胡鑫麗，張文慧，王瑞君，王博文，陳星旭，宋維芳

山西醫(yī)科大學(xué)汾陽(yáng)學(xué)院，山西汾陽(yáng)032200

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fattyliver disease，NAFLD）已成為世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的慢性肝臟疾病，且正迅速成為終末期肝病及肝移植的主要原因［1-2］。非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）是一種嚴(yán)重 NAFLD 的進(jìn)展形式［2］，以肝細(xì)胞脂肪變性、肝細(xì)胞損傷、不同程度的肝臟炎癥及纖維化為特征［3］，其病死率高，若不干預(yù)治療，將不可逆地進(jìn)一步發(fā)展為肝纖維化、肝硬化甚至肝癌［4］，因此，控制NASH 的發(fā)生發(fā)展逐漸引起臨床治療的重視。目前導(dǎo)致進(jìn)行性NASH 發(fā)生發(fā)展的因素尚不清楚，臨床發(fā)現(xiàn)NASH 患者肝臟中的膽固醇含量明顯升高［5］，另外，有研究表明，過(guò)量的膳食膽固醇升高會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)性NASH 的發(fā)生［6-7］，表明膽固醇穩(wěn)態(tài)的改變及肝內(nèi)膽固醇的積累在NASH 發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用［8］。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-2（sterol regulatory elementbinding protein 2，SREBP-2）是膽固醇穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)因子，其活性形式n-SREBP-2 直接調(diào)控的下游基因分別為3-羥基 3-甲基戊二酰輔酶 A 還原酶（3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA reductase，HMGCR）和低密度脂蛋白受體（low-density lipoproteins receptor，LDLR），其中，HMGCR 是肝臟內(nèi)源性膽固醇合成的限速酶［9］，LDLR 主要負(fù)責(zé)將載脂蛋白低密度脂蛋白（lowdensity lipoproteins，LDL）結(jié)合的外源膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)［10］。研究表明，NALFD 與 SREBP-2 成熟及HMGCR 增加有關(guān)［11-12］。但動(dòng)態(tài)觀察高膽固醇攝食破壞肝臟膽固醇代謝穩(wěn)態(tài)并促使NASH 發(fā)生發(fā)展的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究通過(guò)建立高脂高膽固醇誘導(dǎo)的NASH模型，在動(dòng)物水平及細(xì)胞水平探討膽固醇在高脂高膽固醇誘導(dǎo)NASH 發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的動(dòng)態(tài)作用，為NASH 的防治提供思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD 大鼠100 只，雄性，體重180 ～200 g，6 周齡，購(gòu)自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK（晉）2015-0001。

1.2 細(xì)胞 人肝臟正常細(xì)胞HL-7702 系由清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)系統(tǒng)生物學(xué)研究中心惠贈(zèng)。

1.3 主要試劑 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）及天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）活性測(cè)定試劑盒、總膽固醇（total cholesterol，TC）及甘油三酯（triglyceride，TG）含量測(cè)定試劑盒均購(gòu)自蘇州科銘生物技術(shù)有限公司；Masson 三色染色液試劑盒及油紅O 染色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；兔抗鼠SREBP-2 及HMGCR 多克隆抗體購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司；兔抗鼠LDLR 多克隆抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；兔抗鼠GAPDH 多克隆抗體購(gòu)自上海斯信生物科技有限公司；胎牛血清（FBS）、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG 及RPMI1640 培養(yǎng)基均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；油酸（oleic acid，OA）購(gòu)自上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；LDL-膽固醇（LDLC）購(gòu)自北京協(xié)生生物科技有限責(zé)任公司。

1.4 動(dòng)物試驗(yàn) 100 只SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為 5 組：CON 組（正常飲食）、HFC0 組（20%脂肪）、HFC1 組（20%脂肪 + 1%膽固醇）、HFC2 組（20%脂肪+ 2%膽固醇）和HFC5 組（20%脂肪+ 5%膽固醇），每組 20 只。于飼喂第 4、6、8、12 周末，各組分別處理5 只大鼠。大鼠禁食24 h，自由飲水，麻醉后暴露腹腔經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，常溫4 000 × g 離心10 min，分離血漿，檢測(cè)血漿中ALT 及AST 含量；剖解取出肝臟沖洗干凈，取肝右葉相同部位組織，用4%多聚甲醛溶液固定，制備切片，HE 及Masson 染色，觀察肝臟組織病理情況；檢測(cè)肝臟組織中TC、TG含量；提取肝臟組織蛋白，進(jìn)行Western blot 檢測(cè)。剩余肝臟組織經(jīng)液氮速凍后，-80 ℃保存。

