陳榮橋，陳漢金，胡均鵬，冼燕萍，楊靜，王斌，朱文信，劉冬虹，侯向昶，劉春生，吳玉鑾，周穎璇

（廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院，廣州市食品安全風險動態(tài)監(jiān)測與預警研究中心，廣州市食品安全檢測技術(shù)重點實驗室，廣東廣州 511447）

椰毒假單胞菌酵米面亞種（Pseudomonas cocovenenanssubsp.farinofermentans，又稱椰毒伯克霍爾德菌[1]）是唐菖蒲伯克霍爾德菌（Burkholderia gladioli）的一種病原型，容易污染谷類發(fā)酵制品（酵米面、玉米淀粉、醋涼粉等）、銀耳、木耳及薯類制品（馬鈴薯粉條、甘薯淀粉、山芋淀粉等）[2]。椰毒假單胞菌酵米面亞種廣泛存在于環(huán)境土壤中，生長繁殖溫度為 30～36 ℃，最佳產(chǎn)毒溫度為 26～28 ℃。米酵菌酸是椰毒假單胞菌酵米面亞種產(chǎn)生的主要外毒素，對人和動物有強烈的毒性作用，美國《食品毒理學》研究表明人體血液中米酵菌酸含量達到200～300 μg/L即可達到致死劑量，人群中毒事件反映經(jīng)口攝入含31 mg米酵菌酸的食物可致死亡，米酵菌酸中毒死亡率高達40%～100%，且米酵菌酸耐熱，一般烹調(diào)方法不能破壞其毒性[3,4]。

米酵菌酸中毒機理是抑制線粒體腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)位酶（ANT）而產(chǎn)生毒性作用[5,6]。發(fā)病潛伏期一般為30 min～12 h，少數(shù)長達1～2 d，中毒早期多為胃腸道刺激，表現(xiàn)為惡心、嘔吐、腹瀉等，病情進展迅速，嚴重發(fā)展為腦、肝、腎多器官功能衰竭[7,8]。由椰毒假單胞菌酵米面亞種污染食物而引發(fā)米酵菌酸中毒事件在我國時有報道，據(jù)不完全統(tǒng)計，自20世紀中期以來，報道的此類事件影響人數(shù)累計超過2000人，死亡人數(shù)超過900人，中毒食物有發(fā)酵變質(zhì)的玉米制品、變質(zhì)銀耳和長時間泡發(fā)的木耳等，涉及省份包括東北三省、四川、云南、浙江、廣西和廣東等[2,9-12]。其中，2018年廣東省河源市和東莞市也接連發(fā)生了因食用過期濕粉條而引起家庭米酵菌酸中毒事件[4,7]。由此可見，椰毒假單胞菌酵米面亞種污染及其毒素中毒事件已經(jīng)危及人們身體健康和生命安全，應(yīng)當提高重視程度。

本研究率先在我國南方部分省份的一些糧食加工制品生產(chǎn)企業(yè)進行調(diào)研并采集了米（大米和碎米）、食用淀粉（玉米淀粉、小麥淀粉和木薯淀粉）樣品，同時也在市場上隨機購買了一些大米樣品，開展椰毒假單胞菌酵米面亞種及其毒素米酵菌酸污染摸查和風險分析研究。首次在4份進口碎米和1份國產(chǎn)碎米中分離鑒定出6株唐菖蒲伯克霍爾德菌，其中4株為產(chǎn)毒素的椰毒假單胞菌酵米面亞種（均源自進口碎米），有1份進口碎米同時分離出1株產(chǎn)毒菌株和1株不產(chǎn)毒菌株，在2份進口碎米中同時檢出米酵菌酸；國產(chǎn)碎米中分離出1株不產(chǎn)毒株。研究表明進口碎米存在椰毒假單胞菌酵米面亞種污染的安全風險。

