高亞杰，張建林，張?zhí)O，王振東，李佰一，張曉敏，王文卓，牛勃，2

1.山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山西太原030001；2.首都兒科研究所兒童發(fā)育營(yíng)養(yǎng)組學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100020

神經(jīng)管畸形（neural tube defect，NTD）是一種常見的嚴(yán)重中樞神經(jīng)系統(tǒng)先天性畸形，包括腦膜（腦）膨出、無(wú)腦、脊柱裂、顱脊柱裂等多種不同的臨床類型，該病在中國(guó)北方發(fā)病率較高，可達(dá)12‰［1］。NTD 的病因較復(fù)雜，包括遺傳因素、生活方式和環(huán)境因素［2-4］。同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）為人體必需氨基酸甲硫氨酸的中間代謝物，是一種含硫氨基酸，主要經(jīng)兩條途徑進(jìn)行代謝，一是經(jīng)甲硫氨酸循環(huán)進(jìn)行再甲基化：在蛋氨酸合酶作用下，Hcy 接受5-甲基四氫葉酸提供的甲基，以VB12為輔酶重新合成甲硫氨酸；二是轉(zhuǎn)硫化途徑：在胱硫醚-β-合成酶（cysta-thionine-βsynthase，CBS）的催化下，Hcy 與絲氨酸縮合成胱硫醚，該過(guò)程以VB6作為輔酶。Hcy 的兩條代謝途徑互相協(xié)調(diào)制約，其中涉及的酶與輔酶活性下降均會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)Hcy 水平異常。有報(bào)道表明，NTD 患兒的母親血漿Hcy 水平明顯升高，還有部分NTD 患兒羊水中的Hcy 含量比正常胎兒高［5］，高Hcy 血癥與NTD的發(fā)生密切相關(guān)，孕期母體Hcy 水平的升高會(huì)干擾胎兒神經(jīng)管的閉合［5-7］，但關(guān)于Hcy 導(dǎo)致NTD 的具體機(jī)制尚未明確。

目前，已建立了 Hcy 致 NTD 的雞胚模型［8-9］，大多數(shù)相關(guān)研究均是在該基礎(chǔ)上進(jìn)行的。小鼠作為哺乳動(dòng)物，其胚胎發(fā)育較雞胚更接近人類胎兒發(fā)育模式，且遺傳學(xué)背景清楚。有研究證明，高熱［10］、高血糖［11］、環(huán)磷酰胺［12］或甲氨蝶呤［13］可誘導(dǎo) NTD 動(dòng)物模型神經(jīng)細(xì)胞的無(wú)序增殖和凋亡。因此，在神經(jīng)管的形成過(guò)程中，細(xì)胞的增殖和凋亡必須保持動(dòng)態(tài)平衡，維持神經(jīng)上皮的適當(dāng)增殖對(duì)神經(jīng)管的閉合至關(guān)重要。由于Hcy 易氧化分解，因此本研究用同型半胱氨酸硫代內(nèi)酯（homocysteine thiolactone，HTL）代替Hcy，以單獨(dú)使用HTL 及聯(lián)合CBS 抑制劑氨基氧乙酸（aminooxyacetic acid，AOAA）兩種方法進(jìn)行 NTD 小鼠建模，選擇最優(yōu)方案進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，并探討NTD形成的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 HTL 購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；羧甲氧基胺半鹽酸鹽及二硫蘇糖醇購(gòu)自中國(guó)Aladdin 公司；小鼠S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）ELISA 試劑盒及小鼠 S-腺苷同型半胱氨酸（S-adenosylhomocysteine，SAH）ELISA 試劑盒購(gòu)自上海通蔚生物科技有限公司；小鼠Hcy ELISA 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中國(guó)Yad 公司；5-乙炔基-2′-脫氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2′-deoxyuridine，EdU）及 YF?555 Click-iT EdU Stain Kits 購(gòu)自中國(guó) US Everbright?Inc.；兔抗小鼠增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）多克隆抗體、兔抗 β-tubulin 多克隆抗體及HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 購(gòu)自武漢三鷹生物科技有限公司；RIPA 裂解液購(gòu)自上海雅酶生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí) C57BL ／ 6J 小鼠，7 ～ 8 周齡，體重20 ～23 g，購(gòu)自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)為：SCXK（晉）2015-0001。

