方雙琪，張帥，陳艷，張小軍,3，梅光明,3

（1.浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江舟山 316021）（2.浙江省海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院浙江省海洋生物醫(yī)用制品工程技術(shù)研究中心，浙江舟山 316021）（3.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316021）

抗生素是一種通過(guò)干擾細(xì)胞發(fā)育功能而達(dá)到抑菌或殺菌效果的化合物[1]，在水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中，抗生素曾被當(dāng)做漁藥和飼料添加劑使用，具有防治細(xì)菌性疾病、提高飼料利用率及促進(jìn)生長(zhǎng)等一系列作用[2]。近年來(lái)，由于抗生素不合理使用導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性不斷增強(qiáng)以及水產(chǎn)品中的藥物殘留問(wèn)題日益嚴(yán)重，抗生素逐漸被限量或禁止在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用。但現(xiàn)代化高密度、集約化的工廠化養(yǎng)殖使得水產(chǎn)品病害情況日益多發(fā)，為了挽回經(jīng)濟(jì)損失，化學(xué)抗生素類藥物仍被一些養(yǎng)殖戶非法使用，甚至多種抗生素聯(lián)合使用來(lái)達(dá)到更好的治療效果。因作用機(jī)制的不同，抗生素類藥物聯(lián)合使用時(shí)經(jīng)常產(chǎn)生藥物相互作用，導(dǎo)致藥效的增強(qiáng)或降低，影響藥物的代謝甚至引起毒副作用[3]，因此，研究抗生素之間聯(lián)合使用時(shí)藥物在機(jī)體內(nèi)的消除過(guò)程及影響很有必要。

呋喃唑酮（Furazolidone）是一種具有5-硝基呋喃環(huán)基本結(jié)構(gòu)的廣譜抗菌藥物[4],曾因高效的抗菌性和相對(duì)低廉的成本被廣泛用作獸藥或飼料添加劑以治療人工養(yǎng)殖動(dòng)物如魚、蝦、豬、雞等的細(xì)菌性疾病。眾多研究表明，呋喃唑酮在機(jī)體內(nèi)幾個(gè)小時(shí)便能全部代謝結(jié)束，但其代謝產(chǎn)物3-氨基-2-惡唑烷酮（AOZ）卻能以蛋白結(jié)合態(tài)的形式在體內(nèi)穩(wěn)定而持久的存在，具有潛在的三致作用（致畸、致癌、致突變）[5]。因此，為了確保動(dòng)物源性食品安全并防止呋喃唑酮危害人類健康，許多國(guó)家逐漸禁止在禽畜及水生養(yǎng)殖動(dòng)物中使用呋喃唑酮[6]。目前，對(duì)于呋喃唑酮的研究通常集中其原藥和代謝物在水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)的代謝上，但是關(guān)于抗生素藥物對(duì)呋喃唑酮代謝物殘留消除影響的報(bào)道仍然少見。本實(shí)驗(yàn)選擇磺胺間甲氧嘧啶（Sulfamonomethoxine）、土霉素（Oxytetracycline）和恩諾沙星（Enrofloxacin）三種常見的抗生素類漁藥與呋喃唑酮聯(lián)合使用，以鯽魚為研究對(duì)象，模擬網(wǎng)箱養(yǎng)殖，探討這三種抗生素類漁藥對(duì)呋喃唑酮代謝物在鯽魚體內(nèi)的殘留消除的影響，為禁用藥物的研究提供更多的參考，進(jìn)而推動(dòng)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展，保障消費(fèi)者身體健康。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)中使用的健康鯽魚購(gòu)于浙江省舟山市臨城老碶農(nóng)貿(mào)菜場(chǎng)，體重150±10 g，體長(zhǎng)16±2 cm。經(jīng)隨機(jī)抽樣檢測(cè)，鯽魚體內(nèi)不含呋喃唑酮原藥及其代謝物。選用經(jīng)氧氣泵24 h曝氣去氯處理的自來(lái)水作為實(shí)驗(yàn)用水，水溫22±1 ℃，pH=7。實(shí)驗(yàn)前將鯽魚放在帶有增氧泵的橘黃色聚乙烯養(yǎng)魚缸中暫養(yǎng)3 d，使其適應(yīng)養(yǎng)殖環(huán)境，挑選個(gè)頭均勻，外觀健康的鯽魚進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥品與試劑

