劉珊珊 ，吳陳華 ，劉宇 ，3，趙尚琪 ，赫鳴睿 ，王麗 ，王天 ，何泊寧 ，張世勛 ，岳山 ，黃雯靜 ，朱戰(zhàn)波

1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江大慶163319；2.黑龍江省牛病防控工程技術(shù)研究中心，黑龍江大慶163319；3.黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，黑龍江齊齊哈爾161005

程序性細(xì)胞死亡蛋白-1（programmed cell death protein 1，PD-1）及程序性死亡配體-1（programmed deathligand 1，PD-L1）被認(rèn)為是外周免疫耐受和病原體特異性免疫抑制的核心［1］，于各種類型的慢性感染及腫瘤疾病中，PD-1 及PD-L1 在抑制慢性病原體激活T 細(xì)胞的生物學(xué)功能中起重要作用，可誘導(dǎo)T 細(xì)胞“衰竭”［2-3］。研究表明，慢性病毒感染期間，PD-1 在衰竭的T 細(xì)胞上高度表達(dá)，且阻斷PD-1／PD-L1 途徑，可恢復(fù)T 細(xì)胞功能，使T 細(xì)胞增殖并產(chǎn)生效應(yīng)細(xì)胞因子［1］。HIV、HCV、HBV、低分子量病毒（low molecular weight virus，LMCV）等慢性病毒感染期間，PD-1 ／PD-L1途徑與病毒特異性T 細(xì)胞的衰竭有關(guān)。在豬、雞、貓、狗及牛體內(nèi)發(fā)現(xiàn)PD-1／ PD-L1 途徑，有助于慢性傳染病的發(fā)病機(jī)制及免疫逃避的研究。用PD-1 或PD-L1特異的單克隆抗體（mAb）治療，在臨床試驗(yàn)及癌癥患者體內(nèi)均重新激活了衰竭的免疫應(yīng)答，如T 細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子的產(chǎn)生及細(xì)胞毒素作用［2，4-6］。

來自實(shí)驗(yàn)性淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒（lymphocytic choroid plexus meningitis virus，LCMV）感染的證據(jù)表明，PD-1 ／ PD-L1 通路在抑制病毒特異性CD8+T 細(xì)胞在小鼠慢性病毒感染中起關(guān)鍵作用［7］。在牛白血病病毒（bovine leukemia virus，BLV）感染的牛PD-L1 阻斷被認(rèn)為是改善針對腫瘤及慢性感染的免疫應(yīng)答的適當(dāng)策略［8］。前期實(shí)驗(yàn)使用人PD-1 抗體體外阻斷 PD-1 ／ PD-L1 通路，結(jié)果表明，PD-1 在急性牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）感染引起的外周血淋巴細(xì)胞（peripheral blood lym-phocytes，PBL）減少及細(xì)胞凋亡中起重要作用［9］。

本研究使用原核表達(dá)系統(tǒng)對牛PD-1 胞外區(qū)重組蛋白進(jìn)行表達(dá)，純化后免疫小鼠制備多克隆抗體，為探討其在牛慢性病毒感染而引起的持續(xù)性免疫抑制及免疫耐受中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、載體及病毒 大腸埃希菌DH5α、大腸埃希菌 BL21（DE3）菌株及原核載體 pET-28a（+）、CP及NCP 型BVDV 均由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院生物技術(shù)中心動(dòng)物傳染病實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)雌性昆明小鼠 5 只，18 ～ 20 g，7 周齡，購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，許可證號(hào)：SCXK（黑）2019-001。

1.3 主要試劑及儀器 RNA 提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq Master Mix酶、pMD18-T simple vecter 購自日本 TaKaRa 公司；T4 DNA 連接酶、EcoRⅠ和Hind Ⅲ購自美國 Thermo Scientific 公司；膠回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒購自美國Axygen 公司；硫酸卡那霉素（Kan）購自美國Amresco 公司；HRP 標(biāo)記羊抗鼠 IgG、鼠抗 His 單克隆抗體及DAB 顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.4 PD-1 胞外區(qū)目的基因片段的擴(kuò)增 根據(jù)Gen-Bank 上登錄的牛 PD-1 序列（AB_510901.1）設(shè)計(jì)特異性引物，上游引物：5′-CGGAATTCTCCAGCAGGCCCTGGA-3′，下游引物：5′-CGAAGCTTGATGACCAGGCTCTGCATCTGG -3′，擴(kuò)增片段大小為448 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。采集牛外周血，按RNA 提取試劑盒說明書提取牛PBL 的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板，PCR 擴(kuò)增目的片段。反應(yīng)體系：Taq Master Mix 12.5 μL，上下游引物各 0.5 μL，cDNA 模板 1 μL，ddH2O 10.5 μL，混勻。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共 30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，并回收目的片段。