1.3 動(dòng)物模型的建立 將 C57BL ／ 6J 小鼠置 22 ℃，12 h 光照 ／ d 適應(yīng)性飼養(yǎng) 1 周。雌雄小鼠按 1 ∶1 比例合籠過(guò)夜；次日早8 點(diǎn)檢查雌鼠陰栓，有陰栓者確定為孕0.5 d，將孕鼠隨機(jī)分為8 組，每組8 只。將HTL 與AOAA 分別溶解于生理鹽水，HTL 組的給藥劑量分別為 100、300、500、700 mg ／（kg·d），HTL +AOAA 組 HTL 劑量分別為 400、500、600 mg ／（kg·d），AOAA 劑量為 30 mg ／（kg·d），同時(shí)設(shè)正常對(duì)照組（等量生理鹽水）。給藥途徑均經(jīng)腹腔注射，于孕6.5 ～10.5 d 連續(xù)給藥，每日1 次。于孕11.5 d 脫頸處死小鼠，取胚胎，測(cè)量頂臂長(zhǎng)度、稱重，并觀察胚胎發(fā)育情況。選擇單獨(dú)及聯(lián)合給藥建模的最佳劑量組，分別進(jìn)行3 次重復(fù)試驗(yàn)，以驗(yàn)證NTD 發(fā)生率的穩(wěn)定性。發(fā)育遲緩定義為整個(gè)胚胎體重、頂臀長(zhǎng)度顯著降低或形態(tài)特征顯著落后。4%多聚甲醛固定胚胎標(biāo)本用于腦部連續(xù)切片，切片HE 染色觀察神經(jīng)管。采用最佳劑量建立的孕鼠模型（55 只）進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)（NTD 組）。

1.4 代謝物含量的檢測(cè) 于末次給藥后0、2、4、8、12、24 h 收集NTD 組及正常對(duì)照組孕鼠的血液和胚胎腦組織樣本（不同時(shí)間點(diǎn)每組取8 只孕鼠，每只孕鼠取3 個(gè)胚胎腦組織，混為1 個(gè)樣本）。血液于室溫放置 20 min，4 ℃，200 × g 離心 10 min，取上清 20 μL，與 20 μL 的 10 mmol ／ L 二硫蘇糖醇溶液混勻，37 ℃溫育30 min；采用小鼠Hcy ELISA 試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。胚胎腦組織在勻漿緩沖液中進(jìn)行超聲粉碎，4 ℃，17 530×g 離心5 min，取上清，采用小鼠SAM 及SAH ELISA 試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 胚胎神經(jīng)上皮細(xì)胞增殖的檢測(cè) 于末次給藥后11 h，取 NTD 組及正常對(duì)照組孕鼠各3 只，經(jīng)腹腔注射 EdU，5 mg ／ kg。注射 13 h 后脫頸處死，每只孕鼠取1 個(gè)胚胎，用4%多聚甲醛固定，腦部連續(xù)切片，每個(gè)胚胎隨機(jī)選擇3 張切片，采用YF?555 ClickiT EdU Stain Kits 進(jìn)行EdU 熒光增殖檢測(cè)。每張切片隨機(jī)選取6 個(gè)相同大小的視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞的平均數(shù)。

