藍(lán)青萍，馮凱，王曉丹，潘玥，陳俊英，孫強(qiáng)明

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650118

西尼羅河病毒（West Nile virus，WNV）是一種單鏈正義RNA 病毒，屬于黃病毒科黃病毒屬，于1937年首次從西尼羅河烏干達(dá)省一名發(fā)熱婦女的血液中分離出來(lái)，在隨后的幾十年里，WNV 席卷了亞洲、歐洲、非洲、北美等地區(qū)［1-3］。

WNV 是病毒性腦炎的主要病原體，在自然界中，以鳥(niǎo)-蚊-鳥(niǎo)的傳播周期維持循環(huán)，主要通過(guò)蚊蟲(chóng)尤其是庫(kù)蚊媒介進(jìn)行傳播［4-5］。人類感染W(wǎng)NV 可引起西尼羅熱和WNV 性腦炎，臨床癥狀包括無(wú)癥狀感染或輕度急性發(fā)熱性疾病及神經(jīng)系統(tǒng)疾病，包括腦膜炎、腦炎、急性弛緩性麻痹［6-7］。WNV 具有生物多樣性，基于遺傳差異，目前提出了9 個(gè)WNV譜系［3，8］，見(jiàn)表 1。由于目前對(duì) WNV 感染尚無(wú)明確的治療方法，因此開(kāi)發(fā)安全有效的人用疫苗對(duì)預(yù)防WNV 感染至關(guān)重要［9-10］。不同地理位置的WNV 遺傳變異可能與病毒的毒力、擴(kuò)增和遺傳等有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)，WNV 的 E 蛋白第 154 ～ 156 位點(diǎn)是糖基化位點(diǎn)，被認(rèn)為是毒力因子，該位點(diǎn)的刪除可降低病毒的復(fù)制［11］，因此推測(cè)該位點(diǎn)可作為WNV 疫苗研究的潛在靶點(diǎn)。

本研究分析了亞洲區(qū)來(lái)自中國(guó)、馬來(lái)西亞、印度、以色列、巴基斯坦、伊朗和土耳其等WNV 流行株的進(jìn)化特征、流行趨勢(shì)及WNV 結(jié)構(gòu)蛋白E 的核苷酸和氨基酸突變特征等，旨在為后續(xù)研究WNV的傳播和感染機(jī)制及疫苗的研發(fā)提供依據(jù)。

表1 WNV 譜系概述Tab.1 Overview of WNV lineages

1 材料與方法

1.1 亞洲區(qū)WNV 流行株核酸序列獲取 以“West Nile virus”為檢索詞在 NCBI-Pubmed 查詢 WNV 的流行情況，發(fā)現(xiàn)在亞洲地區(qū)，WNV 于1951 在以色列首次暴發(fā)，20 世紀(jì)70 年代土耳其和伊朗也有WNV的報(bào)告［1-3］，20 世紀(jì)50 年代從印度西部和南部的蚊蟲(chóng)中分離出WNV 毒株，2013 年中國(guó)新疆省首次確診WNV 的人類病例［4］。分別以“West Nile virus”、“West Nile virus China”、“West Nile virus India”、“West Nile virus Israel”、“West Nile virus Pakistan”、“West Nile virus Iran”、“West Nile virus Malaysia”、“West Nile virus Turkey”等為關(guān)鍵詞和主題詞，在NCBI 的Pubmed（https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov ／pubmed ／）和 GenBank（https：／ ／ www.ncbi.nlm.nih.gov ／ nuccore ／）上進(jìn)行檢索，并獲取亞洲區(qū)WNV流行株核苷酸序列。

1.2 亞洲區(qū)WNV 流行株的序列進(jìn)化分析 選取在GenBank 中登錄的 WNV 亞洲地區(qū)病毒株China（AY490240、JX442278、JX442279、JX442280、JX442-281、JX442282）、India（JQ303102、GQ851605、KU97-8770、GQ851604、KC601756、JX041632、EU249803）、Israel（HM152776、HM051416、AY688948、HM152775、HM152773、AF481864）、Pakistan（MH545365、MH54-5363、MH545364、JX070655）、Iran（MF462262、KJ48-6150）、Malaysia（MK327792、MK327802、MK327788、MK327789）、Turkey（JN828806、KJ433826、KJ958922、KP400657、KC290932、MK327808） 以及參考病毒株New York（AF196835）、Australia（D00246）、India（DQ-256376）、Uganda（AY532665）、Czech Republic（AY7-65264）、Russia（277251）、Austria（KJ831223）、Senegal（EU082200）、Senegal（KJ131502），應(yīng)用 BIOEDIT 軟件對(duì)上述WNV 亞洲地區(qū)病毒株核酸序列進(jìn)行多重比對(duì)。利用 MEGA 6.0 軟件構(gòu)建病毒全長(zhǎng)序列和部分E 蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建參數(shù)為：最大似然法，Bootstrap 設(shè)為1 000。