1.5 重組質(zhì)粒pET-28a-PD-1 的構(gòu)建 將回收的PD-1 產(chǎn)物經(jīng) T4 DNA 連接酶與原核載體 pET-28a（+）16 ℃連接過夜，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-PD-1；轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，取陽性克隆，同時(shí)以 pET-28a（+）空載體及感受態(tài)細(xì)胞為對照，接種含 100 μg ／ mL Kan 的 LB 平板上，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng) 12 h；挑選單菌落接種于5 mL LB 液體培養(yǎng)基中（含 100 μg／mL Kan），37 ℃，180 r ／ min 培養(yǎng) 12 h；提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切（EcoRⅠ／ HindⅢ）鑒定，鑒定正確后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，并與GenBank 中牛PD-1 序列比對。

1.6 牛PD-1 胞外區(qū)的生物信息學(xué)分析 采用NCBI、ExPASy 數(shù)據(jù)庫及PHD 分析重組質(zhì)粒pET-28a-PD-1 蛋白結(jié)構(gòu)；利用 Lasergene 7.1 和 MEGA 6.0 進(jìn)行同源性及系統(tǒng)進(jìn)化分析。

1.7 牛PD-1 胞外區(qū)重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單菌落接種至 LB 培養(yǎng)液中（含100 μg／mL Kan），37 ℃，180 r ／ min 培養(yǎng)至 A260為 0.4 ～ 0.6，加入 0、0.2、0.4、0.8 及 1 mmol ／ L IPTG 誘導(dǎo)，收集表達(dá)的菌液，13 201 × g 離心 1 min，沉淀用 200 μL PBS 重懸，超聲破碎后，13 201 × g 離心 1 min，保留上清。沉淀再次用100 μL PBS 重懸，分別取上清及沉淀進(jìn)行12% SDS-PAGE 分析。獲得的牛PD-1 胞外區(qū)重組蛋白簡稱為牛PD-1 蛋白。

1.8 目的蛋白的純化及鑒定 將鑒定正確的重組蛋白按 1 ∶100 比例接種于 LB 培養(yǎng)液（含 100 μg ／mL Kan）中，37 ℃，180 r／min 培養(yǎng)12 h，培養(yǎng)物經(jīng) 4 000 × g離心15 min，用磷酸鹽緩沖液重懸，冰上超聲破碎，2 291 × g 離心20 min，分離沉淀，用包涵體裂解液4 ℃裂解1 h，進(jìn)行12% SDS-PAGE 分析。電泳結(jié)束后用 0.1 mol ／ L KCl 染色 10 min，出現(xiàn)白色條帶后，切下條帶，脫色30 min，放入 Tris-Gly Buffer 的預(yù)處理的透析袋中，水平電泳120 V 2 h，將透析袋放入PBS 中過夜透析，收集上清，進(jìn)行Western blot 鑒定。目的蛋白經(jīng)12% SDS-PAGE 分離，半干法轉(zhuǎn)移至NC膜，轉(zhuǎn)印 30 min；TBST 洗滌 3 次，每次 10 min，5 %脫脂乳室溫封閉NC 膜2 h；TBST 洗滌3 次，每次10 min，加入鼠抗 His 單克隆抗體（1 ∶2 000 稀釋），4 ℃過夜；TBST 洗滌 5 次，每次 10 min，加入羊抗鼠IgG（1 ∶10 000 稀釋），室溫 1.5 h；TBST 洗滌 5 次，每次 10 min，DAB 顯色。

1.9 牛PD-1 多克隆血清抗體的制備 將純化的目的蛋白免疫小鼠3 只（1 ～ 3 號(hào)），背部皮下注射，50 μg／只，用弗氏完全佐劑乳化的抗原免疫1 次，15 d 后，用弗氏不完全佐劑乳化的抗原進(jìn)行3 次加強(qiáng)免疫，每次間隔15 d，末次免疫后10 d 采集小鼠眼球血，制備多克隆抗體。

1.10 多克隆血清抗體效價(jià)及免疫活性檢測 ELISA法檢測血清抗體效價(jià)。將小鼠血清進(jìn)行倍比稀釋作為一抗，1 ∶10 000 稀釋的 HRP 標(biāo)記的羊抗鼠 IgG 為二抗，讀取A450；血清抗體效價(jià)按陰性血清樣品（未免疫小鼠）平均A450的2 倍判定。Western blot 法檢測多抗血清的免疫活性。經(jīng)12% SDS-PAGE 分離目的蛋白，轉(zhuǎn)膜，以1 ∶100 稀釋的抗牛PD-1 多抗血清為一抗，1 ∶10 000 稀釋 HRP 標(biāo)記的羊抗鼠 IgG 為二抗，加DAB 顯色劑顯色，用水終止反應(yīng)。