1 材料與方法

1.1 原料

2020年4～6月，從我國南方部分省份采集米和食用淀粉樣品共129份，其中47份大米、18份碎米和64份淀粉樣品（具體見表1，其中產(chǎn)地信息均為產(chǎn)品包裝標識），樣品采自糧食加工制品生產(chǎn)企業(yè)和廣州本地超市或市場。采樣時，為了避免二次污染，對于小包裝規(guī)格的產(chǎn)品則整包購買，對于大包裝規(guī)格的產(chǎn)品則從新開封的產(chǎn)品中取出適量樣品后即裝入無菌均質(zhì)袋并密閉包裝，每件樣品至少500 g。

1.2 儀器和試劑

VITEK 2 Compact自動微生物快速檢測系統(tǒng)，法國梅里埃公司；生物安全柜，Thermo scientific；高壓滅菌鍋（Hirayama HVE 50）；恒溫培養(yǎng)箱，Binder；天平（PL6001E）；移液槍，transfepette；ACQUITYTM超高效液相色譜儀和Waters XevoTM TQ MS三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，Waters公司。

GVC增菌液、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖半固體瓊脂培養(yǎng)基、卵黃瓊脂培養(yǎng)基和SS瓊脂培養(yǎng)基，均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；VITEK 2 Compact GN鑒定卡，法國梅里埃公司；玻璃紙和旋蒸儀，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；米酵菌酸標準品（1 mg/mL），Sigma Aldrich；甲醇和乙腈（HPLC級），德國Merck公司；甲酸（HPLC級），德國CNW公司；氨水（分析純），廣州化學試劑廠；MAX固相萃取小柱（6 mg/3 mL），Waters公司；超純水（18.2 MΩ·cm），實驗室Milli-Q自制。

1.3 實驗方法

按照GB/T 4789.29-2003《食品衛(wèi)生微生物學檢驗椰毒假單胞菌酵米面亞種檢驗》對所有樣品進行處理和分離菌株[13]，生化鑒定采用VITEK 2 Compact自動微生物快速檢測系統(tǒng)，對經(jīng)VITEK 2 Compact確認的唐菖蒲伯克霍爾德菌，進一步開展毒性試驗，對產(chǎn)毒培養(yǎng)獲得的毒素粗提液采用小白鼠灌胃進行毒力測定，同時測定米酵菌酸。

參考GB 5009.189-2016《食品安全國家標準 食品中米酵菌酸的測定》的前處理方法[14]，建立了檢測米酵菌酸的超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）法，儀器檢出限為0.3 μg/L。UPLC-MS/MS檢測色譜條件：BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為乙腈（A）和0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫程序為：0.0～3.0 min，50%～70% A，3.0～3.6 min，70%～95% A，3.6～5.5 min，95% A，5.5～5.6 min，95%～50% A，5.6～7.0 min，50% A；流速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量5 μL。質(zhì)譜條件：電離方式為電噴霧負離子（ESI-）模式；毛細管電壓2 kV，錐孔電壓10 V；去溶劑溫度500 ℃；去溶劑氣為氮氣，800 L/Hr；錐孔氣為氮氣，50 L/Hr；監(jiān)測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），米酵菌酸和異米酵菌酸的特征離子對（m/z）均為485.3/397.3和485.3/441.3（定量），碰撞能分別為20 eV和10 eV。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本文數(shù)據(jù)使用Origin 9軟件作圖，每項數(shù)據(jù)實驗三次取平均值處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 米和食用淀粉的污染情況

本次實驗共采集129份，發(fā)現(xiàn)大米和碎米存在唐菖蒲伯克霍爾德菌、類鼻疽伯克霍爾德菌和熒光假單胞菌污染（見表1）。其中，在4份進口碎米樣品中檢出5株唐菖蒲伯克霍爾德菌（4株為產(chǎn)毒菌株和1株不產(chǎn)毒菌株），即在 1份進口碎米樣品中同時檢出 1株產(chǎn)毒菌株和1株不產(chǎn)毒菌株；1份國產(chǎn)碎米中檢出1株不產(chǎn)毒菌株。