1.5 細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL-7702 細(xì)胞接種至6 孔板，隨機(jī)分為3 組：對(duì)照組（含10% FBS RPMI1640 培養(yǎng)基）、OA 組（添加 200 μmol ／ L OA 的含 10% FBS RPMI1640 培養(yǎng)基）、OA + LDL-C 組（添加 200 μmol ／ L OA 及 50 μg ／ mL LDL-C 的含 10%FBS RPMI1640 培養(yǎng)基）。同時(shí)再設(shè)3 個(gè)平行對(duì)照組，在細(xì)胞培養(yǎng)5 d 后，檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT 及AST 含量；第1 平行對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)行油紅O 染色，觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴堆積的位置、形態(tài)及大?。坏? 平行對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)行菲律賓菌素染色，觀察細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇的分布及含量；第3 平行對(duì)照組細(xì)胞用RIPA裂解法提取蛋白，進(jìn)行Western blot 檢測(cè)；第4 平行對(duì)照組檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)TC、TG 含量。

1.6 各項(xiàng)檢測(cè)

1.6.1 ALT、AST、TC、TG檢測(cè) 均按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.6.2 HE 及 Masson 染色 HE 染色：切片常規(guī)脫蠟至水后，蘇木素染液染色3 ～5 min；自來(lái)水沖洗1 ～2 min；1%鹽酸酒精溶液分化數(shù)秒，自來(lái)水沖洗回藍(lán)5 ～ 10 min；切片入伊紅溶液 10 ～ 30 s；再經(jīng) 95%乙醇Ⅰ、Ⅱ中各調(diào)色約10 s；將切片放入無(wú)水乙醇Ⅰ、Ⅱ中各脫水1 ～2 min；二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各透明1 ～2 min；中性樹(shù)膠封片，鏡檢。Masson 染色：切片常規(guī)脫蠟至水后，按Masson 三色染色液試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行切片染色，封片后顯微鏡下觀察。

1.6.3 油紅O 及菲律賓菌素染色 細(xì)胞誘導(dǎo)5 d 后棄去培養(yǎng)基，PBS 洗滌，用4%多聚甲醛固定30 min；棄去固定液，PBS 洗滌，油紅O 染液染色20 min；60%異丙醇漂洗除去多余染料，蘇木素染液復(fù)染1 min；自來(lái)水沖洗至變藍(lán)，加入PBS，顯微鏡下觀察。同理，細(xì)胞棄去固定液，經(jīng)PBS 洗滌后，用1.5 mg／mL 甘氨酸室溫培養(yǎng)10 min；PBS 洗滌3 次，避光條件下菲律賓染液染色2 h；加入PBS，熒光顯微鏡下觀察。

1.6.4 Western blot 蛋白經(jīng)8% ～10% SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)膜2 h；加入5%脫脂牛奶，室溫封閉2 h；分別加入 SREBP-2 抗體（1 ∶1 000 稀釋?zhuān)?、HMGCR 抗體（1 ∶1 000 稀釋?zhuān)DLR 抗體（1 ∶1 000 稀釋?zhuān)┘癎APDH 抗體（1 ∶5 000 稀釋?zhuān)? ℃孵育過(guò)夜；TBST洗滌 3 次，加入 HRP 標(biāo)記的羊抗兔 IgG（1 ∶5 000 稀釋?zhuān)?，室溫孵?2 h；TBST 洗膜 3 次，采用化學(xué)發(fā)光法顯影，ImageLab 分析條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩獨(dú)立樣本比較采用t 檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 動(dòng)物試驗(yàn)