1.11 多克隆血清抗體阻斷檢測BVDV 病毒拷貝數(shù)按參考文獻(xiàn)［10］的方法繪制BVDV 病毒拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算病毒拷貝數(shù)。將分離的牛 PBL分為 4 組，BVDV CP 組、BVDV NCP 組、BVDV CP + PD-1 多抗組及 BVDV NCP + PD-1 多抗組，每組重復(fù)3 次；體外孵育72 h 后提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用SYBR 染料法檢測病毒的拷貝數(shù)，與標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)進(jìn)行定量PCR，獲得標(biāo)準(zhǔn)方程，計(jì)算各感染組PBL 懸浮液病毒拷貝數(shù)。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用GraphPad Prism 6.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以D 表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因的PCR 鑒定 經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見448 bp 的目的條帶，大小與預(yù)期一致，見圖1。

圖 1 牛PD-1 胞外區(qū)PCR 電泳圖Fig.1 Electrophoretic profile of PCR product of bovine PD-1 extracellular domain gene

2.2 重組質(zhì)粒pET-28a-PD-1 的鑒定 重組質(zhì)粒雙酶切（EcoRⅠ／ HindⅢ）產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見448 bp 的目的基因片段，大小與預(yù)期一致，見圖2。與NCBI-blast 序列比對同源性為100%。

2.3 牛PD-1 胞外區(qū)的生物信息學(xué)分析 牛PD-1胞外區(qū)基因讀碼框編碼147 個(gè)氨基酸，相對分子質(zhì)量為 16 040，等電點(diǎn)為 7.77，蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)是66.29，為一種不穩(wěn)定蛋白，脂溶系數(shù)57.97，總平均親水性-0.619，為一種親水性蛋白，該蛋白是免疫球蛋白（IG）結(jié)構(gòu)域，屬IG 超家族成員。經(jīng)PHD 分析，牛PD-1 胞外區(qū)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是由2.1% α 螺旋、34.97%延伸鏈及62.94%無規(guī)則卷曲構(gòu)成，推測無規(guī)則卷曲是PD-1 胞外區(qū)蛋白的主要結(jié)構(gòu)。

圖 2 pET-28a-PD-1 重組質(zhì)粒的雙酶切（EcoRⅠ／ HindⅢ）鑒定Fig.2 Restriction map of recombinant plasmid pET-28a-PD-1（EcoRⅠ／HindⅢ）

2.4 牛PD-1 胞外區(qū)的序列分析 經(jīng)同源性比對，構(gòu)建的PD-1 胞外區(qū)質(zhì)粒與奶牛和瘤牛PD-1 胞外區(qū)序列同源性均為100%，與牦牛、野生牦牛及水牛的同源性分別為99.3%、98.9%和97.7%，與綿羊及山羊的同源性為93.6%和91.5%，與人及鼠的同源性分別為79%和71%。見圖3 和表1。

圖3 牛PD-1 序列的同源性分析Fig.3 Homology of bovine PD-1 sequence

2.5 表達(dá)產(chǎn)物的鑒定及可溶性分析 經(jīng)12% SDSPAGE 分析，表達(dá)蛋白相對分子質(zhì)量約為19 000，超聲后主要以包涵體形式存在，在37 ℃，0.8 mmol ／ L IPTG 誘導(dǎo)條件下，表達(dá)量最多，見圖4。

圖4 原核表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE 分析Fig.4 SDA-PAGE profile of expressed PD-1 extracellular region

2.6 純化產(chǎn)物的鑒定 經(jīng)12% SDS-PAGE 分析，可見相對分子質(zhì)量約為19 000 的蛋白條帶，大小與預(yù)期一致，見圖5。經(jīng)Western blot 分析，純化的牛PD-1蛋白能與His 標(biāo)簽單抗發(fā)生特異性反應(yīng)，可見相對分子質(zhì)量約19 000 的蛋白條帶，表明該蛋白具有良好的抗原性，見圖6。

2.7 多抗血清效價(jià) 1 ～3 號(hào)小鼠的多抗血清效價(jià)分別為 1 ∶102 400、1 ∶12 800 及 1 ∶204 800。

2.8 多抗血清免疫活性 經(jīng)12% SDS-PAGE 分析，可見相對分子質(zhì)量約為19 000 的特異蛋白條帶，表明多抗血清能與目的蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，具有良好的免疫活性。見圖7。

圖 5 純化牛PD-1 蛋白的 SDS-PAGE 鑒定Fig 5.SDS-PAGE profile of purified bovine PD-1 protein

圖 6 純化牛PD-1 蛋白的Western blot 鑒定Fig 6.Western blotting of purified bovine PD-1 protein