呋喃唑酮，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%，由浙江省海洋水產(chǎn)研究所提供；呋喃唑酮代謝物標(biāo)準(zhǔn)品（AOZ），質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.80%，美國(guó)Sigma公司；呋喃唑酮內(nèi)標(biāo)AOZ-D4，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.80%美國(guó) Sigma公司；乙酸銨、2-硝基苯甲醛、甲醇、甲酸為色譜純，乙酸乙酯、鹽酸、二甲基亞砜、磷酸氫二鉀為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水為超純水。

1.3 儀器與設(shè)備

ACQUITY型高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司；Quattro Preemier XE型串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，美國(guó)Waters公司；LPD2550型多管渦旋混合儀，萊普特科學(xué)儀器有限公司；AvantiJXN-30型貝克曼離心機(jī)，庫(kù)特爾商貿(mào)有限公司；ZD-85型恒溫振蕩器，常州國(guó)華電器有限公司；Nitrogen Evaporator 112型氮吹儀，美國(guó)Organomatio公司；微孔濾膜（0.22 μm），津騰。

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

鯽魚暫養(yǎng)3 d后，按每組15～20尾的數(shù)量隨機(jī)分為5組（A0～A4），分別飼養(yǎng)在150 L聚乙烯養(yǎng)魚箱中。A0為空白對(duì)照組，A1為呋喃唑酮單獨(dú)給藥對(duì)照組，A2為土霉素-呋喃唑酮聯(lián)合給藥組，A3為恩諾沙星-呋喃唑酮聯(lián)合給藥組；A4為磺胺間甲氧嘧啶-呋喃唑酮聯(lián)合給藥組。實(shí)驗(yàn)組A1-A4均采用藥浴方式給藥。實(shí)驗(yàn)前呋喃唑酮、土霉素、恩諾沙星、磺胺間甲氧嘧啶分別用乙腈、鹽酸、醋酸、氫氧化鈉助溶后再潑灑到養(yǎng)魚箱中，且每個(gè)養(yǎng)魚箱水體中的單個(gè)藥物質(zhì)量濃度均為 100 μg/kg。

為避免呋喃唑酮見光分解，藥浴在晚上進(jìn)行，藥浴時(shí)長(zhǎng)均為12 h，水溫22±1 ℃。藥浴結(jié)束后徹底換清水，且分別于藥浴結(jié)束后的0、5、10、48、96 h時(shí)間點(diǎn)在實(shí)驗(yàn)組中隨機(jī)選取3條魚，作為3個(gè)平行樣品。將鯽魚解剖，取其背部肌肉、腎臟、肝臟，置于-18 ℃冰箱保存，待HPLC-MS/MS分析。

1.5 鯽魚體內(nèi)AOZ的提取與凈化

取肌肉樣品2.0±0.10 g，肝臟、腎臟各1±0.10 g于50 mL離心管中，加入100 ng/mL的內(nèi)標(biāo)工作液0.10 mL，渦旋混合50 s后加入5 mL 0.20 mol/L鹽酸溶液和0.15 mL 0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛溶液，放入氣浴振蕩器37 ℃避光衍生16 h。

取出離心管放置冷卻到室溫，加入1 moL/L磷酸氫二鉀溶液4.5～5 mL，調(diào)節(jié)pH至7.0～7.5；加入8 mL乙酸乙酯提取，渦旋振蕩5 min，再6500 r/min 6 ℃低溫離心6 min；取上清液40 ℃下氮?dú)獯蹈?。肌肉殘?jiān)?.0 mL甲醇水溶液（1:9）溶解，振蕩后經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾至進(jìn)樣瓶，待測(cè)；內(nèi)臟殘?jiān)尤?1 mL正己烷溶解油脂后加入甲醇水，振蕩20 s，4500 r/min 4 ℃再次低溫離心5 min，取下層溶液過(guò)濾膜，待測(cè)。

1.6 檢測(cè)方法

1.6.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC?BEHC18柱（2.1 mm×50 mm×1.7 mm）；樣品室溫度10 ℃；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量5 μL；流速0.2 mL/min；流動(dòng)相A為包含0.1%甲酸和2 mmol/L乙酸銨的溶液，B為甲醇，梯度洗脫程序見表1。

表1 流動(dòng)性梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program of the mobile phase