1.6 胚胎增殖相關(guān)蛋白表達(dá)水平的檢測(cè) 采用Western blot 法。于末次給藥后24 h，取NTD 組及正常對(duì)照組各4 只，每只孕鼠取其5 個(gè)胚胎腦組織，混合作為1 個(gè)樣本。用RIPA 裂解液提取總蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度。經(jīng)10% SDS-PAGE 分離蛋白后，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，用5%BSA 室溫封閉1 h；加入兔抗小鼠PCNA 多克隆抗體（1 ∶8 000 稀釋）及兔抗β-tubulin多克隆抗體（1 ∶1 000 稀釋），4 ℃孵育過(guò)夜；TBST 洗滌 3 次，加入 HRP 標(biāo)記的山羊抗兔 IgG（1 ∶5 000 稀釋），室溫孵育 2 h；TBST 洗滌 3 次，ECL 顯色。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，建模中最佳劑量重復(fù)試驗(yàn)及EdU、Western blot 結(jié)果的比較均采用 t 檢驗(yàn)，Hcy、SAM、SAH 含量的組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），均以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 動(dòng)物模型的建立 對(duì)照組胚胎表型正常，HTL 組與HTL+AOAA 組隨著劑量的升高，吸收胎與發(fā)育遲緩胚胎的比例均增高。HTL 組劑量達(dá) 500 mg ／（kg·d）時(shí)，NTD 胚胎比例達(dá)最高（28.3%），且該劑量的吸收胎比例相對(duì)較低，因此500 mg ／（kg·d）為 HTL 單獨(dú)造模的最佳劑量；同理確定 500 mg ／（kg·d）HTL +30 mg ／（kg·d）AOAA 為聯(lián)用組的最佳造模劑量。見表1。聯(lián)用組3 次重復(fù)試驗(yàn)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t =1.157，P ＞ 0.05），HTL 組 3 次重復(fù)試驗(yàn)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 4.976，P ＜ 0.05），重復(fù)性不佳，NTD 發(fā)生率不穩(wěn)定，見表2。因此選擇500 mg／（kg·d）HTL+30 mg ／（kg·d）AOAA 作為 Hcy 致 NTD 的最佳造模劑量。孕11.5 d 正常對(duì)照組胚胎外形完整，頭部前、中、后腦泡飽滿圓潤(rùn)，眼泡發(fā)育正常，神經(jīng)管閉合完全?；闻咛ブ?，中后腦畸形發(fā)生率最高（67.4%），偶見顱面部畸形、無(wú)眼畸形、小眼畸形；發(fā)育遲緩的胚胎表型未見任何畸形，但其頂臀長(zhǎng)度及形態(tài)特征顯著落后于正常發(fā)育胚胎。見圖1。

表1 不同給藥劑量對(duì)小鼠胚胎發(fā)育的影響Tab.1 Influence of dosage of HTL on embryonic development of mice

表2 最佳劑量誘導(dǎo)NTD 的重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Repeat test result of induction of NTD by optimal protocol

圖1 正常及Hcy 所致異常發(fā)育胚胎的表型觀察Fig.1 Phenotype of normal embryo and abnormal embryonic development caused by Hcy

2.2 組織病理學(xué)檢測(cè) 正常對(duì)照組胚胎神經(jīng)管已閉合，發(fā)育良好，管腔規(guī)則，內(nèi)外界膜光滑，神經(jīng)上皮細(xì)胞排列緊密整齊。NTD 胚胎端腦雖形成但管腔不規(guī)則，管壁厚薄不均，內(nèi)外界膜不平整；后腦頂板并未完全融合，周圍間充質(zhì)細(xì)胞分布不均。見圖2。

2.3 孕鼠血液及胚胎腦組織中代謝物的水平 給藥后2 h，孕鼠血液中Hcy 含量顯著升高（F=17.251，P ＜ 0.01），24 h 基本恢復(fù)正常。胚胎腦組織 SAH 含量給藥后 4 h 達(dá)峰值（F = 10.183，P ＜ 0.01），24 h未恢復(fù)正常；SAM 于給藥后2 h 顯著升高（F = 5.562，P ＜ 0.01），24 h 時(shí)略高于正常水平。給藥后 2 h，SAM ／ SAH 比值與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F =0.538，P ＞ 0.05），8 h 時(shí)最低（F = 4.719，P ＜ 0.01）。見圖3。

2.4 胚胎神經(jīng)上皮細(xì)胞的增殖情況 正常對(duì)照組及 NTD 組 EdU 陽(yáng)性細(xì)胞百分比分別為 68%和25%，與對(duì)照組相比，NTD 組胚胎神經(jīng)上皮細(xì)胞增殖受到顯著抑制（t = 8.25，P ＜ 0.05），見圖 4。

圖2 正常對(duì)照組和NTD 組胚胎神經(jīng)管組織病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果（HE 染色）Fig.2 Histopathological examination of neural tubes in normal embryos and embryos with NTD（HE staining）

圖3 孕鼠血液及胚胎腦組織中代謝物的檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Determination results of metabolites in blood of pregnant mice and embryonic brain tissue

續(xù)圖3 孕鼠血液及胚胎腦組織中代謝物的檢測(cè)結(jié)果Fig.3 （Continued）Determination results of metabolites in blood of pregnant mice and embryonic brain tissue

圖4 各組小鼠胚胎神經(jīng)上皮細(xì)胞的增殖情況（× 100）Fig.4 Proliferation of embryonic neuroepithelial cells of mice in various groups（× 100）

2.5 胚胎增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)水平 正常對(duì)照組及NTD 組PCNA 的相對(duì)表達(dá)量分別為0.96 和0.28。與正常對(duì)照組比較，NTD 組PCNA 的表達(dá)量顯著下降（t = 12.47，P ＜ 0.05），見圖 5。表明 NTD 胚胎腦組織細(xì)胞增殖減少。