2.1.1 血漿中 ALT、AST 及肝臟組織中 TC、TG 的含量結(jié)果顯示，飼喂 12 周后，與 CON 組比較，HFC0 組、HFC1組、HFC2 組及HFC5 組血漿中ALT 含量均顯著升高（t 分別為 -12.892、-17.712、-23.038 和 -48.790，P均 ＜ 0.01），AST 含量均顯著升高（t 分別為-5.391、-6.407、-6.702 和-9.905，P 均 ＜ 0.01）。與 CON 組比較，HFC1 組、HFC2 組和 HFC5 組肝臟組織中 TC 含量均顯著升高（t 分別為 -39.450、-19.232 和 -98.024，P 均 ＜ 0.05），HFC0 組、HFC1 組、HFC2 組、HFC5 組肝臟組織中TG 含量均顯著升高（t 分別為-4.732、-4.498、-15.780 和-16.909，P 均 ＜ 0.05）。見(jiàn)表 1。

2.1.2 肝臟組織病理學(xué)觀察 12 周末，HE 染色觀察顯示，CON 組肝細(xì)胞形態(tài)正常，胞質(zhì)均勻，肝小葉結(jié)構(gòu)規(guī)則，HFC0 組、HFC1 組表現(xiàn)為散在的肝細(xì)胞漿內(nèi)脂滴空泡的形成，HFC2 組及HFC5 組以大脂滴為主的脂肪變性肝細(xì)胞和氣球樣變性肝細(xì)胞增多，肝細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)疏松化；Masson 染色觀察顯示，HFC2 組肝細(xì)胞周?chē)猩⒃诜植嫉募?xì)絲狀淡藍(lán)色纖維出現(xiàn)，HFC5 組可見(jiàn)分布較廣、較粗的藍(lán)色膠原纖維沉積。見(jiàn)圖1。

2.1.3 Western blot 分析 4 周末，與 CON 組比較，HFC2 組及HFC5 組LDLR 蛋白表達(dá)水平均顯著升高（t 分別為-3.748 和-4.001，P 均 ＜ 0.05）。6 周末，與 CON 組比較，HFC1 組、HFC2 組、HFC5 組LDLR蛋白表達(dá)水平均顯著升高（t 分別為-7.617、-5.575和 -5.390，P 均 ＜ 0.05）；與 HFC0 組比較，HFC1組、HFC2 組、HFC5 組均顯著升高（t 分別為-9.247、-7.530和-7.689，P 均 ＜ 0.05）。8 周末，與 CON 組比較，HFC1 組、HFC2 組、HFC5 組 LDLR 蛋白表達(dá)水平均顯著升高（t 分別為-3.529、-4.916 和-3.950，P 均 ＜0.05）；與 HFC0 組比較，HFC1 組、HFC2 組、HFC5組均顯著升高（t 分別為-3.711、-5.306 和-4.222，P 均 ＜ 0.05）。12 周末，HFC5 組較 CON 組 LDLR蛋白表達(dá)水平均顯著降低（t=8.065，P ＜ 0.05）。4、6及8 周末，所有高脂組與CON 組比較n-SREBP-2 蛋白表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t 為0.043 ～1.532，P 均 ＞ 0.05）。12 周末，與 CON 組比較，HFC0 組、HFC2 組及HFC5 組n-SREBP-2 蛋白表達(dá)水平均顯著升高（t 分別為 -7.288、-4.120 和 -5.550；P 均 ＜0.05）；與 HFC0 組比較，HFC1 組、HFC2 組及 HFC5組均顯著降低（t 分別為 7.446、3.422 和 2.912，P均 ＜ 0.05）。4、6 及 12 周末，所有高脂組與 CON 組比較，HMGCR 蛋白表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t為-4.919 ～ 9.192，P 均 ＞ 0.05）。8 周末，HFC5組較CON 組HMGCR 蛋白表達(dá)水平顯著降低（t =21.079，P ＜ 0.05）。見(jiàn)圖 2 ～ 9。

2.2 細(xì)胞試驗(yàn)

2.2.1 培養(yǎng)液中 ALT、AST 及細(xì)胞內(nèi) TC、TG 的含量 結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，OA 組及OA+LDL-C 組細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT 含量顯著升高（t 分別為-6.675和-3.834，P 均 ＜ 0.05），OA + LDL-C 組 AST 含量顯著升高（t = -2.663，P ＜ 0.05），見(jiàn)圖 10。與對(duì)照組及OA 組比較，OA + LDL-C 組細(xì)胞內(nèi)TC 含量顯著升高（t 分別為-135.682 和-201.249，P 均 ＜ 0.01）；各組細(xì)胞中TG 含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t 均為-0.06，P 均 ＞ 0.05），見(jiàn)圖 11。