表1 米和食用淀粉樣品中細菌污染情況Table 1 Contamination of various samples of Bacteria

表2 疑似菌落在PDA平板和卵黃瓊脂平板上形態(tài)特征[13]Table 2 Characteristics of suspected colonies on PDA plate and egg yolk agar plate

2.2 樣品在不同分離平板上疑似菌落的形態(tài)特征及生化特性

2.2.1 在 PDA平板和卵黃瓊脂平板上的菌落特征

樣品加入GVC增菌培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h后劃線分離培養(yǎng)[13]，在 13個樣品中發(fā)現(xiàn)疑似唐菖蒲伯克霍爾德菌株14株，其中在1個樣品中發(fā)現(xiàn)了2株。14株疑似菌落在PDA平板和卵黃平板上呈現(xiàn)出5種形態(tài)特征，如表2、圖1和圖2所示。5種菌落形態(tài)特征與GB/T 4789.29-2003的菌落特征描述較相似[13]。

圖1 PDA平板上菌落特征Fig.1 Characteristics of colony on PDA plate

圖2 卵黃瓊脂平板上菌落特征Fig.2 Characteristics of colony on egg yolk agar plate

2.2.2 疑似菌落的生化特性

將上述5種類型菌落在卵黃瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后，挑取典型單一菌落接種PDA平板培養(yǎng)24 h，然后用VITEK 2 Compact生化鑒定分析，具體的鑒定結(jié)果見表3。

表3 類型1～5的生化反應(yīng)結(jié)果Table 3 Biochemical reaction results of type 1～5

注：當生化反應(yīng)結(jié)果稍低于閾值時顯示為弱陰性（-），當生化反應(yīng)結(jié)果稍高于閾值時顯示為弱陽性（+）。

鑒定結(jié)果表明，3號和4號菌株為唐菖蒲伯克霍爾德菌，1號菌株為類鼻疽伯克霍爾德菌，2號菌株為熒光假單胞菌，5號菌株未能鑒定出細菌種類。從生化反應(yīng)特性上看，類鼻疽伯克霍爾德菌和唐菖蒲伯克霍爾德同屬于伯克霍爾德菌屬，故兩者的生化差異不大，主要區(qū)別在于唐菖蒲伯克霍爾德菌可利用側(cè)金盞花醇(ADO)，類鼻疽伯克霍爾德菌可利用D-纖維二糖(dCEL)、D-麥芽糖(dMAL)、蔗糖(SAC)以及 D-海藻糖(dTRE)；熒光假單胞菌在生化反應(yīng)上大部分和唐菖蒲伯克霍爾德菌類似，主要區(qū)別在于D-甘露醇(dMAN)、L-脯氨酸芳胺酶(ProA)和D-山梨醇(dSOR)；未能鑒定的菌株生化反應(yīng)與唐菖蒲伯克霍爾德菌的也大部分相似，也有可能是伯克霍爾德菌屬中的一種。

2.3 唐菖蒲伯克霍爾德菌的毒性試驗

2.3.1 毒力測試

將鑒定為唐菖蒲伯克霍爾德菌的6株菌株，分別編號為S1、S2、S3、S4、S5和S6，其中S2和S3為同 1份碎米樣品分離出的2株菌株（見表 4）。按照GB/T 4789.29-2003進行產(chǎn)毒培養(yǎng)，提取粗毒素，分別對體重18～20 g的小白鼠經(jīng)口灌胃[13,15,16]。菌株S3和S6的粗毒素灌胃的小白鼠均沒有死亡，菌株S1、S2、S4和S5的粗毒素灌胃的小白鼠均在24 h內(nèi)死亡，表明菌株S3和S6為不產(chǎn)毒株，菌株S1、S2、S4和S5為產(chǎn)毒株。

表4 S1-S6培養(yǎng)物中米酵菌酸的檢測結(jié)果Table 4 Detection results of Bongkrekic acid in S1-S6 culture