1.3 E 蛋白突變分析 將亞洲地區(qū)病毒株的E 蛋白核苷酸序列進(jìn)行譜系1 和譜系2 比對(duì)，分析核酸突變情況，再通過(guò)在線翻譯（http：／ ／ www.bio-soft.net ／sms ／ index.html）將堿基序列翻譯成氨基酸序列，分析氨基酸突變替代情況。

2 結(jié) 果

2.1 亞洲區(qū)WNV 流行株核苷酸序列的獲取 經(jīng)檢索，獲取亞洲區(qū)WNV 流行株核苷酸序列見(jiàn)表2。

2.2 亞洲區(qū)WNV 流行株的序列進(jìn)化分析 通過(guò)GenBank 獲取亞洲區(qū)WNV 流行地區(qū)中國(guó)、馬來(lái)西亞、印度、以色列、巴基斯坦、伊朗和土耳其的WNV全基因組序列和部分E 蛋白基因組序列，將獲取的WNV 全基因組序列與不同譜系的代表株進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，見(jiàn)圖1，可以看出，WNV 以色列株（HM152773、AF481864）在親緣關(guān)系上與譜系 1a 株最為接近，而以色列株（AY688948）在親緣關(guān)系上與譜系2 株較為接近，印度株（KU978770）的親緣關(guān)系與譜系1c 接近，且分布在不同的小支上。將獲取的不同譜系代表株的E 蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn) WNV 中國(guó)株（JX442278，JX42280-JX44-2282）在親緣關(guān)系上與譜系1a 株最為接近，馬來(lái)西亞株在親緣關(guān)系上與伊朗株（KJ486150）接近，巴基斯坦株與印度株（JQ303102）接近，而馬來(lái)西亞株和巴基斯坦株與其他譜系的WNV 株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，分布在不同的兩大分支上，見(jiàn)圖2。上述亞洲區(qū)WNV流行株的序列進(jìn)化分析表明，亞洲區(qū)流行的WNV 可能來(lái)源于譜系1 株與譜系2 株，且病毒可能存在位點(diǎn)突變。

表2 亞洲區(qū)WNV 流行株核苷酸序列Tab.2 Nucleotide sequences of WNV endemic strains in Asia

圖1 根據(jù)WNV 全基因組序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree constructed based on complete nucleotide sequence of WNV

圖2 根據(jù)WNV E 蛋白部分序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree constructed based on partial sequence of WNV E protein

2.3 WNV E 蛋白突變分析 將中國(guó)、巴基斯坦、印度、以色列和土耳其共5 株WNV 的E 蛋白與譜系1 和譜系2 WNV 代表株的E 蛋白進(jìn)行核酸序列和氨基酸序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與譜系2 株相比，WNV E 蛋白堿基突變率和氨基酸突變率整體比譜系1 高。與譜系1 相比，除印度株（KU978770）外，所有其他株 E 蛋白的堿基突變率和氨基酸突變率與譜系1a 相比最低，表明WNV 譜系1a 在亞洲區(qū)較為流行；而印度株（KU978770）與譜系 1c 株相比，其 E 蛋白堿基突變率與氨基酸突變率最低，分別為0.8%和0.4%，這與前面進(jìn)化分析的結(jié)果一致，即印度株（KU978770）與譜系1c 株在親緣關(guān)系上最為接近，見(jiàn)表3 和表4。將亞洲區(qū)流行的WNV 株E 蛋白與譜系1a 比對(duì)發(fā)現(xiàn)，印度株（GQ851605、JX041632、GQ851604 和 KU-978770）的第154 和156 位氨基酸分別由天冬酰胺突變?yōu)樘於彼岷徒z氨酸（N154D、N154S），絲氨酸突變?yōu)楦彼岷捅彼幔⊿156P、S156A），而中國(guó)株（AY490240）、巴基斯坦株（JX070655）及以色列株（HM051416）的第156 位氨基酸分別由絲氨酸突變?yōu)楦彼?、苯丙氨酸和脯氨酸（S156P、S156F、S156P），見(jiàn)表5，推測(cè)這些位點(diǎn)的改變可能與病毒的毒力、致病性、神經(jīng)侵襲性、流行等有關(guān)。