表 1 12 周末各組大鼠血漿中 ALT、AST 及肝臟組織中 TC、TG 的含量（，n = 5）Tab.1 Contents of ALT and AST in plasma and TC and TG in liver of rats in various groups at the end of week 12 after feeding（，n = 5）

表 1 12 周末各組大鼠血漿中 ALT、AST 及肝臟組織中 TC、TG 的含量（，n = 5）Tab.1 Contents of ALT and AST in plasma and TC and TG in liver of rats in various groups at the end of week 12 after feeding（，n = 5）

注：與 CON 組比較，a 表示 P ＜ 0.05；aa 表示 P ＜ 0.01。

ALT［nmol ／（min·mL）］AST［nmol ／（min·mL）］TC（mg ／ g） TG（mg ／ g）162.90 ± 1.56 51.52 ± 0.84 7.83 ± 0.03 31.14 ± 1.16 HFC0 186.21 ± 0.91aa 56.29 ± 0.66aa 9.55 ± 0.74 45.10 ± 2.51a HFC1 200.60 ± 1.45aa 56.32 ± 0.34aa 14.14 ± 0.16aa 45.41 ± 2.97a HFC2 252.10 ± 3.41aa 57.68 ± 0.66aa 19.32 ± 0.61aa 49.58 ± 1.00aa HFC5 274.80 ± 1.68aa 60.81 ± 0.61aa 21.90 ± 0.14aa 46.76 ± 0.75aa

圖1 12 周末各組大鼠肝臟組織病理學(xué)顯微鏡觀察Fig.1 Microscopy of histopathology of livers of rats in various groups at the end of week 12 after feeding

圖2 4 周末各組大鼠肝臟組織中LDLR、n-SREBP-2 及HMGCR 蛋白表達(dá)水平的Western blot 檢測(cè)Fig.2 Determination of expression levels of LDLR，n-SREBP-2 and HMGCR in liver of rats in various groups at the end of week 4 by Western blot

圖3 4 周末各組大鼠肝臟組織中LDLR（A）、n-SREBP-2（B）及HMGCR（C）蛋白的表達(dá)水平Fig.3 LDLR（A），n-SREBP-2（B）and HMGCR（C）levels in livers of rats in various groups at the end of week 4 after feeding

圖4 6 周末各組大鼠肝臟組織中LDLR、n-SREBP-2 及HMGCR 蛋白表達(dá)水平的Western blot 檢測(cè)Fig.4 Determination of expression levels of LDLR，n-SREBP-2 and HMGCR in livers of rats in various groups at the end of week 6 after feeding by Western blot

圖5 6 周末各組大鼠肝臟組織中LDLR（A）、n-SREBP-2（B）及HMGCR（C）蛋白的表達(dá)水平Fig.5 LDLR（A），n-SREBP-2（B）and HMGCR（C）levels in livers of rats in various groups at the end of week 6 after feeding

圖6 8 周末各組大鼠肝臟組織中LDLR、n-SREBP-2 及HMGCR 蛋白表達(dá)水平的Western blot 檢測(cè)Fig.6 Determination of expression levels of LDLR，n-SREBP-2 and HMGCR in livers of rats in various groups at the end of week 8 after feeding by Western blot

圖7 8 周末各組大鼠肝臟組織中LDLR（A）、n-SREBP-2（B）及 HMGCR（C）蛋白的表達(dá)水平Fig.7 LDLR（A），n-SREBP-2（B）and HMGCR（C）levels in livers of rats in various groups at the end of week 8 after feeding

圖8 12 周末各組大鼠肝臟組織中LDLR、n-SREBP-2 及HMGCR 蛋白表達(dá)水平的Western blot 檢測(cè)Fig.8 Determination of expression levels of LDLR，n-SREBP-2 and HMGCR in livers of rats in various groups at the end of week 12 after feeding by Western blot

圖9 12 周末各組大鼠肝臟組織中LDLR（A）、n-SREBP-2（B）及 HMGCR（C）蛋白的表達(dá)水平Fig.9 LDLR（A），n-SREBP-2（B）and HMGCR（C）levels in livers of rats in various groups at the end of week 12 after feeding