圖5 Western blot 法檢測(cè)小鼠胚胎腦組織PCNA 蛋白的表達(dá)Fig.5 Western blotting of PCNA expression in embryonic brain tissue of mice

3 討 論

NTD 是一種由遺傳和環(huán)境因素共同作用而產(chǎn)生的嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)疾病，可導(dǎo)致胎兒及圍生兒的死亡。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，生育過(guò)或懷有NTD 胎兒的孕婦其血Hcy水平明顯高于正常值［5，14］，提示母體高 Hcy 可能是NTD 的危險(xiǎn)因素之一。

Hcy 雖不參與蛋白質(zhì)的合成，但可將葉酸、維生素B6及維生素B12等代謝相互聯(lián)系起來(lái)。Hcy 及其氧化產(chǎn)物大部分經(jīng)由二硫鍵與蛋白質(zhì)結(jié)合形成混合二硫化物，其他皆以游離形式存在。結(jié)合及游離Hcy 統(tǒng)稱為血中總Hcy。目前研究認(rèn)為，引起高Hcy 血癥的原因主要有遺傳和營(yíng)養(yǎng)因素，遺傳因素指由Hcy代謝相關(guān)酶的基因突變或缺陷所引起的相關(guān)酶活性的下降而導(dǎo)致的Hcy 蓄積［15］；營(yíng)養(yǎng)因素主要指營(yíng)養(yǎng)不平衡所致的高Hcy，如維生素B6、B12或葉酸缺乏所致的Hcy 升高。另外，吸煙、飲酒、藥物、性別、年齡等因素也會(huì)影響體內(nèi)Hcy 的含量［16-18］。當(dāng)體內(nèi)Hcy 升高后，可經(jīng)氨基酰-tRNA 合成酶（MetRS）編輯矯正形成HTL［19-20］，HTL 的結(jié)構(gòu)較 Hcy 更加穩(wěn)定。蓄積的 Hcy及其衍生物，對(duì)神經(jīng)管的發(fā)育具有毒性作用［21］。

本實(shí)驗(yàn)選擇HTL 與CBS 抑制劑AOAA 聯(lián)合作用進(jìn)行建模，結(jié)果顯示，與HTL 單獨(dú)造模比較，聯(lián)用組NTD 的發(fā)生率更高且更穩(wěn)定，表明血漿Hcy 主要通過(guò)甲硫氨酸循環(huán)相關(guān)途徑引起NTD。孕6.5 ～10.5 d 給藥期覆蓋小鼠神經(jīng)管發(fā)育的整個(gè)過(guò)程，多數(shù)胚胎即使表型正常，其切片神經(jīng)管也可看到不同程度的發(fā)育受損。ELISA 檢測(cè)結(jié)果顯示，NTD 組Hcy顯著升高；SAH 的升高明顯于SAM，導(dǎo)致SAM ／ SAH比例下降。Hcy 可通過(guò)調(diào)節(jié)甲基化發(fā)揮其致病作用［22-24］。SAM 是甲基化反應(yīng)的底物和主要甲基供體，而SAH 則是甲基化反應(yīng)的產(chǎn)物和有效抑制劑，SAM ／ SAH 比值被認(rèn)為是判斷甲基化程度的有用指標(biāo)［25］，其比率的降低與細(xì)胞中低甲基化水平相對(duì)應(yīng)。DNA 甲基化障礙將干擾基因?qū)ι窠?jīng)管閉合的調(diào)節(jié)［5，21］。EdU 是一種胸腺嘧啶核苷類似物，其能代替胸腺嘧啶滲入正在合成的DNA 分子中，因此借由熒光染料與EdU 的特異反應(yīng)可以直接檢測(cè)Hcy 對(duì)神經(jīng)上皮細(xì)胞增殖的影響。PCNA 只存在于正常增殖細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞中，是反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的良好指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，NTD 胚胎細(xì)胞增殖明顯減少，表明Hcy 可通過(guò)抑制細(xì)胞增殖誘導(dǎo)NTD 的發(fā)生。

本實(shí)驗(yàn)以HTL 聯(lián)合AOAA 給藥，成功誘導(dǎo)了NTD 小鼠模型，操作方法簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，致畸率較高，為研究人體內(nèi)Hcy 致NTD 的機(jī)理提供了良好的動(dòng)物模型，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。