2.3.2 培養(yǎng)物中米酵菌酸的測定

將6株唐菖蒲伯克霍爾德菌的產(chǎn)毒培養(yǎng)物檢測米酵菌酸（見表4），其中S1、S2、S4和S5的米酵菌酸含量在162.60～255.90 mg/kg，證實這4株為產(chǎn)毒株；S3和S6的培養(yǎng)物未檢出米酵菌酸，證實為不產(chǎn)毒株。米酵菌酸標準溶液（a）和菌株S1粗毒素（b）的提取離子色譜圖見圖 3，可見，椰毒假單胞菌酵米面亞種產(chǎn)的毒素包括米酵菌酸和異米酵菌酸，有文獻報導異米酵菌酸的毒性約為米酵菌酸的1/2～1/4[17,18]，由于尚無異米酵菌酸標準品售賣，本研究將（米酵菌酸峰面積+異米酵菌酸峰面積）與米酵菌酸標準品峰面積比較定量，且經(jīng)實驗驗證，與將米酵菌酸和異米酵菌酸合成單峰的定量結(jié)果一致。

2.4 米和食用淀粉中米酵菌酸的測定

圖3 米酵菌酸標準溶液（a）、椰毒假單胞菌毒素提取物（b）、陽性大米樣品（c和d）、陽性碎米樣品（e和f）的提取離子色譜圖Fig.3 Extraction ion chromatograms of bongkrekic acid standard solution (a), toxin extract of Pseudomonas cocovenenans subsp. farinofermentans (b), positive rice samples(c and d), positive broken rice samples (e and f)

129份米和食用淀粉樣品中，有2份大米和2份碎米（表4中碎米2和碎米4）檢出米酵菌酸，含量分別為2.70、0.70、2.40和1.00 μg/kg。在檢出米酵菌酸的2份大米中并未檢出椰毒假單胞菌酵米面亞種，可能是由于菌在大米中分布極不均勻，且樣品含有大量霉菌，霉菌與椰毒假單胞菌酵米面亞種生長條件基本一致，但是霉菌生長速度快，PDA平板培養(yǎng)時霉菌快速生長并基本鋪滿整個平板，難以辨別椰毒假單胞菌酵米面亞種菌落；檢出米酵菌酸的2份碎米同時也檢出了椰毒假單胞菌酵米面亞種，米酵菌酸含量雖然很低，但是表明菌已經(jīng)在產(chǎn)毒，存在安全風險。

陽性大米（c、d）和陽性碎米（e、f）的提取離子色譜圖見圖 3，均包含了米酵菌酸和異米酵菌酸 2個峰。

3 結(jié)論

本研究主要針對食品工業(yè)中常用的米和食用淀粉樣品進行椰毒假單胞菌酵米面亞種污染風險摸查。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，首次在4份進口碎米和1份國產(chǎn)碎米中分離鑒定出6株唐菖蒲伯克霍爾德菌，在碎米樣品中的檢出率為27.78%（5/18）；經(jīng)過毒性試驗，其中4株證實為產(chǎn)毒素米酵菌酸的椰毒假單胞菌酵米面亞種，均源自4份進口碎米（其中2份碎米檢出米酵菌酸），占進口碎米樣品的 23.53%（4/17）。試驗研究表明進口碎米存在椰毒假單胞菌酵米面亞種污染風險。碎米是一些糧食加工制品生產(chǎn)企業(yè)的原料，如果存放不當，尤其是濕熱季節(jié)，容易為椰毒假單胞菌酵米面亞種的生長繁殖和產(chǎn)毒素提供條件，而目前相關(guān)標準和規(guī)范并沒有將該菌納入碎米安全指標進行監(jiān)測，企業(yè)在采購使用碎米時對此風險也處于未認知狀態(tài)，這有可能導致源頭污染風險傳遞至下游各個環(huán)節(jié)，因此，建議監(jiān)管部門打好相關(guān)防控組合拳，企業(yè)加強相關(guān)防控，共同有效預防由該菌引起的食物中毒事件發(fā)生。