圖 10 各組細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT（A）及AST（B）的含量Fig.10 ALT（A）and AST（B）contents in media of various groups

圖 11 各組 HL-7702 細(xì)胞中 TC（A）及 TG（B）的含量Fig.11 TC（A）and TG（B）contents in HL-7702 cells of various groups

2.2.2 油紅O 染色 OA + LDL-C 組較對(duì)照組及OA 組富含脂滴的HL-7702 細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞內(nèi)脂滴增大，見(jiàn)圖12。

圖 12 油紅O 染色的對(duì)照組（A）、OA 組（B）及 OA+LDL-C組（C）HL-7702 細(xì)胞內(nèi)脂滴的顯微鏡觀察（× 400）Fig.12 Microscopy of lipid contents in HL-7702 cells in CON（A），OA（B）and OA + LDL-C（C）groups with oil red staining（× 400）

2.2.3 菲律賓菌素染色 OA + LDL-C 組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)散在分布的熒光亮點(diǎn)較對(duì)照組及OA 組顯著增加，見(jiàn)圖13。

圖 13 菲律賓菌素染色的對(duì)照組（A）、OA 組（B）及 OA +LDL-C 組（C）HL-7702 細(xì)胞內(nèi)膽固醇的熒光顯微鏡觀察（× 400）Fig.13 Fluorescent microscopy of cholesterol contents in HL-7702 cells in CON（A），OA（B）and OA+LDL-C（C）groups with Filipin staining（× 400）

2.2.4 Western blot 分析 結(jié)果顯示，OA + LDL-C組較對(duì)照組及OA 組n-SREBP-2 蛋白表達(dá)水平均顯著升高（t 分別為-11.307 和-6.420，P 均 ＜ 0.05）；OA + LDL-C 組較對(duì)照組及OA 組HMGCR 蛋白表達(dá)水平均顯著升高（t 分別為-2.649 和-3.074，P均 ＜0.05）。見(jiàn)圖14 和圖15。與對(duì)照組比較，OA組及OA + LDL-C 組LDLR 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（t 分別為 12.319 和 18.797，P 均 ＜ 0.05），見(jiàn)圖 16 和圖 17。

圖 14 各組 HL-7702 細(xì)胞內(nèi) n-SREBP-2、HMGCR 蛋白表達(dá)水平的Western blot 檢測(cè)Fig.14 Western blotting of expression levels of n-SREBP-2 and HMGCR in HL-7702 cells of various groups

圖 15 各組 HL-7702 細(xì)胞內(nèi) n-SREBP-2（A）及 HMGCR（B）蛋白的表達(dá)水平Fig.15 Expression levels of n-SREBP-2（A）and HMGCR（B）in HL-7702 cells of various groups

圖 16 各組HL-7702 細(xì)胞內(nèi) LDLR 蛋白表達(dá)水平的Western blot 檢測(cè)Fig.16 Western blotting of expression level of LDLR in HL-7702 cells of various groups

圖17 各組HL-7702 細(xì)胞內(nèi)LDLR 蛋白的表達(dá)水平Fig.17 Expression levels of LDLR in HL-7702 cells of various groups

3 討 論

NAFLD 是全球常見(jiàn)的慢性代謝性臨床綜合征，為肝硬化及肝癌等終末期肝病的重要病因，且還顯著增加2 型糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化及結(jié)直腸腫瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，成為日益嚴(yán)峻的公共健康問(wèn)題［13］。目前，我國(guó)NAFLD 患者占全國(guó)各類(lèi)肝病患者的49.3%，NAFLD 已超過(guò)慢性乙型肝炎成為第一大肝病。NALFD 疾病譜分為單純性脂肪肝（Nonalcoholic simple fatty liver，NASFL）、NASH、脂肪性肝纖維化及肝硬化等［14］。NASFL 進(jìn)展緩慢，而 NASH 可進(jìn)展為肝硬化甚至肝癌、導(dǎo)致2 型糖尿病及心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)顯著增大［15-16］。