1.6.2 質(zhì)譜條件

離子化模式：電噴霧電離源（ESI+）；離子源溫度：120 ℃；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），多反應(yīng)質(zhì)譜監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)條件（例如母離子，產(chǎn)物離子，錐電壓和碰撞能量）列于表2。

表2 MRM模式下質(zhì)譜測(cè)定的特征離子Table 2 Characteristic ions of mass spectrum determination in MRM mode

1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別準(zhǔn)確移取10 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液0.10、0.5 mL，100 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液0.10、0.25、0.50 mL和1 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液0.10 mL于6個(gè)離心管中，除不加樣品外，按1.5步驟操作，步驟1.6的儀器條件進(jìn)行測(cè)定。采用內(nèi)標(biāo)法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以分析物與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值為縱坐標(biāo)，分析物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)R。

1.8 回收率與精密度

將呋喃唑酮代謝物標(biāo)準(zhǔn)品添加到鯽魚的空白肌肉，肝和腎樣品中以制備3個(gè)濃度樣品，分別為1.0、5.0、10.0 μg/kg。按照1.5.1進(jìn)行樣品處理后，步驟1.6進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)添加水平做三個(gè)平行，每個(gè)平行分別在一天內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣3次。

1.9 數(shù)據(jù)處理

藥時(shí)曲線通過(guò)Origin 8.5進(jìn)行繪制。AOZ的平均消除速率v計(jì)算公式參照劉書貴等[7]，公式為：

其中：Mmax、Mmin為消除過(guò)程中 AOZ殘留質(zhì)量濃度的最大值和最小值；t1、t2為藥物濃度達(dá)到最大和最小值所需要的時(shí)間。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與靈敏度

AOZ標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生化后測(cè)定得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線表明：AOZ在1.0～100.0 ng/mL濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為 0.9999，線性方程為 y=0.36078x+0.06546

最低檢測(cè)限為三倍基線噪音的藥物質(zhì)量比，定量限為十倍基線噪音藥物質(zhì)量濃度。該測(cè)定方法對(duì)AOZ的檢測(cè)限（S/N＞3）為0.25 μg/kg，定量限（S/N＞10）為 0.5 μg/kg。

圖1 單獨(dú)和聯(lián)合給藥下鯽魚體內(nèi)各組織中AOZ的藥時(shí)曲線Fig.1 The drug-time curve of AOZ in various tissues of crucian carp under single and combined administration

2.2 回收率與精密度

本試驗(yàn)條件下，以1.0、5.0、10.0 μg/kg為三個(gè)添加水平，每個(gè)水平測(cè)定三次，測(cè)定得到 AOZ在鯽魚各組織中的回收率為 105%～108.60%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.60%～7.80%。

2.3 給藥劑量及方式

隨著水產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管力度的不斷加大，各類禁用或限量抗生素均被列在水產(chǎn)品農(nóng)獸藥殘留檢測(cè)名單中，即使養(yǎng)殖戶違法使用這些化學(xué)抗生素也不再高濃度給藥，為了切合實(shí)際養(yǎng)殖情況，本實(shí)驗(yàn)選擇 100 μg/kg進(jìn)行低劑量給藥。同時(shí)為了避免注射給藥造成魚體損傷以及拌飼投喂個(gè)體受藥不均勻的情況，試驗(yàn)采用藥浴給藥的方式，模擬網(wǎng)箱養(yǎng)殖，藥浴給藥全程在水箱中進(jìn)行，魚體呼吸沒有障礙，身體刺激小，每條魚都能在健康狀態(tài)下均勻給藥，且在一定范圍的藥浴時(shí)間內(nèi)，魚體藥物殘留量與藥浴時(shí)間呈正相關(guān)。

