dá)下降，但是與生物膜形成的黏附相關(guān)基因（icaA 和fnbA）的表達(dá)水平升高。MRSA 通過agr 群體感應(yīng)系統(tǒng)，在不同時相調(diào)控不同的毒力因子的表達(dá)，以適應(yīng)不同生長環(huán)境。對數(shù)期，釋放大量葡萄球菌溶素，增加細(xì)菌的毒力和致病性；到了穩(wěn)定期，黏附相關(guān)蛋白表達(dá)水平增高，促進(jìn)細(xì)菌生物膜的形成，有利于細(xì)菌對抗外界極端環(huán)境（如營養(yǎng)缺乏、低pH、高滲透壓或抗生素等），這是細(xì)菌非常重要的環(huán)境適應(yīng)機(jī)制[20-21]。

更重要的是，在3 個時相，RIP1183 均能顯著抑制RNAⅢ表達(dá)，同時顯著降低對數(shù)期HLA 的表達(dá)及穩(wěn)定期生物膜黏附相關(guān)基因（icaA 和fnbA）的表達(dá)水平。本研究結(jié)果提示，群體抑制劑RIP1183 能通過干擾細(xì)菌agr 系統(tǒng)，影響不同時相，不同基因的表達(dá)，從而破壞細(xì)菌對環(huán)境適應(yīng)機(jī)制，可能是其抗MRSA 活性的重要機(jī)制之一。另外，群體感應(yīng)系統(tǒng)抑制劑不影響細(xì)菌的生長，不會或幾乎不會給細(xì)菌造成選擇性生存壓力，引起細(xì)菌耐藥的可能性比較小[22]。因此，抑制群體感應(yīng)系統(tǒng)可能成為治療MRSA 生物膜相關(guān)感染性疾病的新策略。