研究發(fā)現(xiàn)，膽固醇代謝與NASH 發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［17］。在NASH 進(jìn)展中，膽固醇在肝細(xì)胞內(nèi)的堆積較TG 更具有細(xì)胞毒性［18-19］，使用他汀類(lèi)藥物能有效改善肝脂肪變性、炎癥及纖維化［20］。2019 版《歐洲血脂管理指南》明確指出“壞膽固醇”即LDL-C 越低越好，并將其絕對(duì)值降至 ＜ 1.4 mmol ／ L（＜55 mg ／dL）［2018 版 ＜ 1.8 mmol／L（＜ 70 mg ／dL）］［21］。MALHOTRA 等［6］發(fā)現(xiàn)，腸道 SREBP-2 的過(guò)度激活能促進(jìn)飲食誘導(dǎo)NASH 的發(fā)生；MIN 等［12］發(fā)現(xiàn)，NASH 患者體內(nèi) SREBP-2 成熟，HMGCR 表達(dá)增加，LDLR 表達(dá)減少。本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了高脂高膽固醇飲食較單一高脂飲食更能成功誘導(dǎo)動(dòng)物及細(xì)胞NASH 的發(fā)生，進(jìn)一步證實(shí)膽固醇是NASH 發(fā)生發(fā)展的危險(xiǎn)因素。在膽固醇誘導(dǎo)NASH 發(fā)生發(fā)展的動(dòng)態(tài)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，高脂高膽固醇組的LDLR 蛋白表達(dá)水平先升高后降低，表明膽固醇早期能誘導(dǎo)肝臟高表達(dá)LDLR來(lái)處理和平衡血液中升高的膽固醇水平，但當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的膽固醇含量升高至一定程度后抑制LDLR 的表達(dá)，這可能與膽固醇攝入過(guò)多引起的細(xì)胞膜破壞有關(guān)，也可能與LDLR 在溶酶體中破壞增多導(dǎo)致其向細(xì)胞膜的循環(huán)利用減少有關(guān)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。模型早期所有高脂組較CON 組n-SREBP-2蛋白表達(dá)水平一直處于較低水平，是由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過(guò)量的膽固醇堆積抑制了固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白裂解激活蛋白（SCAP-SREBP-2）復(fù)合物與包被蛋白2 的結(jié)合及轉(zhuǎn)運(yùn)，從而抑制了SREBP-2 的水解激活［22］；第 8 周末，HFC5 組較 CON 組 HMGCR 的蛋白表達(dá)水平降低（P ＜0.05），這表明外源性膽固醇攝入過(guò)多抑制HMGCR 調(diào)控的內(nèi)源性膽固醇的合成；造模后期，HFC0、HFC2、HFC5 組較 CON 組 n-SREBP-2 蛋白表達(dá)量均增加（P 均＜0.05），在細(xì)胞水平也發(fā)現(xiàn)，OA + LDL-C 組較對(duì)照組、OA 組 n-SREBP-2、HMGCR蛋白表達(dá)水平顯著升高（P ＜0.05），表明在NASH發(fā)生發(fā)展后期，n-SREBP-2、HMGCR 介導(dǎo)的內(nèi)源性膽固醇合成增多并參與了NASH 的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，飲食中的膽固醇能誘導(dǎo)肝臟高表達(dá)低密度脂蛋白受體從而進(jìn)入肝細(xì)胞內(nèi)，肝細(xì)胞內(nèi)外源性膽固醇的堆積在早期也會(huì)對(duì)自身內(nèi)源性膽固醇的合成起抑制作用，肝臟的這種自我調(diào)節(jié)機(jī)制在高脂高膽固醇飲食的早期能維持肝內(nèi)膽固醇濃度的動(dòng)態(tài)平衡，從而保護(hù)肝臟膽固醇穩(wěn)態(tài)不受破壞；隨著肝內(nèi)膽固醇含量的進(jìn)一步增加，肝細(xì)胞LDLR 表達(dá)減少，此時(shí)由LDLR 介導(dǎo)的膽固醇攝入減少使肝內(nèi)膽固醇相對(duì)不足，這將作為一個(gè)肝內(nèi)膽固醇含量降低的信號(hào)，反饋性調(diào)節(jié)n-SREBP-2 及HMGCR表達(dá)升高，從而打破肝臟膽固醇代謝穩(wěn)態(tài)，加劇了NASH 的發(fā)生發(fā)展。