2.4 AOZ在鯽魚組織中的分布與消除規(guī)律

鯽魚在每種藥物濃度100 μg/kg的水體中連續(xù)藥浴12 h后，對(duì)照組（A1）和三組聯(lián)合給藥組（A2～A4）鯽魚體內(nèi)AOZ的分布和殘留情況如圖1所示。從圖1中可以看出，藥浴結(jié)束0 h后，對(duì)照組和聯(lián)合給藥組鯽魚體內(nèi)腎臟、肝臟、肌肉組織中的 AOZ就已經(jīng)被檢測(cè)出來(lái)，且在消除時(shí)間0～96 h內(nèi)，各給藥組鯽魚體內(nèi)三種組織中 AOZ的殘留量呈現(xiàn)相似的變化趨勢(shì)。在消除實(shí)驗(yàn)的前期階段，給藥組中的 AOZ在鯽魚腎臟、肝臟、肌肉中的含量隨著消除時(shí)間的增加都表現(xiàn)出波動(dòng)下降的趨勢(shì)；消除48 h之后三種組織中的AOZ的質(zhì)量濃度開始緩慢衰減；停藥96 h后，對(duì)照組及聯(lián)合給藥組鯽魚肝臟、腎臟和肌肉中仍然有大量 AOZ殘留，分別為6.62、8.95、1.32 μg/kg（A1組）；9.80、13.28、2.16 μg/kg（A2組）；11.8、12.30、2.94 μg/kg（A3組）；14.90、8.21、5.80 μg/kg（A4組）。且無(wú)論是對(duì)照組還是聯(lián)合給藥組中，鯽魚各組織中的最大殘留濃度均表現(xiàn)為腎臟＞肝臟＞肌肉。

2.5 三種抗生素對(duì)鯽魚體內(nèi)AOZ殘留量的影響

表3為消除過(guò)程中單獨(dú)和聯(lián)合給藥下AOZ在鯽魚各組織中的最大殘留濃度（Cmax）及對(duì)應(yīng)時(shí)間（Tmax）。由表3可知，藥浴結(jié)束后0 h，呋喃唑酮對(duì)照組（A1）鯽魚腎臟、肝臟、肌肉中 AOZ的含量便達(dá)到最大值，分別為 88.87、59.20、14.91 μg/kg。而土霉素-呋喃唑酮組（A2）鯽魚腎臟、肝臟、肌肉中AOZ的含量在5 h達(dá)到最大值分別為165.40、125.29、28.69 μg/kg，大約相當(dāng)于對(duì)照組的 1.86、2.11、1.92倍；恩諾沙星-呋喃唑酮組（A3）鯽魚腎臟、肝臟、肌肉中AOZ的含量分別在0、10和10 h達(dá)到最大值，分別為46.70、41.64、9.69 μg/kg，僅約為對(duì)照組的 0.53、0.70、0.65倍?；前烽g甲氧嘧啶-呋喃唑酮組（A4）鯽魚腎臟、肝臟、肌肉中的AOZ含量也在0h達(dá)到最大值，分別為 90.20、70.95、18.30 μg/kg，與對(duì)照組相比也有升高但差異不大。

研究表明，聯(lián)合用藥引起的藥物相互作用會(huì)表現(xiàn)為胃腸道吸收的相互作用、競(jìng)爭(zhēng)血漿蛋白結(jié)合點(diǎn)、誘導(dǎo)或抑制肝藥酶[8]、影響腎臟排泄等[9]，從而導(dǎo)致藥物或其代謝物在人體組織中殘留濃度和代謝的變化。例如青霉素與丙磺舒聯(lián)合使用后，丙磺舒為酸性藥物，可以抑制腎小管對(duì)青霉素的分泌從而使得青霉素的排泄減少、血藥濃度增加[10]；紅霉素和地高辛合用時(shí)，紅霉素會(huì)改變胃腸道的菌群，增加地高辛的血藥濃度并提高其生物利用率[11]。本實(shí)驗(yàn)下，四種藥物經(jīng)藥浴方式對(duì)鯽魚進(jìn)行給藥，藥物經(jīng)鯽魚皮膚和鰓吸收進(jìn)入體循環(huán)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，土霉素-呋喃唑酮組及恩諾沙星-呋喃唑酮組中AOZ在鯽魚組織中達(dá)峰時(shí)間與對(duì)照組相比有明顯不同，這可能是因?yàn)橥撩顾亍⒍髦Z沙星一定程度上延緩了鯽魚體內(nèi) AOZ的代謝；此外土霉素-呋喃唑酮組中達(dá)峰濃度與對(duì)照組相比顯著增加，而恩諾沙星-呋喃唑酮組明顯降低，說(shuō)明這兩種抗生素影響了呋喃唑酮原藥在鯽魚體內(nèi)的吸收及分布，改變了呋喃唑酮代謝物 AOZ在鯽魚組織中的濃度；但土霉素、恩諾沙星具體通過(guò)哪種作用方式影響鯽魚體內(nèi)AOZ的殘留濃度暫不明確，還需進(jìn)一步研究。