表3 WNV E 蛋白堿基突變率（%）Tab.3 Base mutation rate of WNV E protein（%）

表4 WNV E 蛋白氨基酸突變率（%）Tab.4 Amino acid mutation rate of WNV E protein（%）

表5 WNV E 蛋白氨基酸突變位點(diǎn)分析Tab 5.Analysis of amino acid mutation sites of WNV E protein

3 討 論

E 蛋白是病毒包膜的主要成分，位于病毒顆粒的最外層，主要參與細(xì)胞表面受體識(shí)別與結(jié)合，與病毒進(jìn)入細(xì)胞以及與宿主膜融合相關(guān)。E 蛋白是WNV的主要毒力因子，一些報(bào)道認(rèn)為，E 蛋白糖基化位點(diǎn)的突變是影響WNV 毒力改變的重要因素［11-12］。本研究將亞洲地區(qū)不同國(guó)家不同WNV 株的E 蛋白氨基酸序列與譜系1 和譜系2 相比，發(fā)現(xiàn)與譜系2 相比，E蛋白的堿基和氨基酸的突變率較高，表明譜系1 的病毒株在亞洲區(qū)流行廣泛。E 蛋白的第154 ～156 位是WNV 譜系 1（1a 和 1b）和譜系 2 的糖基化位點(diǎn)，該位點(diǎn)被認(rèn)為與病毒毒力相關(guān)，分析發(fā)現(xiàn)，E 蛋白的第154 和156 位氨基酸存在變異，推測(cè)可能與亞洲區(qū)流行株的毒力、致病性、神經(jīng)侵襲性、流行等有關(guān)。

自1937 年在烏干達(dá)分離出WNV 以來(lái)，該病毒已在全球傳播，分別分布于非洲、亞洲、歐洲和澳大利亞［2］。自 1999 年以來(lái)，WNV 的流行出現(xiàn)在美洲，具有較高的發(fā)病率和死亡率。2014 年，美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心（CDC）的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)表明，WNV 是美國(guó)神經(jīng)侵染性蟲(chóng)媒病毒疾病的最常見(jiàn)病原［13］。有文獻(xiàn)表明，近幾年WNV 在世界范圍內(nèi)不斷擴(kuò)散傳播，并發(fā)現(xiàn)基因型為WNV02 的毒株在全球范圍內(nèi)的擴(kuò)散效率比NY99 毒株更高，表明病毒的傳播和暴發(fā)與其基因的進(jìn)化顯著相關(guān)［14］，因此，分析WNV 的系統(tǒng)發(fā)育和分子進(jìn)化特征，對(duì)研究WNV 的傳播流行和感染機(jī)制具有重要意義。基于系統(tǒng)發(fā)生的分類，目前可將WNV 分為9 個(gè)譜系，能引起人類感染的WNV主要來(lái)自譜系 1 和譜系2［15-16］，譜系 1 通常分布在非洲、歐洲、澳大利亞、亞洲、北美和中美洲及中東，譜系1a 在美國(guó)（NY99 毒株）、非洲、歐洲和中東地區(qū)分布最廣，可能是引起這些地區(qū)大暴發(fā)的原因［3］；而譜系2 的WNV 早期主要在非洲大陸局部流行，后來(lái)傳到了俄羅斯、匈牙利、意大利和希臘［17］。本研究將亞洲區(qū)流行株與不同譜系的代表株進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)亞洲區(qū)流行的WNV 可能來(lái)源于譜系1株和譜系2 株，且病毒可能存在進(jìn)化突變。

綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)亞洲流行地區(qū)WNV的核苷酸序列和E 蛋白序列進(jìn)行分析比對(duì)，構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)，比較其親緣關(guān)系，并進(jìn)一步闡述了這些病毒株間E 蛋白核苷酸和氨基酸突變情況，為后續(xù)研究WNV 的暴發(fā)流行機(jī)制提供了理論依據(jù)。