圖7 牛PD-1 蛋白多抗血清的Western blot 鑒定Fig 7.Western blotting of recombinant PD-1 protein with polyclonal antibody

2.9 BVDV 病毒拷貝數(shù) PBL 懸浮液中BVDV CP+PD-1 多抗組及BVDV NCP + PD-1 多抗組與BVDV CP 組及BVDV NCP 組相比，拷貝數(shù)顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 3.413，P ＜ 0.05；t = 3.001，P ＜0.01）。見圖9。表明PD-1 阻斷導(dǎo)致感染BVDV 的PBL 懸浮液病毒量顯著降低。

圖 8 CP 型 BVDV（A）及 NCP 型 BVDV（B）病毒拷貝數(shù)Fig 8.Copy numbers of BVDV of types CP（A）and NCP（B）

3 討 論

PD-1 為CD28 超家族的一員，通過消減雜交從凋亡誘導(dǎo)的T 細(xì)胞雜交瘤2B4.11 中分離。牛PD-1為282 個(gè)氨基酸的Ⅰ型膜蛋白，其對應(yīng)于殘基27 至171 的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（含免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域），隨后是跨膜區(qū)域及細(xì)胞內(nèi)尾巴［11］，牛PD-L1 是289 個(gè)氨基酸的Ⅰ型跨膜蛋白，細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域?yàn)闅埢?3 至224，主要在活化的免疫細(xì)胞中表達(dá)［12］，因此，本實(shí)驗(yàn)采集牛外周血，分離牛PBL，采用RT-PCR 法擴(kuò)增牛PD-1 的胞外區(qū)基因序列，其片段大小為448 bp，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)牛PD-1 胞外區(qū)基因編碼147 個(gè)氨基酸，相對分子質(zhì)量為16 040，等電點(diǎn)為7.77，為一種親水性蛋白，屬Ig 超家族成員。

有研究顯示，當(dāng)病毒感染機(jī)體后，多種免疫細(xì)胞分泌效應(yīng)性細(xì)胞因子，誘導(dǎo)PD-1、PD-L1 高效表達(dá)［13］。史繼靜等［14］利用原核表達(dá)體系成功表達(dá)了人的PD-1 胞外蛋白，制備的多克隆抗體能檢測自然狀態(tài)下人PD-1 蛋白。有研究發(fā)現(xiàn)，重組的PD-1 融合蛋白可刺激T 細(xì)胞的增殖［15］。為表達(dá)牛PD-1 胞外區(qū)蛋白在免疫調(diào)節(jié)中的作用，本文構(gòu)建了牛PD-1 胞外區(qū)的原核表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)牛PD-1 蛋白。通過MEGE 6.0 和Lasergene 7.1 進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)與奶牛和瘤牛PD-1 胞外區(qū)序列同源性達(dá)100%，與牦牛、野生牦牛及水牛的同源性為99.3%、98.9%和97.7%，與綿羊及山羊的同源性為93.6%和91.5%。與人及鼠的序列同源性分別為79%和71%。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21 中，獲得了相對分子質(zhì)量約19 000的重組蛋白，與抗His 標(biāo)簽單抗產(chǎn)生特異性反應(yīng)，具有良好的抗原性。

研究表明，HIV、HBV、LCMV、BLV、CSFV 等病毒能誘導(dǎo)活化的T 細(xì)胞表面PD-1、PD-L1 表達(dá)上調(diào)，且持續(xù)高表達(dá)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，利用PD-1 單克隆抗體阻斷 PD-1 ／ PD-L1 通路可使 T 細(xì)胞功能恢復(fù)［16］。為研究PD-1／PD-L1 通路在牛慢性病毒感染過程中的作用，本文使用純化后具有良好的免疫原性的PD-1胞外區(qū)重組蛋白免疫小鼠，眼球采血制備多抗血清，其抗體效價(jià)最高達(dá)1 ∶204 800，且能與目的蛋白發(fā)生反應(yīng)，表明獲取的PD-1 胞外區(qū)多抗血清具有較好的免疫活性。在犬、牛等免疫抑制性疾病的抗PD-1 單克隆抗體阻斷試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，阻斷后病毒載量下降［9，17-18］。本實(shí)驗(yàn)使用多抗血清阻斷體外感染BVDV 的PBL細(xì)胞，病毒加入抗體組的病毒載量顯著下降，表明該多抗血清可抑制病毒復(fù)制。

在獸醫(yī)領(lǐng)域中，阻斷PD-1 ／ PD-L1 途徑在衰竭的T 細(xì)胞與T 細(xì)胞分化及表型研究中起重要作用，成為研究抗病毒感染的新靶標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)成功制備了原核表達(dá)的純化牛PD-1 蛋白及其多抗血清，為開發(fā)具有調(diào)節(jié)及治療慢性病毒感染的制品奠定了基礎(chǔ)。