表3 0～96 h內(nèi)鯽魚組織中AOZ的最大殘留濃度及對(duì)應(yīng)時(shí)間Table 3 The maximum residual concentration and corresponding time of AOZ in crucian carp tissues within 0～96hours

2.6 三種抗生素對(duì)鯽魚體內(nèi)AOZ消除的影響

表4為鯽魚腎臟、肝臟、肌肉中AOZ的平均消除速率。表4可知，不同抗生素參與下AOZ在鯽魚體內(nèi)的平均消除速率也存在顯著差異。其中對(duì)照組（A1）鯽魚腎臟、肝臟、肌肉中 AOZ的平均消除速率為0.86、0.52、0.14 μg/(kg·h)；與對(duì)照組相比，恩諾沙星-呋喃唑酮組（A3）與磺胺間甲氧嘧啶-呋喃唑酮組(A4)鯽魚腎臟、肝臟、肌肉中AOZ的平均消除速率均有不同程度的降低，分別為 0.36、0.31、0.03 μg/(kg·h)和 0.78、0.41、0.13 μg/(kg·h)，這可能是因?yàn)槎髦Z沙星及磺胺間甲氧嘧啶對(duì)鯽魚肝臟的肝微粒體酶活性產(chǎn)生了抑制作用，且兩種藥物對(duì) AOZ消除的抑制能力不一樣。肝微粒體酶是藥物代謝過(guò)程中的催化劑[12]，它的主要成分是細(xì)胞色素 P450（CYP450），李國(guó)昌等[13]表明，CYP450酶在肝臟中的活性對(duì)藥物代謝起決定性作用，與藥物的清除率呈正相關(guān)。賈嫻等[14]分別單次及連續(xù)三天對(duì)鯽魚腹腔注射恩諾沙星 3 mg/kg、30 mg/kg，然后在給藥24 h后對(duì)鯽魚體內(nèi)氨基比林 N-脫甲基酶（APD）、紅霉素 N-脫甲基酶（ERND）、7-乙氧基異吩噁唑酮-O-脫乙基酶（EROD）、7-乙氧基香豆素-O-脫乙基酶（ECOD）及苯胺-4-羥化酶（AH）進(jìn)行活性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組中這五組種肝藥酶活性明顯下降，恩諾沙星對(duì)鯽魚體內(nèi)的肝微粒體酶具有抑制作用；丁同貴等[15]也指出磺胺類藥物能夠抑制肝藥酶活性，這與本實(shí)驗(yàn)推論一致。

此外，與其他兩種抗生素參與下 AOZ消除速率的變化不同，土霉素—呋喃唑酮（A2）組鯽魚腎臟、肝臟、肌肉中 AOZ的平均消除速率與對(duì)照組相比明顯升高，分別為1.71、1.17、0.31 μg/(kg·h)，這可能與其殘留濃度的升高有關(guān)，但據(jù)臨床研究報(bào)道，土霉素對(duì)肝臟的肝藥酶也有抑制作用[16]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致，可能是因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)的給藥濃度太低，土霉素未對(duì)鯽魚的肝藥酶的活性產(chǎn)生影響。

表4 鯽魚組織中AOZ的平均消除速率Table 4 The average elimination rate of AOZ in crucian carp tissue

3 結(jié)論

綜上所述，AOZ在鯽魚體內(nèi)難消除，且三種抗生素分別與呋喃唑酮聯(lián)合用藥下，AOZ在鯽魚體內(nèi)表現(xiàn)不同的殘留消除規(guī)律，其中，土霉素能夠提高 AOZ在鯽魚體內(nèi)殘留濃度；恩諾沙星雖然能減少 AOZ在鯽魚體內(nèi)的殘留濃度卻使其代謝變慢，AOZ在鯽魚體內(nèi)的殘留時(shí)間延長(zhǎng)；磺胺間甲基嘧啶對(duì) AOZ的殘留量和平均消除速率分別有增加和延緩的作用但影響不大。本實(shí)驗(yàn)的聯(lián)合用藥是在低濃度下進(jìn)行，三種抗生素在高濃度下與呋喃唑酮聯(lián)合使用對(duì) AOZ殘留消除的影響還有待探討。本研究為水產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管和漁藥殘留研究提供了理論基礎(chǔ)。